НОВЫЙ ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ ДАПТОМИЦИНА STREPTOMYCES BAARNENSIS Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12P1/06 A61P31/04 C12R1/465 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и касается нового штамма-продуцента антибиотика даптомицина.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Даптомицин - антибиотик из группы циклических липопептидов. Активен в отношении клинически значимых грамположительных бактерий, включая штаммы, устойчивые к другим классам антимикробных препаратов. На сегодняшний день на территории Российской Федерации даптомицин применяется при осложненных инфекциях кожи и мягких тканей, при инфекциях кровотока, вызванных Staphylococcus aureus, включая бактериемию и правосторонний эндокардит (Данилов А.И. и др. Даптомицин: возможности и перспективы применения в клинической практике // Отзывы по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2019. - 17 (4): 83-87).

Из уровня техники известен мутантный штамм Streptomyces roseosporus BS_094 (регистрационный номер KACC91589P), полученный путем мутации дикого штамма Streptomyces roseosporus KCTC 9568 в качестве исходного штамма. Штамм BS_094 способен продуцировать даптомицин с максимальным выходом 2,5 г/л (KR20120058790, 01.10.2010).

Также известен штамм продуцент-даптомицина Streptomyces griseus, депонированный в Общем центре управления коллекцией культур микроорганизмов Китая под номером CGMCC17921. Выход даптомицина после ферментации указанного штамма может достигать примерно 0,0315 г/л. (WO2021000637, 07.01.2021).

Выход даптомицина после ферментации штамма-продуцента Streptomyces filamentosus, депонированного в Китайском общем центре сбора микробиологических культур под номером CGMCC № 16016, который был рассмотрен авторами настоящего изобретения в качестве ближайшего аналога, может достигать примерно 3,47 г/л (CN110777084, 11.02.2020).

Известен рекомбинантный штамм-продуцент даптомицина Streptomyces roseospora L31, депонированный под номером CGMCC No.14233 в Общем центре микробиологии Комитета по сбору микробиологических культур Китая. Выход даптомицина после ферментации штамма может достигать примерно 0,074 г/л (CN107267434, 20.10.2017).

Из уровня техники известен высокопродуктивный мутагенизированный штамм Streptomyces roseosporus WKL-126 (в настоящее время хранится в Китайском общем центре сбора микробиологических культур (CGMCC) под регистрационным номером 3731), который имеет производительность антибиотика около 2 г/л (CN102242073, 16.11.2011).

Цель настоящего изобретения - получение нового штамма микроорганизма, превосходящего по уровню накопления в культуральной жидкости даптомицина известные ранее штаммы.

Техническим результатом заявленного изобретения является увеличение выхода антибиотика, сокращение времени ферментации, снижение количества примесей в субстанции, высокая биохимическая активность и повышенная устойчивость штамма к неблагоприятным факторам и при культивировании.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В процессе индуцированного мутагенеза и последующего ступенчатого отбора из штамма дикого типа, выделенного из образца дерново - луговой почвы (Мордовия), был выделен высокопродуктивный штамм Streptomyces baarnensis DAP 17-18, продуцирующий антибиотик даптомицин.

Для повышения секреции даптомицина штамм дикого типа подвергался индуцированному мутагенезу путем воздействия на него ультрафиолета при низких температурах. Полученному высокопродуктивному штамму был присвоен внутренний номер DAP 17-18.

Далее штамм DAP 17-18 был идентифицирован по макро- и микроморфологическим признакам, а родовая принадлежность была подтверждена секвенированием гена 16S рДНК.

По результатам анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм оказался наиболее близок к виду Streptomyces baarnensis.

Полученный новый штамм Streptomyces baarnensis был депонирован в Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Ас-2200.

Таким образом, одним из вариантов настоящего изобретения является штамм продуцент даптомицина Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200. Другим вариантом настоящего изобретения является применение штамма Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200 для получения антибиотика даптомицина. Еще одним из вариантов настоящего изобретения является способ получение антибиотика даптомицина, который заключается в том, что осуществляют культивирование штамма Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200 и очистку даптомицина от культуральной жидкости.

ТЕРМИНЫ и ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Ниже приведены термины, которые могут использоваться при описании настоящего изобретения. Если не указано иное, все технические и специальные термины, использованные в описании, имеют общепринятое в данной области техники значение.

Термин «антибиотик» включает в себя молекулу, которая может ингибировать рост, разрушать или приводит к гибели микроорганизмов, но не является смертельным для пациента в интервалах концентрации и дозировании, предполагаемых для введения. Согласно настоящему изобретению указанные антибиотики могут быть классифицированы как бактерицидные (т.е., непосредственно приводящие к гибели микроорганизма) или бактериостатические (т.е. предотвращающие деление и/или размножение микроорганизма). В контексте настоящего изобретения антибиотик не является токсичным для пациента, в интервалах вводимых концентраций и дозирования.

Использование термина «антибиотический» в контексте настоящего изобретения означает эффект или тип воздействия в лечении или профилактике инфекций, вызванных грамотрицательными и/или грамположительными бактериями.

Термин «биомасса» в контексте настоящего изобретения относится к совокупной массе клеток Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200, отделенных в процессе центрифугирования от супернатанта культуральной жидкости, полученной в результате культивирования, в том числе, в качалочных колбах или биореакторах (например, при культивировании батарейным способом).

Термин «культуральная жидкость» в контексте настоящего изобретения означает двухфазную газожидкостную питательную (или ферментационную) среду, в которую в процессе глубинного культивирования микроорганизмы выделяют продукты метаболизма (в т.ч. вторичные метаболиты).

Термин «биореактор» в контексте настоящего изобретения относится к сосуду или устройству, в котором осуществляются процесс глубинного культивирования микроорганизмов для наработки целевого продукта (в рамках настоящего изобретения, антибиотика даптомицина).

Термин «продуктивность штамма» в контексте настоящего изобретения относится к количеству полученного антибиотика, рассчитанному на единицу объема культуральной жидкости, при глубинном культивировании штамма (по настоящему изобретению Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200) в условиях биореактора, выраженному в граммах антибиотика на литр культуральной жидкости.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано посредством двух фигур.

На Фиг. 1 изображены основные этапы скрининга штамма Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200 и наработки даптомицина из его культуральной жидкости, полученной после глубинного культивирования.

На Фиг. 2 изображен снимок фиксированного, окрашенного метиленовым синим препарата. Увеличение в 1000 раз.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложен новый штамм-продуцент даптомицина - штамм Streptomyces baarnensis депонирован в Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Ас-2200.

Культурально-морфологические признаки штамма продуцента даптомицина: аэроб, окраска по Граму - положительная, через 8-10 суток культивирования на плотной среде образует типичные полностью спорулирующие колонии светло-розового цвета. Подошва колонии - тёмно-розового, почти бордового цвета. Форма колонии - круглая, часто - с центральным перевёрнутым куполом и круглым внешним валиком (короной), размер 4-8 мм.

Для хранения и приготовления посевного материала используется среда следующего состава, г/л: глюкоза - 1.0-3.5; сахароза 1.0-2.0; крахмал 1.0-3.0; солодовый экстракт - 5.0-20.0; дрожжевой экстракт - 2.0-6.0, карбонат кальция - 1.0-1.5; агар-агар - 10.0-30.0; рН среды до стерилизации - 5.0-8.0. Температура культивирования - 25-35°С, продолжительность - 8-10 суток.

ПРИМЕРЫ

Изобретение поясняется следующими иллюстративными примерами, которые не ограничивают заявленный объем охраны.

Пример 1. Способ селективного выделения из штамма-продуцента даптомицина из образца почвы.

Объектами исследования были образцы дерново-луговой почвы. Образцы почвы были отобраны в Республике Мордовия в летний период из верхних горизонтов почвы.

Для выделения штамма дикого типа - продуцента даптомицина из образцов почв использовали метод посева на твердые питательные среды. Гомогенизированный образец почвы массой 1 г помещали в колбу со 100 мл воды для инъекций, далее готовили разведение 1:300 и проводили посев на чашки с питательной средой Гаузе 1. В питательную среду добавляли антибиотики для ограничения роста и активности нежелательных микроорганизмов.

Посевы инкубировали при температурах 20-30°С до появления видимых колоний. Чистую культуру выводили путем последовательных пересевов до единичной колонии. Контроль чистоты культуры проводили микроскопически.

Пример 2. Получение высокопродуктивного штамма-продуцента даптомицина.

Путем многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов и направленных методов отбора модификантов родительского дикого штамма был получен новый высокопродуктивный штамм - продуцент даптомицина DAP 17-18.

Для этого осуществляли воздействие УФ с длиной волны 250 нм (лампа Mineralight) водной суспензии спор и клеток родительского штамма, размещенного на расстоянии 55 см от лампы, в течение 20 минут при температуре 0°C. Полученному штамму был присвоен внутренний номер DAP 17-18. Результат микроскопических методов исследований представлен на Фиг. 2.

Пример 3. Идентификация штамма DAP 17-18 до вида с помощью анализа 16s РНК.

Выделение ДНК штамма DAP 17-18 для ПЦР проводили по стандартной методике (PCR Protocols. A Guide to methods and applications. Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15).

Для секвенирования использовали консервативные праймеры для наработки 16S rDNA:

8f - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG

926r - CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT

Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе АЕ3000 с режимами реакции:

1. 95°С – 3 мин

2. 35 циклов

95°С - 30 с

57°С - 30 с

72°С - 1 мин 30 с

3. 72°С - 5 мин.

Для анализа секвенированных последовательностей использовали специализированные филогенетические компьютерные программы. Для стабильности воспроизведения результатов проводили не менее трех повторов ПЦР-реакций.

Далее проводили электрофорез ПЦР исследуемых образцов в 1,0% агарозном геле, при напряженности электрического поля 5 В/см.

Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам: Bacteria; Actinobacteria; Streptomycetales; Streptomycetaceae; Streptomyces.

Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank.

Обработку секвенированных последовательностей проводили при помощи биоинформатического программного обеспечения в открытом доступе - программы Blast (Basic Local Alignment Search Tool), предназначенной в т.ч. для определения степени филогенетической близости живых организмов.

По результатам анализа последовательностей вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм DAP 17-18 оказался наиболее близок к виду Streptomyces baarnensis.

Пример 4. Методика культивирования.

Проводили подготовку посевного материала путем посева культуры Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200 в чашках Петри. Для этого агаризованную среду засевали исходной посевной культурой и инкубировали в термостате от 5 до 12 суток при температуре 25-34°С.

Далее проводили наработку культуры в колбах в жидкой среде в при 25-34°С в течение 24-48 часов на термостатируемой качалочной установке при 200-300 об/мин.

Далее проводили наработку посевной культуры в ферментере объемом 5/15 л, для этого проводили засев ферментера путем внесения посевной культуры в количестве 5-15% от объема среды в ферментере, при непрерывной подаче стерильного воздуха во время культивирования при перемешивании в течении 110-170 часов.

Контроль содержания антибиотика проводили методом ВЭЖХ. При максимальном накоплении антибиотика в среде процесс ферментации прекращали.

Пример 5. Определение содержания даптомицина в культуральной жидкости методом ВЭЖХ.

Анализ содержания даптомицина в культуральной жидкости методом ВЭЖХ проводили на колонке С18, 100 Å, 250*4,6 мм, 5 мкм; подвижная фаза А - 0,1 % ацетонитрила в 0,1 % водном растворе трифторуксусной кислоты. Подвижная фаза В: 0,1 % изопропилового спирта и 0,1 % подвижной фазы А в ацетонитриле скорость потока -1,5 мл/мин; длина волны детектирования - 214 нм.

Полученные усредненные данные представлены в Табл. 1.

Таблица 1. Выход целевого продукта при глубинном культивировании Штамм Продуктивность штаммов (г/л культуральной жидкости ±0,2 г/л) в ферментере объемом 5 литров в ферментере объемом 15 литров Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200 5,3
5,7
5,4 6,6
6,8
6,4

Согласно литературным данным выход даптомицина после ферментации штамма Streptomyces filamentosus CGMCC № 16016 может достигать примерно 3,47 г/л (CN110777084, 11.02.2020).

Результаты исследований позволяют сделать вывод о том, что штамм микроорганизма по настоящему изобретению обладает высоким биотехнологическим потенциалом, значительно увеличенной продуктивностью и может применяться для промышленного производства антибиотика даптомицина.

Пример 6. Методика выделения даптомицина.

После культивирования микроорганизма Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200 проводили отделение биомассы от культуральной жидкости с помощью микрофильтрации. Очищенную от биомассы культуральную жидкость переносили на стадию очистки, где проводили процесс ультрафильтрации, а отработанную биомассу утилизировали.

Очищенный раствор пропускали через колонку с гидрофобным сорбентом НР-20 дважды. Фракции элюирования анализировали методом ВЭЖХ. Фракции, содержащие даптомицин с чистотой не менее 90 %, объединяли и переносили порционно в колбу ротационного испарителя. Удаляли растворитель в вакууме при температуре не выше 35°С. Далее проводили процесс ультрафильтрации. Очищенный раствор даптомицина концентрировали при помощи системы обратного осмоса. Состав охлаждали и дополнительно фильтровали.

Группа изобретений относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200 – продуцент даптомицина. Предложено также применение указанного штамма для получения даптомицина. Культивируют указанный штамм и выделяют даптомицин из культуральной жидкости с последующей очисткой. Группа изобретений обеспечивает увеличение продуктивности штамма-продуцента даптомицина, сокращение времени культивирования, снижение количества примесей в субстанции антибиотика даптомицина, высокую биохимическую активность и повышенную устойчивость нового штамма к неблагоприятным факторам, в том числе при хранении и культивировании. 3 н.п. ф-лы, 2 ил., 1 табл., 6 пр.

1. Штамм Streptomyces baarnensis VKPM Ас-2200 – продуцент даптомицина.

2. Применение штамма по п.1 для получения даптомицина.

3. Способ получения даптомицина, включающий культивирование штамма по п.1 и выделение даптомицина из культуральной жидкости с последующей очисткой.