Штамм Streptomyces sp. KMM 9044 - продуцент соединений, обладающих антибактериальной активностью Российский патент 2022 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения соединений класса депсипептидов (ДП), обладающих антибактериальной активностью.

Уровень техники

Несмотря на успехи, связанные с применением существующих антибактериальных агентов, продолжает сохраняться потребность в новых антибиотиках. Для многих патогенов повторное взаимодействие с применяемыми антибиотиками, приводит к отбору вариантов штаммов, устойчивых к широкому спектру антибиотиков. Потеря силы и эффективности антибиотика, определяемые возникновением механизмов устойчивости, приводит к неэффективности антибиотика и, следовательно, может вести к некоторым угрожающим жизни инфекциям, которые практически не поддаются лечению. Как только на рынке появляются и начинают применяться новые антибиотики, микроорганизмы начинают эволюционировать в сторону развития устойчивости к данным новым лекарствам, эффективно создавая потребность в создании новых антибактериальных агентов для борьбы с данными возникающими штаммами.

Депсипептиды - это антибактериальные агенты, которые относятся к нерибосомальным пептидам, которые синтезируются с помощью ферментных комплексов пептид-синтетаз, состоящих из повторяющихся доменов с модульной организацией для активации и связывания аминокислот. Основными продуцентами природных ДП являются почвенные бактерии, морские организмы и грибы. Эти соединения могут обладать антибактериальной, иммуномодулирующей, противоопухолевой активностью, а также эффективны против различных микроорганизмов и гельминтов.

Так, из уровня техники известен циклический депсипептид тейксобактин, открытый в 2015 г как метаболит почвенной β-протеобактериии Eleftheria terrae [Ling, L.L., Schneider, Т., Peoples, A.J., Spoering, A.L., Engels, I., Conlon, B.P., Mueller, A., Schaberle, T.F., Hughes, D.E., Epstein, S., Jones, M., 2015. A new antibiotic kills pathogens without detectable resistance. Nature 517 (7535), 455-459], а впоследствии синтезированный [Karas JA, Chen F, Schneider-Futschik EK, Kang Z, Hussein M, Swarbrick J, Hoyer D, Giltrap AM, Payne RJ, Li J, Velkov T. Synthesis and structure-activity relationships of teixobactin. Ann N Y Acad Sci. 2020 Jan; 1459(1): 86-105. doi: 10.1111/nyas.14282], является перспективным кандидатом на разработку лекарственного средства [Teixobactin and preparation method thereof (патент CN107266531A)].

Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является штамм-продуцент антимикробных соединений Streptomyces roseosporus, из культуральной жидкости которого был выделен циклический депсипептид даптомицин как самый активный компонент смеси соединений с 13-членным аминокислотным циклом. Пройдя все стадии изучения, он был зарегистрирован как лекарственный препарат [Tedesco KL, Rybak MJ. Daptomycin. Pharmacotherapy. 2004 Jan; 24(1):41-57. Review.]. Даптомицин проявлял высокую активность in vitro против Грам-положительных бактерий - энтерококков, включая устойчивые к ванкомицину (VRE), стафилококков, включая устойчивые к метициллину (MRSA), стрептококков и коринебактерий. Известно изобретение, относящееся к улучшению способа очистки даптомицина (патент RU 2348647 С2, опубл. 10.03.2009).

На основании анализа гена 16S рРНК и полных геномов штаммы Streptomyces sp. KMM 9044 и S. roseosporus NRRL 11379 принадлежат к разным видам рода Streptomyces (16S рРНК - 98.15%, ANI - 77.37%, dDDH - 22.50%) и имеют характерные фенотипические признаки для представителей этого рода.

Вместе с тем, в настоящее время не известны точные аналоги (штаммы-продуценты) нового антибактериального соединения, стрептоциннамида, активного в отношении грамположительных бактерий.

Поскольку в получении депсипептидных соединений важную роль играют микроорганизмы, получение штаммов-продуцентов новых ДП является актуальной задачей в борьбе с антибиотикорезистентностью патогенных бактерий.

Задачей, решаемой с помощью заявляемого изобретения, является получение штамма-продуцента антимикробных соединений класса депсипептидов с высоким выходом, обладающих высокой активностью.

Для решения этой задачи предлагается штамм Streptomyces sp. КММ 9044 из коллекции морских микроорганизмов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Тихоокеанский институт биоорганической химии им. Г.Б. Елякова дальневосточного отделения Российской академии наук (ТИБОХ ДВО РАН), справка о депонировании №16146-203 от 19.05.2022 - продуцент соединений, обладающих антибактериальной активностью, а также применение указанного штамма для получения соединений, обладающих антибактериальной активностью.

Техническим результатом заявляемого изобретения является получение штамма-продуцента новых депсипептидных соединений, обладающих антибактериальной активностью.

Раскрытие сущности изобретения

Штамм Streptomyces sp. KMM 9044 относится к роду Streptomyces (семейство Streptomycetaceae, класс Actinobacteria).

Штамм Streptomyces sp. КММ 9044 выделен из образца грунта, отобранного в прибрежной зоне в бухте Джигит, Японское море, Россия, 26.10.2009. Штамм выделен методом прямого посева суспензии грунта на агаризованную среду SWM с добавлением морской воды следующего состава (г/л): пептон - 5.0; гидролизат казеина - 2.0; дрожжевой экстракт - 2.5; глюкоза - 1.0; K₂HPO₄ - 0.2; MgSO₄ - 0.05; 500 мл дистиллированной воды, 500 мл морской воды.

Штамм Streptomyces sp. KMM 9044 выращивали при 28°С на плотных и жидких питательных средах следующего состава (г/л):

1) среда SWM: пептон - 5.0, растворимый крахмал - 10.0, глюкоза - 1.0, дрожжевой экстракт - 2.5, K₂HPO₄ - 0.2, MgSO₄ - 0.05, морская вода - 500 мл, дистиллированная вода - 500 мл, рН 6.8.

2) среда ISP4: растворимый крахмал - 10.0, K₂HPO₄ - 1.0, MgSO₄x7H₂O - 1.0, NaCl - 1.0, (NH4)₂SO₄ - 2.0, СаСО₃ - 2.0, FeSO₄x6H₂O - 0.001, MnCl₂x7H₂O - 0.001, ZnSO₄x7H₂O - 0.001, глюкоза - 2.0, дистиллированная вода - до 1 л, рН 7.3.

3) среда ISP4 с добавлением NaBr - 8.0 г/л, рН 7.3.

4) среда Sucrose yeast (SY): сахароза - 40.0; дрожжевой экстракт - 5.0; K₂HPO₄ - 1.5; MgSO₄x7H₂O - 3.1; NaCl - 2.0; (NH₄)₂SO₄ - 2.0; СаСО₃ - 4.0; FeSO₄x6H₂O - 0.001; MnCl₂x7H₂O - 0.001; глюкоза - 2.0, дистиллированная вода - до 1 л, рН 6.8.

5) среда SY без добавления СаСО₃, рН 6.8.

6) Marine Broth 2216 (Sigma-Aldrich): пептон - 5.0, дрожжевой экстракт - 1.0, цитрат железа - 0.1, хлорид натрия - 19.45, хлорид магния - 5.9, сульфат магния - 3.24, хлорид кальция - 1.8, хлорид калия - 0.55, бикарбонат натрия - 0.16, бромид калия - 0.08, хлорид стронция - 0.034, борная кислота - 0.022, силикат натрия - 0.004, фторид натрия - 0.0024, нитрат аммония - 0.0016, динатрий фосфат - 0.008, рН 7.6.

7) TSB (Sigma-Aldrich): триптон - 17.0, соевый пептон (сойтон) - 3.0, глюкоза - 2.5, хлорид натрия - 5.0, фосфат калия - 2.5, рН 6.8.

Штамм Streptomyces sp. KMM 9044 выращивали на чашках Петри в течение 7-8 сут при температуре 28°С, поддерживали на агаризованной среде SY, хранили не более трех месяцев при температуре около 4°С в холодильной камере. Длительное хранение культуры осуществляли в жидком глицерине при -70°С.

На всех вышеуказанных средах колонии изученного штамма KMM 9044 желтые или светло-желтые, выпуклые, плотные, непрозрачные, складчатые с неровным краем, врастающие в агар. Белый воздушный мицелий образуется на среде Sucrose yeast в течение 5-7 суток. Вегетативные и воздушные гифы слабо или интенсивно фрагментируются с возрастом на палочковидные неподвижные элементы. Морфология изученных штаммов характерна для описанных видов стрептомицетов.

Штамм Streptomyces sp. КММ 9044 представляет собой аэробные галотолерантные бактерии, растущие при содержании хлористого натрия в среде 0-6% и при температуре 15-37°С. Бактерия КММ 9044 гидролизует казеин, крахмал, твин-40, твин-80 и ДНК, и показала отрицательные реакции на нитратредукцию, гидролиз желатина, деградацию тирозина, гидролиз целлюлозы, ксантина, гипоксантина и продукцию сероводорода из тиосульфата натрия.

Штамм Streptomyces sp.КММ 9044 продуцирует стрептоциннамиды А и Б (Scm A, Scm В), показывающие антимикробную активность в отношении Micrococcus luteus. Общий выход вещества составляет 3-5 мг на 1 л культуральной жидкости (КЖ). Количество извлекаемого продукта и соотношение компонентов Scm А и Scm В в образцах может варьировать из-за влияния разных факторов на продукцию штамма.

Биотехнология получения Scm А и Scm В состоит из следующих этапов.

1. Подготовка посевного материала.

2. Выращивание посевного материала 1-й генерации.

3. Выращивание посевного материала 2-й генерации (второго инокулята).

4. Культивирование в ферментере.

5. Отделение КЖ от биомассы.

6. Подготовка сорбционного картриджа.

7. Нанесение КЖ на полимерный сорбент.

8. Элюирование с картриджа.

9. Идентификацию компонентов.

10. Очистка субстанции.

11. Получение сухого продукта.

Краткое описание поясняющих материалов

Таблица 1 - Значения ANI (внизу) и dDDH (вверху) между геномами штамма Streptomyces sp. КММ 9044 и наиболее близкими типовыми штаммами известных видов Streptomyces, %.

Таблица 2. Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) соединений I и II

Рис. 1. Структура (I), вместе с данными ЯМР. Протонные, углеродные и азотные химические сдвиги при 30С в CDCl₃ показаны красным, голубым и зеленым цветом соответственно.

Рис. 2. Различающиеся фрагменты структуры компонентов (I) и (II) и ЯМР данные для этих фрагментов.

Рис. 3а - Спектры MS1 молекулярного иона Scm A(Z) [М+Н]+ и [M+Na]+,

Рис. 3б - спектр MS2 молекулярного иона [М+Н]+ при 1190.4234,

Рис. 3в - схема фрагментации родительского иона.

Рис. 4а - спектр MS2 молекулярного иона Scm B(Z) [М+Н]+ при 1154.4461,

Рис. 4б - схема фрагментации родительского иона.

Осуществление изобретения

Пример 1. Получение и характеристики штамма

Штамм Streptomyces sp.КММ 9044 культивировали в лабораторных условиях при 28°С на плотных и жидких питательных средах нескольких составов (см. выше).

Штамм выращивали на чашках Петри в течение 7-8 суток при температуре 28°С, поддерживали на агаризованной среде SY, хранили не более трех месяцев при температуре около 4°С в холодильной камере. Длительное хранение культуры осуществляли в жидком глицерине при -70°С.

На основании анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генов 16S рРНК штамм относится к роду Streptomyces (семейство Streptomycetaceae, класс Actinobacteria), наиболее близок к известным видам S. pseudovenezuelae DSM 40212^T (98.97% сходства), S. variegatus NRRL В-16380^T (98.96%), S. cahuitamycinicus 13K301^T (98.96%), S. qaidamensis S10^T (98.83%), S cacaoi subsp.asoensis NRRL В-16592^T (98.76%), S. phaeoluteigriseus DSM 41896^T (98.76%), S. adustus WH-9^T (98.69%) и S. humidus NBRC 12877^T (98.69%).

Результаты анализа геномной сборки Streptomyces sp. КММ 9044 показали, что штамм имеет размер генома 7.15 млн п. н. и ГЦ-состав ДНК - 71.1 мол%.

Значения средней идентичности нуклеотидов (ANI) и ДНК-ДНК гибридизации in silico (dDDH) между геномами штамма KMM 9044 и наиболее близких известных видов (Таблица 1) не превышают пороговых значений ANI (95-96%) и dDDH (70%), предложенных для определения принадлежности штаммов к одному виду [Chun J., Oren A., Ventosa А., Christensen Н., Arahal D.R., da Costa M.S., Rooney A.P., Yi H., Xu X.W., De Meyer S., Trujillo M.E. 2018. Proposed minimal standards for the use of genome data for the taxonomy of prokaryotes. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 68(1):461-466].

Полученные нами нуклеотидная последовательность гена 16S рРНК и полного генома штамма КММ 9044 депонированы в базы данных DDBJ/ENA/GenBank.

Пример 2.

Технология получения Scm A, Scm В основана на культивировании штамма-продуцента КММ 9044 и извлечении субстанции из культуральной жидкости (КЖ) указанного штамма методом твердофазной экстракции и жидкостной хроматографии. Биотехнология состоит из следующих этапов.

1. Подготовка посевного материала. Штамм Streptomyces sp.KMM 9044 выращивали на чашках Петри в течение 7 сут при температуре 28°С на среде Sucrose yeast.

2. Выращивание посевного материала 1-й генерации (первого инокулята). Культуру переносили с поверхности агаризованной среды в колбу Эрленмейера объемом 750 мл с 50 мл питательной среды SY. Культивирование осуществляли при 28°С в течение 5 сут на термостатируемой качалке Innova 40 (New Brunswick Scientific) при 150 об/мин.

3. Выращивание посевного материала 2 генерации (второго инокулята). Посевную культуру второй генерации выращивали в среде SY в аналогичных условиях в течение 5 сут, используя для засева первый инокулят в количестве 5% об.

4. Культивирование в ферментере. Культивирование проводили в ферментере BIOSTAT A plus (Sartorius BBI Systems) объемом 2 л. В ферментер, содержащий 1350 мл стерильной среды SY, вносили посевной материал в объеме 10% (150 мл культуры на 1.5 л среды) и 150 мл стерильного раствора глюкозы с концентрацией 20 г/л (конечная концентрация 2 г/л). Культивирование проводили при температуре 28°С. Концентрацию растворенного кислорода (pO2) поддерживали на уровне 90%, скорость перемешивания составила 300 об/мин, количество стерильного воздуха, подаваемого в аппарат, - 1.5 л/мин, рН среды поддерживали в интервале 6.8 титрованием 25% раствором аммиака. Пеногаситель силикон (0.01%) вносили в конце первого дня культивирования. Продолжительность ферментации составила 43 ч.

5. Отделение КЖ от биомассы. Выращенную культуру центрифугировали на скорости 10000 rpm (центрифуга Beckman J2-21), после чего супернатант фильтровали. Были использованы стекловолоконные фильтры Whatman glass microfiber GF/A и MF-Millipore MCE membrane с диаметром пор 0.45 мкм. Полученный объем КЖ составил 1.2 л.

6. Подготовка сорбционного картриджа. Картридж заполняли полимерным сорбентом LPS-500-H, фракция 70 мкм (компании «Техносорбент») насыпным способом. Использовали картридж объемом 45 мл, вес сорбента около 7.5 г.

7. Нанесение КЖ на полимерный сорбент. Картридж промывали 150 мл ацетонитрила (АЦН) и активировали 150 мл дистиллированной воды с помощью перистальтического насоса Masterflex Easy-Load 11 при скорости потока 15 мл/мин. При той же скорости наносили КЖ; по окончании картридж промывали 150 мл воды. Картридж можно использовать повторно, но не более 5 раз.

8. Элюирование с картриджа с использованием флэш-хроматографа. Картридж присоединяли к линии подачи элюента хроматографа PuriFlash 5.250 и элюировали со скоростью 15 мл/мин смесью растворителей вода - АЦН (степень чистоты "для ВЭЖХ"). Содержание АЦН в элюенте было задано по следующей программе: начальный состав - 5%; 1 мин - 45%, 10 мин - 45%, 11 мин - 100%, 22 мин - 100%. Состав элюата контролировали с помощью УФ детектора при длине волны 290 нм. УФ профили имели два пика: мажорный пик в области 5-6 мин, отвечающий сумме нецелевых соединений, и минорный пик в области 13-15 мин, содержащий целевые соединения Scm А и Scm В, УФ спектр которых имеет максимум при 290 нм. Данную фракцию объемом около 30 мл собирали с помощью коллектора фракций.

9. Очистка субстанции. Очистку Scm А и Scm В проводили методом ВЭЖХ (хроматограф Шимадзу Нексера). Весь объем фракции после картриджа помещали в колбу роторного испарителя (Buchi Rotavapor), концентрировали примерно в 5 раз. К раствору добавляли раствор 0.1% уксусной кислоты - половину от полученного объема (в конкретном случае 30 мл концентрировали до 6 мл и добавляли 3 мл раствора уксусной кислоты). При наличии осадка раствор центрифугируют на скорости 10000 rpm, супернатант переносят в пробирки. Разделение проводят колонке полупрепаративного размера на сорбенте типа С18, фракция 5 или 10 мкм, при том же составе элюента, температуре термостата колонки и длине волны УФ детектора, как в п. 5. Расходы элюента и объем пробы, элюируемой за один цикл разделения, выбирают в зависимости от размера колонки. На колонке 9.2 х 150 мм проводили разделения порциями по 1.5 мл при скорости потока 3 мл/мин. Продолжительность каждого разделения составляет 20 мин. Для очистки всего объема фракции требуется повторить операцию несколько раз, в данном случае 6 раз.

10. Получение сухого продукта из растворов фракций. Растворы фракций объединяют, сливают в колбу и высушивают на роторном испарителе с минимальным подогревом или на лиофильной сушке с центрифугой типа MyVac. Общий выход вещества составляет 3-5 мг на 1 л КЖ. Количество извлекаемого продукта и соотношение компонентов Scm А и Scm В в образцах может варьировать из-за влияния разных факторов на продукцию штамма.

Для полученных соединений Scm А (структурная формула I) и, Scm В (структурная формула II) установлены структурные формулы по результатам ЯМР-спектроскопии (рис. 1, 2) и тандемной масс-спектрометрии высокого разрешения (рис. 3, 4).

Пример 3. Подтверждение антибактериальной активности полученных соединений.

Для тестирования были использованы штаммы Micrococcus sp. KMM 1467 из коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ им. Г.Б. Елякова, Arthrobacter sp. 21022 (АТСС) и Mycobacterium smegmatis АТСС 700084 из коллекции Lytech Co. Ltd.

Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) бактерий определяли серийными двукратными разведениями (0.1-10000 нг/мл) в бульоне 2YT (BD, США). МИК определяли, как наименьшую концентрацию, препятствующую росту тестируемого организма в 96-луночном планшете после 16 ч культивирования. Для Mycobacterium smegmatis МИК определяли через 60 ч культивирования. Минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) определяли, как наименьшую концентрацию, препятствующую повторному культивированию тест-организма через 24 ч инкубации. Длительное культивирование приводит к разложению Scm и к завышенным значениям МИК. Временной ход роста бактерий отслеживали при 800 нм с использованием многорежимного считывающего устройства Varioskan Flash (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США).

Оба варианта структур Scm А (I) и Scm В (II) имеют противомикробную активность, причем для репортерного штамма Micrococcus sp. KMM 1467 величины минимальных ингибирующих концентраций (МИК) были на уровне нг/мл: 6 нг/мл для Scm А и 2 нг/мл для Scm В, т.е. значения для эпокси-производного в несколько раз ниже, чем значения для хлор-производного.

В отношении других патогенов активность соединений была существенно ниже. Были измерены МИКи для Scm А (структура I). Результаты исследования представлены в табл. 2.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения соединений класса депсипептидов (ДП), обладающих антибактериальной активностью. Штамм Streptomyces sp. КММ 9044 из коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН справка о депонировании №16146-203 от 19.05.2022 - продуцент соединений, обладающих антибактериальной активностью, а также применение указанного штамма для получения соединений, обладающих антибактериальной активностью. Изобретение позволяет получить новые депсипептидные соединения, обладающие антибактериальной активностью. 2 н.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл., 3 пр.

1. Штамм Streptomyces sp. КММ 9044 из коллекции морских микроорганизмов ТИБОХ ДВО РАН, предназначенный для получения соединений, обладающих антибактериальной активностью.

2. Применение штамма по п. 1 для получения соединений, обладающих антибактериальной активностью.