РЕКОМБИНАТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PYА1А 05 ДЛЯ МАРКИРОВАНИЯ И ИНДЕНТИФИКАЦИИ ТРЕТЬЕЙ ХРОМОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА Российский патент 1997 года по МПК C12N15/00 C12Q1/68 

Изобретение относится к генетической инженерии, в частности к конструированию молекулярно-генетических маркеров, и может быть использовано в медицинской генетике для достоверной идентификации хромосомы 3 человека в норме и патологии, включая пренатальную и постнатальную диагностику хромосомной патологии, диагностику анеуплоидий при различных формах рака, а также для цитогенетического картирования генома человека.

Известно, что к настоящему моменту клонированы и охарактеризованы ДНК-зонды для различных хромосом человека.

Однако в качестве ДНК-зондов чаще всего используют уникальные (однокопийные или малокопийные последовательности ДНК), которые не позволяют проводить эффективную молекулярно-цитогенетическую диагностику из-за низкой разрешающей способности современных цитогенетических методов. Исключением являются хромосомо-специфичные ДНК-зонды, содержащие повторяющиеся (многокопийные) последовательности ДНК. К ним относятся сателлитные (альфа- и "классические" сателлиты) ДНК, которые представляют собой многократные повторяющиеся от нескольких сотен до несколько тысяч раз относительно короткие (длиной до 170 п. о.) фрагменты ДНК, формирующие центромерные районы всех хромосом человека. На их основе созданы и защищены авторскими свидетельствами ДНК-зонды альфоидной ДНК со спецификой для хромосом I, II и X человека (Гиндилис и др. 1985, N 1203108; Юров и др. 1993, N 1792429).

Остается актуальной задача получения высокоэффективных ДНК-зондов для маркирования остальных хромосом человека. В настоящее время описан ряд клонированных альфа-сателлитных и классических сателлитных ДНК, которые характеризуются спецификой для разных хромосом человека. Эти последовательности можно рассматривать в качестве прототипа данному изобретению. Однако возможность их использования для маркирования и идентификации хромосом человека остается открытой. В частности, обнаружены варианты альфоидной ДНК для человека, которые имеются в хромосоме 3 (Willard H.F. Waye J.S. 1987. Hierarchial order in chromosomespecific human alpha satellite DNA. Trends Genetics, 3, 192-198; Yurov Yu.B. Yakovelev A.G. et al, 1986. The cloned fragment of reiterated human DNA specific to centromeric heterochromatin of chromosome 3. Mol. Genet. Virusol. SSSR. 7, 19-23; Delattre O. Bernard A. et al. 1988. Studies on the human chromosome 3 centromere with a newly cloned alphoid DNA probe. Hum. Hered. 38, 156-167; Waye J.S. Willard H.F. 1989. Chromosome specificity of alpha satellite DNAs: short- and long-range organization of a diverged dimeric subset of human alpha satellite from chromosome 3. Chromosoma. Berlin. 97. 475-480).

Эти ДНК-зонды не исследованы достаточно подробно с точки зрения конструирования ДНК-зондов для маркирования хромосомы 3 человека в прикладных работах. При этом все описанные в литературе рекомбинантные плазмиды, содержащие альфа-сателлитную ДНК человека со спецификой для хромосомы 3, не обладают достаточно высокой специфичностью для центромерного района хромосомы 3 человека. Поэтому их нельзя использовать для эффективной молекулярно-цитогенетической диагностики в медицинской практике, когда требуется корректная идентификация аномалий хромосом и последующее медико-генетическое консультирование или пренатальная диагностика с возможным прерыванием беременности вследствие аберраций хромосомы 3.

Актуальным для молекулярно-цитогенетической диагностики остается конструирование маркера для центромерного района хромосомы 3 человека, который позволил проводить маркирование и идентификацию центромерного района хромосомы 3 в интерфазных и метафазных клетках.

Изобретение не имеет аналогов, так как подобная рекомбинантная плазмида для высокоспецифичного маркирования центромерного района хромосомы 3 человека разработана впервые. Полученная рекомбинантная плазмида pYAIa05 отличается от известных по литературе клонированных сателлитных ДНК по способу получения, по рестриктной карте и размерам вставки альфоидной ДНК человека, по особенностям хромосомной локализации и по высокой специфичности для хромосомы 3 человека.

Изобретение не имеет общих признаков ни с одним из приведенных выше аналогов, т. к. для молекулярно-цитогенетического маркирования и идентификации центромерного района хромосомы 3 человека данное техническое решение разработано впервые.

Цель изобретения создание нового эффективного молекулярно-генетического маркера 3-й хромосомы человека, а именно специфичного для центромерного района, включая гетерохроматин обоих плеч, для строгого маркирования околоцентромерного района хромосомы 3 без перекрестной гибридизации с другими хромосомами, а также эффективного маркирования центромерного района хромосомы 3 в интерфазных ядрах для идентификации численных хромосомных аберраций, что необходимо для кариологического анализа неделящихся клеток, например клеток опухолей.

Сущность изобретения заключается в том, что клонированный в плазмиде pUC19 (2,7 т. н. п.) по Pst1-сайтам фрагмент ДНК человека PYAIa05 размером 2900 пар оснований, представляющий собой последовательность альфоидной ДНК человека, используется в качестве специфического молекулярного маркера 3-й хромосомы человека. Данный фрагмент имеет длину 2900 пар нуклеотидов и относится к классу альфоидной ДНК, что доказано при проведении рестрикционного картирования ДНК-зонда, опытов по блот-гибридизации и по гибридизации на хромосомах in situ.

Новый ДНК-зонд отличается от известных геномным фрагментом ДНК человека размером 2900 пар оснований, имеющего II внутренних уникальных сайта рестрикции EcoR1 и ограниченного Pst1-сайтами с разных концов геномного фрагмента. Кроме того, этот новый ДНК-зонд отличается минорными сайтами гибридизации на хромосомах человека в условиях in situ, которые включают хромосомы 1, 5, 10, 16, 19. В специальных условиях, описанных в примерах и способе использования, этот ДНК-зонд гибридизуется только с центромерным районом хромосомы 3 человека.

Конкретная цель исследования достигалась следующим образом.

Источником выделения маркерного фрагмента pYAIa05 служит ДНК лимфоцитов человека, очищенная методом электрофильтрации на ультрафильтрующей мембране типа XM-300 "Amicon". Препарат очищенной лимфоцитарной ДНК человека (полученный от индивидов мужского пола) обрабатывают рестриктазой Pst1 до полного гидролиза. Полученные рестриктивные фрагменты "вшивают" с помощью легирования по "липким" концам в Pst1-сайт бактериального плазмидного вектора PUC19 (2,7 т.п.н.). Данная плазмида несет ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки. Таким образом данный вектор позволяет создать рекомбинантную клонотеку (по типу "short-gun") при автоматической селекции на среде с ампициллином.

На следующем этапе в созданной клонотеке идентифицируют клоны, обладающие гомологией с альфа-ДНК. Для этого рекомбинантные клоны на нитроцеллюлозных фильтрах вводят в реакцию гибридизации с меченной радиоактивным фосфором (³²P) ДНК тотальной фракции ARI-ДНК человека, которая представлена в основном альфоидной ДНК. Колонии, ДНК которых дает позитивные рефлексы на радиоавтографах в результате гибридизации, отбирают и используют для определения хромосомной локализации клонированных в них рестриктных фрагментов ДНК человека непосредственно в цитологических препаратах хромосом in situ.

Для этого препараты хромосом готовят из делящихся клеток в культуре лимфоцитов периферической крови по известному методу. Стимулированные к делению с помощью фитогемагглютинина (фирма "Дифко", США) лимфоциты крови культивируют в пенициллиновых флаконах при 37^oC в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 72 ч. За 1,5 ч до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCI и инкубируют 10 мин при 37^oC. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в отношении 3:1) трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при 37^oC и используют в 4 опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.

Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой известным методом замещения: в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного раствора (0,8 М трис-HCl, pH 7,4; 0,1 М MgCl₂; 0,05 М дитиотреитол), 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,01 ммоль каждого за исключением тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл³Н-тимидинфосфата (удельная активная активность 114 Ки/миль, концентрация 5 мКи/мл, 10 мкл ДНК-полимеразы-1 (концентрация 2 ед/мкл). Объем реакционной смеси 150 мкл. Реакцию проводят 20-40 мин при 20^oC. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК составляет около 25•10⁶ импульсов в 1 мин в расчете на 1 мкг ДНК.

Гибридизацию меченой радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК(pYAIa05) с метафазными хромосомами in situ проводят по следующей методике: препараты метафазных хромосом денатурируют 30 с в 0,07 N NaOH с последующей промывкой по 10 мин в 70 и 96%-ном спирте; препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2 • SSC), в течение 10 мин при 100^oC в течение 17-18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2 x SSC при комнатной температуре, в 70 и 96% -ном этиловом спирте по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловым проявителем препараты 2 мин тщательно промывают водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (pH 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении 1000 x или 1125 x.

Гибридизация in situ на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент pYAIa05 локализован в прицентромерном районе 3-й пары гомологических хромосом человека и является таким образом специфическим молекулярным маркером данной пары хромосом.

Способы использования полученной рекомбинантной плазмиды pYAIa05 идентификации хромосомы 3 человека в метафазных клетках с целью проведения молекулярно-цитогенетической диагностики поясняются следующими примерами.

Пример 1. Цельную гепаринизированную кровь здорового донора разводят 0,015 М NaCl в объемном соотношении 1:3. Для осаждения эритроцитов разведенную кровь смешивают с 6%-ным декстрансульфатом 500 в соотношении 5:1, смесь отстаивают 30 мин при комнатной температуре; все последующие процедуры проводят при 0-4^oC. Лейкоциты из надосадочной жидкости осаждают центрифугированием при 450g в течение 20 мин и отмывают трехкратным центрифугированием в 0,15 М NaCl (450 g, 10 мин). Отмытые клетки ресуспендируют в буфере СТМ, содержащем 0,5 М сахарозу, 50 мМ трис HCl (pH 8,0) 5 мМ MgCl, 0,02 мМ EDTA c тритоном X-100 в конечной концентрации 0,05% Фракцию ядер отмывают трехкратными центрифугированием в том же буфере без тритона X-100 (450g, 10 мин).

Ядра ресуспендируют в буфере TE (50 мМ трис HCl, pH 8,0; 5 мМ EDTA) из расчета: 100 мл буфера на 1 мл ядерного осадка и лизируют добавлением соркозила до концентрации 1% Лизат инкубируют при 65^oC не менее 1 ч до полного просветления и центрифугируют 60 мин при 2000 об/мин для удаления механических примесей. Супернатант переносят в цилиндр, снизу закрытый ультрафильтром XM-300 ("Amicon"). На супернатант наслаивают равный объем буфера TE + 1%-ный саркозил. Жидкость, находящуюся в цилиндре, отделяют от анодной камеры диализной мембраной. Нижний край цилиндра с фильтром опускают в катодную камеру; обе электронные камеры заполняют буфером, содержащим 89 мМ трис HCl, 89 мМ HBO и 5 мМ EDTA (pH 8,3). Электрофильтрацию раствора производят при 5 мМ/см² в течение 6-8 ч.

После электрофоретического осаждения ДНК на фильтре жидкость удаляют из цилиндра, а железобетонный слой ДНК растворяют в нужном объеме 0,1 М TE.

Для препаративного выделения плазмидной ДНК со вставкой ДНК человека E. Coli, несущую плазмиду, выращивают в 100 мл среды LB (10 г/л пентона, 5 г/л дрожжевого экстракта, 10 г/л NaCl) с добавками необходимых антибиотиков (100 мкг/мл ампициллина) при 37^oC на качалке в течение 12 ч. Клетки осаждают центрифугированием (5000 об/мин, 10 мин) и ресуспендируют в 10 мл раствора 50 мМ глюкозы, 50 трис-HCl (pH 8,0), 50 мМ EDTA и 5%-ный раствор тритона X-100. К суспензии добавляют свежеприготовленный раствор лизоцима до 5 мг/мл и оставляют при комнатной температуре на 10-15 мин. Затем объем пробы доводят до 50 мл буфером без лизоцима и помещают на ночь в термостат при 65^oC. ДНК-мембранный комплекс и денатурированные белки клеток осаждают центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. К супернатанту добавляют 100 мкг/мл РНК-азы А и после 2 ч инкубации при 65^oC проводят фенольную, а затем хлороформную депротеинизацию. ДНК из раствора осаждают равным объемом изо пропилового спирта (-18^oC, 20 мин), осадок растворяют в TE. Раствор ДНК диализуют на сефадексе G-50 против 0,1•SSC (1•SSC 18 г/л хлористого натрия и 4,8 г/л цитрата натрия). Этот раствор прогревают при 81^oC в течение 10 мин и быстро охлаждают добавлением объема 1 М KCl + 20 мМ трис -HCl pH 7,1 при 0^oC. Полученную смесь пропускают через колонку с нитроцеллюлозой Nitro-Cell-S (Serva) из расчета 1 мг ДНК на 10 см³ объема колонки. Фракции, содержащие кольцевые формы плазмидной ДНК, объединяют, ДНК из них осаждают равным объемом изопропилового спирта; осадок промывают 50%-ным изопропиловым или 70% -ным этиловым спиртом, высушивают под вакуумом и растворяют в буфере TE до нужной концентрации.

ДНК рекомбинантных плазмид для скрининга бактериальных клонов выделяет из 5 мл ночной культуры, осаждая центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин, осадок ресуспендируют в 1 мл 25 мМ трис-HCl (pH 8,0); 20 мМ EDTA, 50 мМ глюкозы и 2 мг/мл лизоцима с последующей инкубацией в течение 30 мин при 0^oC. К пробе добавляют 2 мл раствора 0,2 н. NaOH с 1% SDS и после тщательного перемешивания продолжают инкубацию 5 мин. К лизату добавляют 1,5 мл 3 М ацетата натрия, осторожно перемешивают раствор и оставляют на 1 ч при 0^oC. Образующийся осадок удаляют центрифугированием (1200 об/мин), нуклеиновые кислоты из супернатанта осаждают 2,5 объемами этилового спирта (-18^oC, 30 мин). Осадок растворяют в 1 мл 50 мМ трис-HCl (pH 8,0) + 0,1 М ацетата натрия и переосаждают этанолом. Процедуру переосаждения повторяют дважды, конечный осадок после высушивания растворяют в 100 мкл TE.

Эндонуклеазную обработку ДНК человека и бактериальных плазмид проводят в буфере REB, содержащем 10 мМ трис-HCl (pH 7,4), 10 мМ MgCl, 10 мМ NaCl и 1 мМ дитиотреитола (DTT). Полный эндонуклеазный гидролиз ДНК получается при относительной концентрации рестриктаз 5-8 ед/мкг ДНК после проведения реакции в течение 2 ч при 37^oC. Реакцию останавливают прогреванием пробы при 70^oC в течение 10 мин или добавлением 1/4 объема смеси 0,1%-ного раствора SDS, 25% -ного раствора сахарозы, 5 мМ ацетат натрия и 0,05%-ного раствора бромфенолового синего.

Для получения геномной клонотеки ДНК человека в качестве вектора используют бактериальную плазмиду pUC19, несущую ген устойчивости к ампициллину. Наличие гена устойчивости к ампициллину в плазмиде позволяет на среде с этим антибиотиком отбирать только трансформированные клетки.

Компетентную культуру бактерий для трансформации готовят следующим образом: в 25 мл питательной среды LB инокулируют 1 мл свежей ночной культуры E.coli HB 101 выращивают на качалке 37^oC до мутности А=0,4-0,5. Деление клеток останавливают, помещая культуру на лед на 10-15 мин с последующим центрифугированием при 5000 об/мин в течение 10 мин на холоде. Осадок промывают равным объемом охлажденного до 0^oC раствора 100 мМ CaCl₂, клетки осаждают и ресуспендируют 12 мл 100 мМ CaCl₂. Клеточную суспензию выдерживают на холоде 20-30 мин, центрифугируют, а осадок ресуспендируют в 2,5 мл 0,1 М CaCl₂ с 15% -ным глицерином. После инкубации полученной суспензии при 0^oC по крайней мере в течение 3 мин культуру можно трансформировать. Она хранится в малых порциях при -80^oC, при этом ее компетентность сохранается в течение 4-5 месяцев.

К 200 мкл компетентной культуры бактерий при 0^oC добавляют 0,1-0,2 мкг легированной ДНК и инкубируют при этой температуре в течение 45-60 мин. Затем смесь переносят в водяную баню (42^oC) на 60-90 с и помещают на лед. К трансформированной культуре добавляют питательный бульон LB и подращивают ее на качалке 2-3 ч при 37^oC. Трансформанты высевают на плотную среду с 1,5% агара (по 0,1 мл культуры на чашку Петри) и добавляют необходимые антибиотики, обуславливающие селекцию трансформированных клонов.

30 мкл раствора, содержащего 0,1-0,2 мкг плазмидной ДНК или 0,1 мкг препаративно выделенного из геля фрагмента и 1 мкл ДНК-азы-1 в 0,015 М NaCl, 5 мМ CaCl₂, инкубируют 10 мин при комнатной температуре, ДНК-азу-1 инактивируют при 70^oC 10 мин, после чего к раствору добавляют буферный раствор 0,4 М трис-HCl (pH 7,4); 50 мМ MgCl₂, 25 мМ DTT (до 1/5 конечного объема) по 1 нмоль каждого из немеченых предшественников ДНК, 20-40 мкКи одного из ³²P-дезоксинуклеозидтрифосфатов с удельной активностью 110 ТВ/ммоль (3000 Ки/ммоль) (Amersham) и 1 ед. ДНК-полимеразы-1. Объем реакционной смеси, как правило, составляет 100 мкл, реакцию ведут в течение 1 ч при 37^oC. Радиоактивность кислотонерастворимой фракции ДНК измеряют на счетчике LRB 1215 по специальной программе. Средняя удельная активность меченых препаратов 2-5• 10⁸ имп./мин/мкг ДНК.

Для идентификации вставок ДНК человека в составе гибридных клонов бактериальные колонии, предварительно тестированные по фенотипу как рекомбинантные, репликой наносят на нитроцеллюлозные фильтры (Millipore, HAWP), находящиеся непосредственно на поверхности твердой питательной среды в чашках Петри, и выращивают их в течение суток при 37^oC. Выросшие колонии вместе с фильтром переносят на поверхность раствора 0,5 М NaOH и оставляют на 5-10 мин. Подсушив фильтр с нижней стороны фильтрованной бумагой, его дважды по 10 мин обрабатывают раствором 1 М трис-HCl (pH 7,5), а затем 1,5 М NaCl с 1 М трис HCl (pH 7,5). Высушенный на воздухе фильтр помещают в раствор 2•SSC с протеиназой К в концентрации 50 мкг/мл и инкубируют в нем 30 мин при 37^oC. Далее подсушенный фильтр промывают в 0,3 М NaCl, а затем сушат под вакуумом при 80^oC в течение 1-2 ч.

Перед гибридизацией фильтр вымачивают при 68^oC в растворе 2 •SSC, 0,5% SDS, 0,1% фикол-400 и 0,1% поливинилпирролидон-350 в течение 60-90 мин. Вслед за этим фильтр насухо промакают фильтрованной бумагой и помещают в 4-5 мл гибридизационной смеси, содержащей 6•SSC; 0,1% SDS; 10% декстрансульфата-500, 50 мкг/мл поли(А) и денатурированную пробу ³²P-меченой ДНК с суммарной активностью 1-5•10⁶ имп./мин. Гибридизацию проводят при 68^oC в течение 18-24 ч. Фильтры промывают в нескольких сменах раствора 0,5•SSC с 0,5% SDS при 68^oC в течение нескольких часов. Отмытые фильтры окончательно высушивают и помещают в кассету с рентгеновской пленкой РМ-1. Через 2-24 часа экспозиции проявляют радиоавтографически и по наличию положительных сигналов (участков почернения округлой формы) идентифицируют гибридные клоны.

Описанным способом ставят опыт на трех фильтрах-репликах с клонотекой Pst1 фрагментов ДНК человека. При этом в качестве зонда для гибридизации с колониями на фильтрах берется проба альфоидной ДНК человека, выделенной препаративно из агарозного геля после электрофоретического разделения гидролизата геномной ДНК человека эндонуклеазой Pst1 и идентификации полосы AR1 (340 н.п.). В указанный образец ДНК вводится изотопная метка описанным ранее методом замещения. После гибридизации на колониях положительный сигнал обнаруживается особенно четко на нескольких колониях, одна из которых pYAla05.

Препараты хромосом готовят в культуре лимфоцитов периферической крови, стимулированных к делению с помощью фитогемаглютинина (фирма "Difco", США) в пенициллиновых флаконах при 37^oC в среде Игла с добавлением до 20% бычьей сыворотки в течение 74 ч. За 1 ч до конца культивирования вводят колхицин в концентрации 0,5 мкг/мл. Клетки в среде культивирования переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в гипотоническом растворе 0,07 М KCl и инкубируют 10 мин при 13^oC. Фиксацию проводят метанол-уксусным фиксатором (в соотношении 3:1) трижды по 20 мин. Препараты хромосом хранят при 37^oC и используют в опытах не позднее 2-3-х недель после приготовления.

Образцы ДНК для гибридизации на хромосомах in situ метят изотопной меткой методом замещения: в 100 мкл деионизированной воды растворяют последовательно 15 мкл десятикратного буферного раствора (0,8 М трис-HCl, pH 7,4; 0,1 М MgCl₂); 0,05 М дитиотреитол, 5 мкл нерадиоактивных дезоксинуклеозидтрифосфатов в эквимолярной смеси (по 0,1 мМ каждого за исключением ³H-тимидинтрифосфата), 5 мкл ДНК-азы-1 (концентрация 1 мкг/мл), 10 мкл ³H-тимидинтрифосфата (удельная активность 114 Ки/моль, концентрация 5 мКи/мл), мкл ДНК-полимеразы 1 (концентрация 2 ед./мкл). Объем реакционной смеси составляет 150 мкл. Реакцию ведут 20-40 мин при 20^oC. Средняя удельная радиоактивность меченых препаратов ДНК около 25•10⁶ импульсов в 1 мин в расчете на 1 мкг ДНК.

Гибридизацию меченной радиоактивными предшественниками рекомбинантной ДНК pYAla05 с метафазными хромосомами in situ проводят с предварительной денатурацией в течение 30 с в 0,07 Н NaOH с последующей промывкой по 10 мин в 70 и 96%-ном этиловом спирте. Препараты радиоактивных образцов ДНК денатурируют в гибридизационной смеси, содержащей 50% формамида, 10% декстрансульфата-500 и стандартный солевой раствор (2•SSC), в течение 10 мин при 100^oC. Гибридизацию проводят при 37^oC в течение 17-18 ч. Препараты после проведения гибридизации промывают в двух сменах 2• SSC при 37^oC, в двух сменах 2•SSC при комнатной температуре, в 70-96%-ном этиловом спирте по 15 мин в каждой смене. После высушивания на воздухе препараты покрывают фотоэмульсией типа М и экспонируют в темноте до 10 дней. После проявления стандартным амидоловом проявителем в течение 2 мин препараты тщательно промывают проточной водой и окрашивают 3%-ным раствором красителя Романовского-Гимза в 0,02 М фосфатном буфере (pH 6,8) в течение 10-15 мин. Радиоавтографы анализируют и фотографируют под микроскопом при увеличении 1000^x или 1125^x.

Гибридизация in situ на метафазных хромосомах человека показывает, что клонированный фрагмент pYAla05 локализуется только в прицентромерном районе 3-ой пары гомологичных хромосом человека и является таким образом специфическим молекулярным маркером данной пары хромосом, специфически маркирующим околоцентромерный район.

Пример 2. Особенно важным является применение предлагаемого молекулярного маркера для распознавания 3-й хромосомы в тех случаях, когда эта хромосома (один из гомологов данной пары) затронута перестройкой, т.е. имеет потерю или добавку какого-либо участка хромосомного материала, что сказывается на размере 3-й хромосомы и ее форме.

Все процедуры по выделению образца ДНК pYAla05 и его обработки с изотопной меткой для гибридизации на метафазных хромосомах in situ, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично примеру 1. Отличие только в том, что в примере 1 используются препараты нормального хромосомного набора от здорового донора мужского пола, тогда как в примере 2 используется препараты хромосомного набора носителя сбалансированной транслокации (переноса) более 3/4 длинного плеча 3-й хромосомы на конец длинного плеча 17-й хромосомы. В результате такой транслокации длинное плечо 3-й хромосомы значительно укорочено и при обычном визуальном осмотре метафазной пластинки с данной перестройкой под микроскопом диагностика данного нарушения (потери хромосомного материала) практически невозможна. Однако с помощью молекулярного маркера pYAla05 для 3-й хромосомы гомологичный партнер с укороченным длинным плечом в этой паре и потеря хромосомного материала в нем легко распознаются непосредственно под микроскопом.

Пример 3. Важной иллюстрацией практического применения молекулярного маркера pYAla05 для 3-й хромосомы является опыт по идентификации присутствия этой хромосомы в клеточном ядре непосредственно по картине интерфазных (неделящихся) ядер. Как известно, хромосомы человека анализируются только в метафазе митоза после специальных обработок, облегчающих подсчет и анализ морфологии хромосом. Исключением являются половая X-хромосома, наличие которой в норме можно установить по определению в интерфазном ядре компактного тельца полового хроматина, образованного одной их двух X-хромосом в женском наборе, а также половая Y-хромосома, которую определяют как ярко флюоресцирующее тельце, окрашенное акрихин ипритом, в интерфазном ядре мужчин с нормальным хромосомным набором. Однако с помощью молекулярного маркера pYAla05, специфически маркирующего только 3-ю хромосому человека, наличие данной хромосомы в клеточном ядре можно устанавливать без приготовления препаратов метафазных хромосом, а лишь по анализу изображения интерфазных ядер. Это обусловлено тем, что образец ДНК pYAla05 гибридизуются с ДНК прицентромерной области 3-й хромосомы и в том случае, когда эта хромосома находится в расплетенном состояние на стадии интерфазы. В этом случае в каждом интерфазном ядре можно видеть (после гибридизации и приготовления радиоавтографов) два практически одинаковых по размеру скопления /кластеров/ зерен серебра (сигналов изотопной метки). В редких случаях можно видеть в интерфазном ядре одно крупное скопление зерен метки, если гомологичные хромосомы расположены очень близко друг от друга.

Все процедуры по выделению образца pYAla05 и его обработки с изотопной меткой для гибридизации на интерфазных ядрах, а также все процедуры по приготовлению препаратов метафазных хромосом периферической крови и проведению гибридизации на хромосомах повторяются аналогично процедурам по примерам 1 и 2. В каждом интерфазном ядре обнаруживается два скопления гранул метки /два кластера/, соответствующих двум гомологичным хромосомам 3-й пары. В разных ядрах расстояния между кластерами различны. Таким образом появляется реальная возможность непосредственно в интерфазных ядрах анализировать расположение гомологичных партнеров конкретной пары хромосом в клетках человека, что представляет собой научный интерес с точки зрения функциональной организации наследственных структур человека.

Таким образом, клонированная последовательность ДНК pYAla05 из генома человека является эффективным инструментом для распознавания 3-й хромосомы человека как в стандартных (после культивирования клеток) препаратах нормальных хромосомных наборов или в случаях с перестройками 3-й хромосомы, так и в цитологических (без культивирования клеток) препаратах интерфазных ядер. Указанные возможности расширяют область применения хромосомного анализа в практике клинической генетики, медико-генетического консультирования и пренатальной диагностики в случаях перестроек 3-й хромосомы человека, а также при анализе анеуплоидий по хромосоме 3 при различных формах рака.

Возможно эффективное применение предлагаемого способа в анализе гибридных клеточных линий, широко используемых для цитогенетического картирования нормальных и мутантных генов человека.

Использование: в генетической инженерии, медицинской генетике. Сущность изобретения: сконструирована рекомбинатная плазмида PYAIa0,5 для маркирования и идентификации третьей хромосомы человека, которая состоит из PstI-PstI фрагмента векторной плазмиды pUC. 19 и PstI-PstI - фрагмента альфоидной ДНК лимфоцитов человека размером 2,0 т.п.о., обладающего высокой специфичностью по отношению к центромерному району третьей хромосомы человека.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pYAla 05 для маркирования и идентификации третьей хромосомы человека размером 5,6 т.п.о. состоящая из PstI PstI фрагмента размером 2,7 т.п.о. вектора pUC 19 и PstI PstI фрагмента размером 2,9 т. п. о. альфоидной ДНК лимфоцитов человека, высокоспецифичного для центромерного района третьей хромосомы человека и включающего 11 сайтов рестрикции EcoRI, содержащая Amp^r ген устойчивости к ампициллину.