Способ диагностики хромосомного мозаицизма у пациенток с нарушением формирования и функционирования репродуктивной системы по вагинальному эпителию методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с ДНК-зондами, комплементарными центромерным последовательностям половых хромосом Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине, в частности к акушерству и гинекологии, и может найти применение для диагностики хромосомного мозаицизма у пациенток с нарушением формирования и функционирования репродуктивной системы. Исследование выполнено в рамках государственного задания 17-А21: "Разработка инновационных подходов к прогнозированию и доклинической диагностике преждевременной недостаточности яичников на основе выявления молекулярно-генетических и клинико-гормональных маркеров у представительниц российской популяции в различные возрастные периоды".

Способ позволяет выявить хромосомный мозаицизм у пациенток с нарушением формирования и функционирования репродуктивной системы в клетках вагинального эпителия методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с ДНК-зондами, комплементарными центромерным последовательностям половых хромосом.

Вопрос о нарушении половой дифференцировки возникает прежде всего при рождении ребенка с промежуточным бисексуальным строением наружных половых органов. Однако анатомически правильное женское или мужское строение гениталий новорожденного не исключает патологии, которая может проявляться позже задержкой полового развития или преждевременным наступлением пубертатного периода, гетеросексуальными вторичными половыми признаками, симптомами гипогонадизма, аменореей, бесплодием [1, 2]. Современные представления о процессах половой дифференциации, об этиологическом многообразии отдельных синдромов с нарушениями полового развития во многом обязаны недавним достижениям молекулярной генетики. Особое значение имели открытие в 1990 г. тестикулодетерминирующего фактора, названного областью Y-хромосомы, определяющей пол (sex-determining region Y chromosome, SRY), выделение множества генов аутосом и Х-хромосомы, кодирующих ферменты стероидогенеза, гормональные рецепторы и так далее. В определенной мере разъяснилась генетическая основа нормального полового развития.

С клинических позиций понятие «половая дифференцировка» включает три составляющие: генетический, гонадный и генитальный пол. Генетический пол складывается при оплодотворении слиянием двух гаплоидных гамет с организацией диплоидной зиготы 46,ХХ женского либо 46,XY мужского кариотипа. Формирование гонадного пола происходит с участием генетического материала половых хромосом: под детерминирующим влиянием генов локуса SRY первичных половых клеток, мигрировавших в зачаток гонады, эпителиальные клетки полового валика независимо с каждой стороны дифференцируются в клетки Сертоли, мезенхимные в клетки Лейдига, т.е. образуются яички. В отсутствие Y-хромосомы, но с обязательным участием генетического материала обеих X-хромосом осуществляется образование яичников. Гормональной спецификой дифференцированной половой железы определяется строение внутренних и наружных половых органов, т.е. генитальный пол эмбриона.

Уникальный генетический материал диплоидного набора хромосом, сложившегося при оплодотворении, реализуется во взаимодействиях со средой совокупностью уникальных наследственных признаков, т.е. фенотипом. В зависимости от масштаба дефекта этиологическое разнообразие нарушений половой дифференцировки укладывается в рамки хромосомных, генных и многофакторных заболеваний [1]. Хотя набор половых хромосом в большинстве случаев определяет генетический пол, но не всегда тождественен ему и составляет хромосомный уровень пола [1,2]. Это обусловлено тем, что гены, контролирующие дифференцировку пола и развитие органов половой системы, располагаются как в гоносомах, так и в различных аутосомах. Их состояние (наличие или отсутствие мутаций), количество и экспрессия определяют генный уровень пола. Помимо хромосомных и генных мутаций, генетическими причинами аномалий формирования пола могут быть эпигенетические нарушения. Таким образом, генетический пол состоит из 3 уровней: хромосомного, генного и эпигенетического.

Численные аномалии половых хромосом приводят к широкому спектру нарушений формирования и функционирования репродуктивной системы. Клинические проявления при численных аномалиях половых хромосом зависят от кариотипа преобладающей линии клеток и наличия в его составе хромосомы Y. Так, с мозаичным кариотипом 45,X/46,XY описаны: больные мужского пола с гипоспадией; больные с двойственным строением гениталий; больные с фенотипом синдрома Тернера; больные с женским фенотипом и диагнозом преждевременной недостаточности яичников, у которых мозаицизм был ограничен тканью гонад [2]. На выборках пациентов с первичной и вторичной аменореей показано, что в 8,3-50% случаев заболевание обусловлено аномалиями половых хромосом, причем их частота выше у больных подросткового возраста и при первичной аменорее [3,4,5,6]

В приведенных исследованиях диагноз был установлен по данным кариотипирования лимфоцитов периферической крови. Подавляющее большинство аномалий являются вариантами синдрома Тернера. При дополнительном обследовании больных с ПНЯ и нормальным женским кариотипом методом интерфазного FISH лимфоцитов периферической крови в исследовании Bouali и соавт.были выявлены 10.71% больных с высоким по отношению к контрольной выборке соответствующего возраста уровнем мозаицизма по моносомии X. В ряде исследований показано, что мозаичный вариант синдрома Тернера с кариотипом 45,Х/46,ХХ коррелирует с наличием спонтанного менархе и более благоприятными репродуктивными исходами, а также с меньшей частотой врожденных пороков развития и эндокринных нарушений [7] По мнению Castronovo и соавт., уровень мозаицизма по эуплоидной линии 46,ХХ выше 10% в образце буккального эпителия является предиктором спонтанного менархе [8].

Таким образом, знание кариотипа позволяет персонифицировать тактику ведения конкретного больного и дать более точный прогноз репродуктивной функции.

По данным Опариной Н.В, проанализировавшей межтканевую вариабельность клеточных линий с различным кариотипом при синдроме Тернера, по результатам комплексного цитогенетического обследования кариотип 45,Х обнаружен у 25% пациентов, у 75% - истинный межтканевой мозаицизм с различными вариантами анеуплоидной линии(й) в лимфоцитах периферической крови и буккальном эпителии. У 65% пациенток выявлено совпадение по представленности и соотношению клеточных линий в двух исследованных тканях, у 35% - межтканевая вариабельность кариотипа. При FISH-анализе наличие Y-хромосомы выявлено в 5% лимфоцитов и в 32% клеток буккального эпителия. Автор рекомендует комплексную цитогенетическую диагностику (стандартное цитогенетическое исследование+FISH) с исследованием тканей разного эмбрионального происхождения с целью выявления мозаицизма по причине высокой частоты (35%) выявления межтканевой вариабельности гоносомного мозаицизма для корректной постановки диагноза и выбора адекватного лечения [9].

Колотий А.Д. и соавторы ретроспективно проанализировали 96 девочек с синдромом Тернера, у которых диагноз был подтвержден цитогенетическим и молекулярно-цитогенетическими (FISH и МСВ - многоцветный бэндинг хромосом) методами. Моносомные формы синдрома Тернера с кариотипом 45,Х были обнаружены у 27 девочек (28,1%). Остальные случаи были представлены мозаичными формами синдрома, а также структурными изменениями гоносом, включая мозаичные кариотипы 45,Х/46,ХХ или 45,Х/47,ХХХ/46,ХХ (37,5%), изохромосомами X по длинному плечу (10,5%), маркерными и кольцевыми хромосомами X (14,6%). Материал хромосомы Y в кариотипе был выявлен в 7,3% случаев; делеции короткого плеча хромосомы X - в 2,1% случаев. Мозаичные формы кариотипа были выявлены в 67,7%. Анализ корреляции генотип-фенотип при мозаичных формах показал, что классический фенотип синдрома Тернера проявлялся у пациенток как при большой доле аномальных клеток, так и при доле, составлявшей 5-10%, что может свидетельствовать о возможном наличии тканевого мозаицизма [10].

По данным Жахур Н.А. и соавт., изучивших половые хромосомы в интерфазных ядрах клеток гонад у больных с преждевременной недостаточностью яичников (ПНЯ) и дисгенезией гонад, у 72,4% (21/29) больных с ПНЯ с нормальным кариотипом в лимфоцитах, у 1 (50%) пациентки с ПНЯ и нарушениями кариотипа (47,XXY и 45,Х/46,ХХ) по лимфоцитам и у всех 3 больных с дисгенезией гонад обнаружены различные виды гонадного мозаицизма по половым хромосомам. Среди 10 контрольных яичников тканевой мозаицизм обнаружен только в 2 (20%) случаях, что статистически значимо меньше, чем у больных с различными нарушениями функций половых желез (р<0,003). У 1 (3,4%) пациентки с ПНЯ и у 2 (66,6%) больных с дисгенезией гонад в ткани яичников обнаружено от 2 до 50% клеток с Y-хромосомой, не выявленных в лимфоцитах [2]. При обследовании пациентов с наличием признаков нарушений полового развития случаи присутствия материала хромосомы Y всегда рассматриваются отдельно в связи с большим риском возникновения злокачественных новообразований [10]. Как минимум у 10% больных с синдромом Тернера в образцах выявляется наличие материала Y-хромосомы [11].

Среди больных с синдромом Тернера с выявленным клоном клеток, несущим Y-хромосому, частота гонадобластомы возрастает многократно: по разным данным от 4 до 60% по сравнению с 1% в среднем для всех пациентов с синдромом Тернера [9,10].

Однако корреляция уровня и распределения аномального кариотипа с фертильностью не всегда однозначна. Так, в выборке из 141916 женщин, имеющих детей, по результатам генотипирования родителей с аномальными результатами неинвазивного пренатального скрининга, у 103 женщин были выявлены аномалии половых хромосом, из которых 77 были мозаичными с линией 46,ХХ[12]

В 244,848 образцах женщин моложе 40 лет из коллекции биобанка Соединенного королевства по результатам микроматричного анализа в 326 случаях были выявлены численные аномалии хромосомы X. Среди них у 30 женщин выявлена предположительно немозаичная форма моносомии X, диагноз синдрома Тернера установлен у 16 из них (55%). Примечательно, что из 186 женщин с мозаичным кариотипом 46,ХХ/45,Х лишь у одной имеются сведения об этом диагнозе. В целом, отмечают авторы, у женщин с мозаицизмом была сохранена репродуктивная функция и нормальный уровень рождаемости, отсутствовали сердечно-сосудистые осложнения. У 110 женщин была выявлена трисомия по хромосоме X, ассоциированная с преждевременной менопаузой [13].

Учитывая отсутствие явной корреляции клинических проявлений с долей лимфоцитов с аномальным кариотипом, у большого количества пациенток с нарушениями формирования и функционирования репродуктивной системы можно предположить наличие тканевого мозаицизма по половым хромосомам. Так, в ткани гонад относительное количество клеток с хромосомным набором 45,X может быть существенно больше или меньше, чем в клетках крови. В свою очередь для установления диагноза важен факт выявления аномального клона в клетках различных тканей.

С целью диагностики вышеуказанных состояний, как правило, используют цитогенетический анализ лимфоцитов периферической крови, культивированных стандартным методом. Однако, ограничениями метода могут являться меньший размер патологического хромосомного фрагмента, а также нарушения на преаналитическом этапе. Исследование проводится только на культивируемых тканях. Культивирование лимфоцитов может быть неудачным на фоне приема антибиотиков, цитостатиков, тяжелого состояния больного. Культивирование клеток мочевого осадка часто осложняется контаминацией бактериями. Получение культуры фибробластов кожи - инвазивная процедура, требующая участия специалиста-дерматолога.

Известен метод флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) - это молекулярно-цитогенетический метод, основанный на связывании (гибридизации) меченных флюорохромами ДНК-зондов с комплементарными им последовательностями ДНК в образце пациента. В результате гибридизации комплементарные участки ДНК приобретают специфическую окраску, которая исследуется с помощью флюоресцентного микроскопа. Метод FISH позволяет изучать расположение интересующих участков ДНК на препаратах хромосом для детекции количественных и качественных хромосомных и генных аномалий. Для разных целей FISH-исследования могут использоваться центромерные, субтеломерные, локус-специфические или цельнохромосомные ДНК-зонды. Так, для выявления численных хромосомных аномалий применяются центромерные зонды на интересующие хромосомы, в случае нарушений формирования и функционирования репродуктивной системы - ДНК-зонды к центромерным последовательностям хромосом X и Y. Важным достоинством метода является то, что, в отличие от стандартного кариотипирования, FISH может выполняться на неделящихся клетках (интерфазный FISH), что облегчает выявление тканевого мозаицизма. FISH позволяет за короткое время проанализировать сотни клеток препарата, что способствует выявлению низкоуровневого мозаицизма. Сроки выполнения исследования в этом случае значительно меньше, чем при стандартном кариотипировании, - несколько дней. К недостаткам метода можно отнести невозможность проанализировать весь геном, поскольку анализ проводится с ограниченным набором выбранных ДНК-зондов к интересующим хромосомным локусам (использование большего числа зондов приводит к наложению сигналов и ложному результату). Также метод не детектирует перестройки, которые по размеру меньше, чем последовательность ДНК-зонда. Несмотря на достоинства FISH для детекции мозаицизма, риск ошибок из-за распределения хромосомных аберраций по тканям сохраняется, что требует исследования более чем одной ткани пациента.

У пациенток с нарушениями формирования и функционирования репродуктивной системы принципиальным для определения тактики ведения является выявление численных аномалий Х-хромосомы и клонов клеток с хромосомой Y.

Морфологические характеристики эпителиоцитов дают возможность обнаружить развитие предопухолевых, опухолевых процессов, нарушение дифференцировки клеток, провести диагностику инфекционных поражений слизистой оболочки, оценить общее функциональное состояние человека и даже определить пол индивидуума [2].

Известен метод диагностики хромосомного мозаицизма в буккальном эпителии. Впервые использовать буккальный эпителий для оценки состояния генетического аппарата человека начали в 1980-е годы.

Однако, показано, что результативность исследования может зависит от множества факторов и не всегда позволяет выявить тканевой мозаицизм. Так, перед сбором буккального эпителия необходимо воздержаться от приема пищи. Наличие воспалительных заболеваний в ротовой полости, высокая обсемененность лейкоцитарными клетками существенно влияют на результативность исследования, а малое количество клеточного материала зачастую снижают результативность гибридизации.

Известно, что влагалище выстилает многослойный плоский неороговевающий эпителий, в котором различают базальный, парабазальный, промежуточный и поверхностный слои. В отличие от буккального эпителия, вышеописанный биологический материал имеет наиболее близкое эмбриональное сродство к репродуктивной системе женщины, кроме того, легче поддается гибридизации и характеризуется меньшим количеством лейкоцитарной обсеменненности при соблюдении условий забора материала. В англоязычной литературе описан способ исследования клеток влагалищного мазка методом FISH для детекции хромосомных перестроек, характерных для карциномы эндометрия [14] Авторы подчеркивают простоту, неизвазивность метода, его информативность и экономическую эффективность для заявленной цели. Однако для изучения численных аномалий половых хромосом в клетках влагалищного эпителия данный метод ранее не применялся.

Таким образом, поиск комплексного одномоментного, точного, быстрого, неинвазивного метода диагностики хромосомного мозаицизма у пациенток с нарушениями развития и функционирования репродуктивной системы представляется крайне актуальным

Задачей изобретения

является разработка способа диагностики хромосомного мозаицизма у пациенток с нарушением формирования и функционирования репродуктивной системы по вагинальному эпителию методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с ДНК-зондами, комплементарными центромерным последовательностям половых хромосом.

Методика исследования

В исследование было включено 15 пациенток в возрасте от 11 до 18 лет включительно. Группы формировали на основе результатов стандартного цитогенетического исследования лимфоцитов крови с исследованием кариотипа минимум 20 метафазных пластинок.

Критерии включения в основную группу (n=5): клинически и инструментально подтвержденное нарушение формирования пола у больных с женским или интерсексуальным фенотипом и кариотипом лимфоцитов периферической крови 46,XY в немозаичном состоянии.

Критерий включения в группу сравнения (n=5): клинически и инструментально подтвержденное нарушение полового развития у больных с женским или интерсексуальным фенотипом и линией клеток с кариотипом 45,Х, доля которой превышает 10%, при исследовании лимфоцитов периферической крови.

Критерий включения в группу контроля (n=5): клинически и инструментально подтвержденное нарушение функционирования репродуктивной системы у больных с женским фенотипом и кариотипом лимфоцитов периферической крови 46,ХХ в немозаичном состоянии.

На 1-м этапе проводили детальный анализ анамнестических данных, включая изучение наследственной предрасположенности к заболеваниям (сбор семейного анамнеза), вредных привычек и хронических заболеваний у родителей до зачатия, течения беременности и родов у матерей пациенток, острых и хронических соматических и эндокринных заболеваний, перенесенных и имеющихся у девушек к моменту осмотра.

На 2-м этапе после получения информированного согласия родителя или законного представителя и пациентки проводилась оценка жалоб, физического (рост, масса тела, индекс массы тела) и полового развития (половая формула, данные гинекологического и ректоабдоминального осмотра), результатов гормонального и эхографического исследований.

На 3-м этапе проводили комплексное генетическое обследование: цитогенетической анализ лимфоцитов периферической крови и молекулярно-цитогенетическое исследование методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с ДНК-зондами, комплементарными центромерным последовательностям половых хромосом, клеток буккального и вагинального эпителия. Образец буккального эпителия получали атравматичным соскобом с внутренней поверхности щеки с помощью одноразового стерильного шпателя с равномерным распределением по чистому сухому предметному стеклу с последующим высушиванием на воздухе. Образец вагинального эпителия получали путем взятия мазка-соскоба на глубине 3,0 см за гименальным кольцом одноразовым урогенитальным зондом (артикул:3400-01), нанесенного на чистое и сухое предметное стекло с последующим высушиванием на воздухе.

На 5-м этапе полученные данные клинических исследований обрабатывались статистическими методами.

Полученные результаты

Установлено, что при нарушении полового развития во влагалищном эпителии, полученном путем взятия мазка-соскоба со слизистой боковой стенки влагалища на глубине 3,0 см за гименальным кольцом одноразовым урогенитальным зондом, нанесенного на чистое и сухое предметное стекло с последующим высушиванием на воздухе и проанализированного методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с ДНК-зондами, комплементарными центромерным последовательностям половых хромосом, статистически значимо чаще выявляется тканевой мозаицизм, в том числе с наличием У-хромосомы, в сравнении с буккальным эпителием (р<0,05).

Задачей изобретения является разработка способа диагностики хромосомного мозаицизма у пациенток с нарушением формирования и функционирования репродуктивной системы по вагинальному эпителию методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с ДНК-зондами, комплементарными центромерным последовательностям половых хромосом

Сущность изобретения заключается в том, что проводят забор мазка-соскоба со слизистой боковой стенки влагалища на глубине 3,0 см за гименальным кольцом одноразовым урогенитальным зондом (артикул:3400-01) и наносят на чистое и сухое предметное стекло с последующим высушиванием на воздухе с дальнейшим исследованием вагинального эпителия методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с ДНК-зондами, комплементарными центромерным последовательностям половых хромосом.

Способ позволяет неинвазивно, без существенных затруднений в заборе материала в течение суток, диагностировать тканевой мозаицизм у пациенток с нарушением формирования и функционирования репродуктивной системы.

Предложенный метод впервые позволяет ускорить диагностический поиск у пациенток с различными вариантами нарушений формирования и функционирования репродуктивной системы, индивидуализировать лечебные подходы, включая выбор лекарственных и хирургических методов, в том числе с целью минимизации онкологических рисков.

В основу способа положена впервые предлагаемая авторами комплексная оценка вагинального эпителия методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с ДНК-зондами, комплементарными центромерным последовательностям половых хромосом для диагностики нарушения формирования и функционирования репродуктивной системы.

Способ осуществляется следующим образом:

Проводят забор мазка-соскоба со слизистой боковой стенки влагалища на глубине 3,0 см за гименальным кольцом одноразовым урогенитальным зондом и наносят на чистое сухое предметное стекло с последующим высушиванием на воздухе и дальнейшим исследованием вагинального эпителия методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с ДНК-зондами, комплементарными центромерным последовательностям половых хромосом.

Способ позволяет неинвазивно, без существенных затруднений в заборе материала, точно и быстро диагностировать тканевой мозаицизм у пациенток с нарушением формирования и функционирования репродуктивной системы

Предложенный метод впервые позволяет ускорить диагностический поиск у пациенток с различными вариантами нарушения формирования и функционирования репродуктивной системы, индивидуализировать лечебные подходы, включая выбор лекарственных и хирургических методов, в том числе с целью минимизации онкологических рисков.

Клинические примеры

Пример 1. Пациентка А., 17 лет, поступила в отделение гинекологии детей и подростков с диагнозом: Задержка полового развития.

Жалобы на отсутствие самостоятельных менструаций и развития вторичных половых признаков.

Гинекологический осмотр при поступлении: наружные половые органы сформированы соответственно женскому полу. Уретра расположена типично. Гимен бахромчатый. Выделения слизистые, скудные. При ректальном осмотре: тело матки в типичном месте не пальпируется. При ультразвуковом исследовании гениталий: Матка и яичники уменьшена в размерах. По данным вагиноскопии: слизистая влагалища бледно-розового цвета, складчатость не выражена. Шейка матки гипоплазирована. Гормональное исследование: ЛГ/лютеинизирующий гормон - 42,1 МЕ/л, ФСГ/фолликулостимулирующий гормон -107 МЕ/л, эстрадиол <73.4 пмоль/л, общий тестостерон -10 нмоль/л.

Больной проведено комплексное цитогенетическое и молекулярно-цитогенетическое обследование.

По данным цитогенетического исследования по лимфоцитам крови: кариотип 46,ХУ [25].

По данным FISH-диагностики лимфоцитов периферической крови: в 300 клетках исследованного материала были обнаружены 300 клеток, содержащих по 1 сигналу, соответствующему хромосомам X и Y. По данным FISH-диагностики буккального эпителия: в 300 клетках исследованного материала были обнаружены 300 клеток, содержащих по 1 сигналу, соответствующему хромосомам X и Y.

По данным FISH-диагностики вагинального эпителия: в 300 клетках исследованного материала были обнаружены 300 клеток, содержащих по 1 сигналу, соответствующему хромосомам X и Y.

Установлен диагноз: Нарушение формирования пола, 46,XY. Дисгенезия гонад.

Проведено комплексное лечение.

Пример 2. Пациентка И., 16 лет, поступила в отделение гинекологии детей и подростков с диагнозом: Задержка полового развития. Жалобы на отсутствие самостоятельных менструаций.

Гинекологический осмотр при поступлении: наружные половые органы сформированы соответственно женскому полу. Уретра расположена типично.

Гимен бахромчатый. Выделения слизистые, скудные.

При ректальном осмотре: тело матки цилиндрической формы.

При ультразвуковом исследовании гениталий: Матка и яичники уменьшена в размерах. По данным вагиноскопии: слизистая влагалища бледно-розового цвета, складчатость умеренно выражена. Шейка матки сформирована правильно.

Гормональное исследование: ЛГ/ Лютеинизирующий гормон -38 МЕ/л, ФСГ/ Фолликулостимулирующий гормон -112 МЕ/л, Эстрадиол <73.4 пмоль/л, Общий тестостерон -0,7 нмоль/л.

Больной проведено комплексное цитогенетическое и молекулярно-цитогенетическое обследование.

По данным цитогенетического исследования по лимфоцитам крови: кариотип 46,ХХ [30].

По данным FISH-диагностики лимфоцитов периферической крови: В 300 клетках исследованного материала были обнаружены 293 клетки, содержащих по 2 сигнала, соответствующих хромосоме X, 7 клеток, содержащих по 1 сигналу, соответствующему хромосоме X. Сигналов, соответствующих Y хромосоме, не обнаружено. Выявленный мозаицизм (XX - 98%, X - 2%) соответствует возрастной норме.

По данным FISH-диагностики буккального эпителия: В 300 клетках исследованного материала были обнаружены 290 клеток, содержащих по 2 сигнала, соответствующих хромосоме X, 10 клеток, содержащих по 1 сигналу, соответствующему хромосоме X. Сигналов, соответствующих Y хромосоме, не обнаружено. Выявленный мозаицизм (XX - 97%, X - 3%) соответствует возрастной норме.

По данным FISH-диагностики вагинального эпителия: В 300 клетках исследованного материала были обнаружены 295 клеток, содержащих по 2 сигнала, соответствующих хромосоме X, 5 клеток, содержащих по 1 сигналу, соответствующему хромосоме X. Сигналов, соответствующих Y хромосоме, не обнаружено. Выявленный мозаицизм (XX - 98%, X - 2%) соответствует возрастной норме.

Установлен диагноз: Задержка полового развития. Проведено комплексное лечение.

Пример 3. Пациентка Д., 16 лет, поступила в отделение гинекологии детей и подростков с диагнозом: Задержка полового развития. Синдром Тернера.

Жалобы на отсутствие самостоятельных менструаций, низкий рост.

Гинекологический осмотр при поступлении: наружные половые органы сформированы соответственно женскому полу. Уретра расположена типично.

Гимен бахромчатый. Выделения слизистые, скудные.

При ректальном осмотре: тело матки цилиндрической формы.

При ультразвуковом исследовании гениталий: Матка и яичники уменьшены в размерах. По данным вагиноскопии: слизистая влагалища бледно-розового цвета, складчатость умеренно выражена. Шейка матки сформирована правильно.

Гормональное исследование: ЛГ/ Лютеинизирующий гормон -42,1 МЕ/л, ФСГ/ Фолликулостимулирующий гормон -107 МЕ/л, Эстрадиол <73.4 пмоль/л, Общий тестостерон -10 нмоль/л.

Больной проведено комплексное цитогенетическое и молекулярно-цитогенетическое обследование.

По данным цитогенетического исследования по лимфоцитам крови: кариотип 45,Х

По данным FISH-диагностики лимфоцитов периферической крови: В 300 клетках исследованного материала были обнаружены 186 клеток, содержащих по 1 сигналу, соответствующему хромосоме X, 114 клеток, содержащих по 1 сигналу, соответствующему хромосомам X и Y. Выявлен мозаицизм (X - 62%, XY - 38%).

По данным FISH-диагностики буккального эпителия: В 300 клетках исследованного материала были обнаружены 158 клеток, содержащих по 1 сигналу, соответствующему хромосоме X, 142 клетки, содержащих по 1 сигналу, соответствующему хромосомам X и Y. Выявлен мозаицизм (X -44%, XY - 47%).

По данным FISH-диагностики вагинального эпителия: В 300 клетках исследованного материала были обнаружены 133 клетки, содержащих по 1 сигналу, соответствующему хромосоме X, 167 клеток, содержащих по 1 сигналу, соответствующему хромосомам X и Y. Выявлен мозаицизм (X -44%, XY - 56%). Установлен диагноз: Задержка полового развития. Синдром Тернера, мозаичный вариант с У-хромосомой в кариотипе. Проведено комплексное лечение.

Список литературы

1. Современные представления о нарушениях половой дифференцировки Устинкина Т.И., Шустов СБ. Проблемы эндокринологии. 2010. Т. 56. №1. С. 57-62.

2. Мозаицизм половых хромосом в гонадах у больных с преждевременной недостаточностью яичников Жахур Н.А., Марченко Л.А., Курило Л.Ф., Карселадзе А.И., Бутарева Л.Б., Строганова A.M. Акушерство и гинекология. 2011. №6. С. 70-75.

3. Gordon CM, Kanaoka Т, Nelson LM. Update on primary ovarian insufficiency in adolescents. Curr Opin Pediatr. 2015 Aug;27(4):511-9. doi: 10.1097/MOP.0000000000000236. PMID: 26087426.

4. Bouali N, Hmida D, Mougou S, Bouligand J, Lakhal B, Dimessi S, Francou B, Saad G, Trabelsi S, Zaouali M, Gribaa M, Chaieb M, Bibi M, Guiochon-Mantel A, Saad A. Analysis of FMR1 gene premutation and X chromosome cytogenetic abnormalities in 100 Tunisian patients presenting premature ovarian failure. Ann Endocrinol (Paris). 2015 Dec;76(6):671-8. doi: 10.1016/j.ando.2015.10.001. Epub 2015 Dec 1. PMID: 26593861.

5. Geckinli BB, Toksoy G, Sayar C, Soylemez MA, Yesil G, Aydm H, Karaman A, Devranoglu B. Prevalence of X-aneuploidies, X-structural abnormalities and 46,XY sex reversal in Turkish women with primary amenorrhea or premature ovarian insufficiency. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2014 Nov;182:211-5. doi: 10.1016/j.ejogrb.2014.09.033. Epub 2014 Sep 28. PMID: 25445102.

6. Ayed W, Amouri A, Hammami W, Kilani O, Turki Z, Harzallah F, Bouayed-Abdelmoula N, Chemkhi I, Zhioua F, Slama CB. Cytogenetic abnormalities in Tunisian women with premature ovarian failure. С R Biol. 2014 Dec;337(12):691-4. doi: 10.1016/j.crvi.2014.09.003. Epub 2014 Oct 11. PMID: 25433561.

7. Whigham CA, Vollenhoven B, Vincent AJ. Reproductive health in Turner syndrome: A narrative review. Prenat Diagn. 2023 Feb;43(2):261-271. doi: 10.1002/pd.6261. Epub 2022 Nov 12. PMID: 36336873.

8. Castronovo C, Rossetti R, Rusconi D, Recalcati MP, Cacciatore C, Beccaria E, Calcaterra V, Invernizzi P, Larizza D, Finelli P, Persani L. Gene dosage as a relevant mechanism contributing to the determination of ovarian function in Turner syndrome. Hum Reprod. 2014 Feb;29(2):368-79. doi: 10.1093/humrep/det436. Epub 2013 Dec 8. PMID: 24324027; PMCID: PMC3896225

9. Тканевой мозаицизм у пациентов с синдромом шерешевского-тернера Опарина Н.В., Калиненкова С.Г., Латыпов А.Ш., Черных В.Б. В книге: Сборник тезисов IV Всероссийской конференции с международным участием "Репродуктивное здоровье женщин и мужчин". ФГБУ "НМИЦ эндокринологии" Минздрава России; ОО "Российская ассоциация эндокринологов". 2019. С. 30-31.

10. Цитогенетические и молекулярно-цитогенетические (fish и mcb) исследования синдрома шерешевского-тернера: ретроспективный анализ 96 случаев Колотий А.Д., Ворсанова С.Г., Юров Ю.Б., Соловьев И.В., Демидова И.А., Кравец B.C., Шаронин В.О., Куринная О.С, Гордеева М.Л., Богатырева Е.П., Юров И.Ю. Современные проблемы науки и образования. 2016.№5. С. 16.

И. Gravholt СН, Andersen NH, Conway GS, Dekkers ОМ, Geffner ME, Klein КО, Lin AE, Mauras N, Quigley CA, Rubin K, Sandberg DE, Sas TCJ, Silberbach M, Soderstrom-Anttila V, Stochholm K, van Alfen-van derVelden JA, Woelfle J, Backeljauw PF; International Turner Syndrome Consensus Group.Clinical practice guidelines for the care of girls and women with Turner syndrome: proceedings from the 2016 Cincinnati International Turner Syndrome Meeting. Eur J Endocrinol. 2017 Sep;177(3):Gl-G70. doi: 10.1530/EJE-17-0430. PMID: 28705803.

12. Samango-Sprouse C, Kirkizlar E, Hall MP, Lawson P, Demko Z, Zneimer SM, Curnow KJ, Gross S, Gropman A. Incidence of X and Y Chromosomal Aneuploidy in a Large Child Bearing Population. PLoS One. 2016 Aug 11;11(8):e0161045. doi: 10.1371/journal.pone.0161045. PMID: 27512996; PMCID: PMC4981345.

13. Tuke MA, Ruth KS, Wood AR, Beaumont RN, Tyrrell J, Jones SE, Yaghootkar H, Turner CLS, Donohoe ME, Brooke AM, Collinson MN, Freathy RM, Weedon MN, Frayling TM, Murray A. Mosaic Turner syndrome shows reduced penetrance in an adult population study. Genet Med. 2019 Apr;21(4):877-886. doi: 10.1038/s41436-018-0271-6. Epub 2018 Sep 5. PMID: 30181606; PMCID: PMC6752315.

14. Weimer J, Hiittmann M, Nusilati A, Andreas S, Roseler J, Tribian N, Rogmans C, Stope MB, Dahl E, Mustea A, Stickeler E, Hedemann N, Florkemeier I, Tiemann K, Magadeeva S, Dempfle A, Arnold N, Maass N, Bauerschlag D. Fluorescence in situ hybridization test for detection of endometrial carcinoma cells by non-invasive vaginal swab. J Cell Mol Med. 2023 Feb;27(3):379-391. doi: 10.1111/jcmm.17658. Epub 2023 Jan 10. PMID: 36625073; PMCID: PMC9889703.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу диагностики хромосомного мозаицизма. Способ предназначен для диагностики хромосомного мозаицизма у пациенток с нарушением формирования и функционирования репродуктивной системы по вагинальному эпителию методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с ДНК-зондами, комплементарными центромерным последовательностям половых хромосом. Указанный способ включает следующие стадии: забор мазка-соскоба со слизистой боковой стенки влагалища на глубине 3,0 см за гименальным кольцом одноразовым урогенитальным зондом и нанесение на чистое сухое предметное стекло с последующим высушиванием на воздухе с дальнейшим исследованием вагинального эпителия методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с ДНК-зондами, комплементарными центромерным последовательностям половых хромосом. Настоящее изобретение обеспечивает комплексный одномоментный, точный, быстрый, неинвазивный метод диагностики хромосомного мозаицизма у пациенток с нарушениями развития и функционирования репродуктивной системы. 3 пр.

Способ диагностики хромосомного мозаицизма у пациенток с нарушением формирования и функционирования репродуктивной системы по вагинальному эпителию методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с ДНК-зондами, комплементарными центромерным последовательностям половых хромосом, отличающийся тем, что проводят забор мазка-соскоба со слизистой боковой стенки влагалища на глубине 3,0 см за гименальным кольцом одноразовым урогенитальным зондом, наносят на чистое сухое предметное стекло с последующим высушиванием на воздухе с дальнейшим исследованием вагинального эпителия методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) с ДНК-зондами, комплементарными центромерным последовательностям половых хромосом.