НОВЫЙ ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ ВАНКОМИЦИНА AMYCOLATOPSIS KERATINIPHILA Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12P1/06 A61P31/04 C12R1/01 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и касается штамма-продуцента антибиотика ванкомицина.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Ванкомицин представляет собой трициклический гликозилированный нерибосомный пептидный антибиотик с разветвленной цепью и часто используется для профилактики и лечения инфекций, вызванных различными грамположительными бактериями.

В настоящее время ванкомицин используется для лечения инфекций, вызванных грамположительными микроорганизмами, резистентными к β-лактамным антибиотикам, а также при повышенной чувствительности или непереносимости β-лактамных соединений; псевдомембранозных колитов и энтероколитов, не поддающихся лечению метронидазолом; Clostridium difficile - ассоциированной диареи; для профилактики эндокардитов; для лечения инфекций костей и суставов, в том числе остеомиелитов; для противоинфекционной профилактики в травматологии при искусственном протезировании суставов; для лечения сепсиса, менингита, пневмоний, абсцессов легких, а также при некоторых заболеваниях кожи (Белоусов Д.Ю., и др., Сравнительная характеристика препаратов ванкомицина, зарегистрированных в РФ // Качественная Клиническая Практика. - 2009. - 4).

Основными продуцентами антибиотика ванкомицина считаются штаммы Amycolatopsis orientalis (P. Naga Padma; A. Bhaskar Rao; J. S. Yadav; Gopal Reddy. Optimization of fermentation conditions for production of glycopeptide antibiotic vancomycin by Amycolatopsis orientalis. - 2002.- 102-103(1-6), 395-405.). Из уровня техники также известны штамм продуцент ванкомицина Amycolatopsis orientalis (CN101608209, 23.12.2009) и Amycolatopsis orientalis ВКПМ Ac-1505, выбранные авторами изобретения в качестве прототипов.

Следует отметить, что род бактерий Amycolatopsis является важнейшим родом актиномицетов и представляет особый интерес, так как его представители являются важнейшими источниками образования разнообразных ценных биоактивных метаболитов, например, антибиотиков, в том числе ванкомицина. Род Amycolatopsis в настоящее время продолжает оставаться в центре внимания при поиске новых активных агентов для лекарственных средств (Kisil O.V. et al., Looking Back to Amycolatopsis: History of the Antibiotic Discovery and Future Prospects // Antibiotics (Basel).- 2021 Oct 15.-10(10):1254).

Группой исследователей был описан штамм Amycolatopsis keratiniphila subsp. keratiniphila D2 T разлагающий кератиновые побочные продукты крупного рогатого скота (Espersen R, et al., Two novel S1 peptidases from Amycolatopsis keratiniphila subsp. keratiniphila D2T degrading keratinous slaughterhouse by-products. Appl Microbiol Biotechnol. 2020 Mar;104(6):2513-2522).

Из уровня техники известна высокоэффективная CRISPR/Cas9-опосредованная система редактирования генома в продуцирующем ванкомицин штамме A. keratiniphila HCCB10007. Посредством удаления больших фрагментов ECO-0501 BGC удалось увеличить продукцию ванкомицина (Hu M, et al., CRISPR/Cas9-mediated genome editing in vancomycin-producing strain Amycolatopsis keratiniphila. Front Bioeng Biotechnol. 2023 Mar 3; 11: 1141176).

Цель настоящего изобретения - получение нового штамма микроорганизма, превосходящего по уровню накопления ванкомицина известные ранее штаммы.

Техническим результатом заявленного изобретения является увеличение продуктивности штамма-продуцента ванкомицина, сокращение времени культивирования, снижение количества примесей в субстанции антибиотика ванкомицина, высокая биохимическая активность и повышенная устойчивость нового штамма к неблагоприятным факторам, в том числе, при хранении и культивировании.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В процессе индуцированного мутагенеза и последующего ступенчатого отбора из штамма дикого типа, выделенного из образца дерново-подзолистой почвы (Мордовия) был получен высокопродуктивный штамм V-0509, продуцирующий антибиотик ванкомицин.

Для повышения секреции ванкомицина штамм дикого типа подвергался индуцированному мутагенезу в результате целенаправленного воздействия ультрафиолета при низких температурах. Полученному высокопродуктивному штамму был присвоен внутренний номер V-0509.

Далее штамм V-0509 был идентифицирован по макро- и микроморфологическим признакам, а родовая принадлежность была подтверждена секвенированием гена 16S рДНК.

По результатам анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм оказался наиболее близок к виду Amycolatopsis keratiniphila.

Полученный новый штамм Amycolatopsis keratiniphila депонирован в Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Ac-2192.

Таким образом, одним из вариантов настоящего изобретения является штамм продуцент ванкомицина Amycolatopsis keratiniphila VKPM Ac-2192. Другим вариантом настоящего изобретения является применение штамма Amycolatopsis keratiniphila VKPM Ac-2192 для получения антибиотика ванкомицина. Еще одним из вариантов настоящего изобретения является способ получения антибиотика ванкомицина, который заключается в том, что осуществляют культивирование штамма Amycolatopsis keratiniphila VKPM Ac-2192 и выделение ванкомицина из культуральной жидкости с последующей очисткой (Фиг.1).

ТЕРМИНЫ и ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Ниже приведены термины, которые могут использоваться при описании настоящего изобретения. Если не указано иное, все технические и специальные термины, использованные в описании, имеют общепринятое в данной области техники значение.

Термин «антибиотик» включает в себя молекулу, которая может ингибировать рост, разрушать или приводить к гибели микроорганизмов, но не является смертельным для пациента в интервалах концентрации и дозирования, предполагаемых для введения. Согласно настоящему изобретению указанные антибиотики могут быть классифицированы как бактерицидные (т.е., непосредственно приводящие к гибели микроорганизма) или бактериостатические (т.е. предотвращающие деление и/или размножение микроорганизма). В контексте настоящего изобретения антибиотик не является токсичным для пациента, в интервалах вводимых концентраций и дозирования.

Использование термина «антибиотический» в контексте настоящего изобретения означает эффект или тип воздействия в лечении или профилактике инфекций, вызванных грамотрицательными и/или грамположительными бактериями.

Термин «биомасса» в контексте настоящего изобретения относится к совокупной массе клеток Amycolatopsis keratiniphila VKPM Ac-2192, отделенных в процессе центрифугирования от супернатанта культуральной жидкости, полученной в результате культивирования, в том числе, в качалочных колбах или биореакторах (например, при культивировании батарейным способом).

Термин «культуральная жидкость» в контексте настоящего изобретения означает газожидкостную питательную (или ферментационную) среду, в которую в процессе глубинного культивирования микроорганизмы выделяют продукты метаболизма (в т.ч. вторичные метаболиты).

Термин «биореактор» в контексте настоящего изобретения относится к сосуду или устройству, в котором осуществляются процесс глубинного культивирования микроорганизмов для наработки целевого продукта (в рамках настоящего изобретения, антибиотика ванкомицина).

Термин «продуктивность штамма» в контексте настоящего изобретения относится к количеству полученного антибиотика ванкомицина, рассчитанному на единицу объема культуральной жидкости, при глубинном культивировании штамма Amycolatopsis keratiniphila VKPM Ac-2192 в условиях биореактора, выраженному в граммах ванкомицина на литр культуральной жидкости.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано посредством Фиг. 1.

На Фиг. 1 изображены основные этапы скрининга штамма Amycolatopsis keratiniphila VKPM Ac-2192 и наработки ванкомицина из его культуральной жидкости, полученной после глубинного культивирования.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложен новый штамм продуцент ванкомицина - штамм Amycolatopsis keratiniphila, депонированный в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Ac-2192.

Культурально-морфологические признаки штамма продуцента ванкомицина:

Аэроб, окраска по Граму - положительная; на плотной среде нижеуказанного состава через 5-12 суток культивирования образует колонии от белого до молочного цвета, конической формы, диаметром 3-5 мм, приподнятые над агаром, с волнистыми краями и неровной поверхностью.

Для хранения и приготовления посевного материала используется среда следующего состава, г/л: соевый пептон - 8.0 - 12.0; растворимый крахмал - 7.0 - 9.0; глюкоза - 1.0 - 4.0; агар-агар - 18.0 - 20.0; вода очищенная; рН среды 6.9±0.3.

Условия культивирования для выделения единичных колоний: - 5-12 суток, при температуре 25-34°С.

ПРИМЕРЫ

Изобретение поясняется следующими иллюстративными примерами, которые не ограничивают заявленный объем охраны.

Пример 1. Способ селективного выделения Amycolatopsis keratiniphila из образцов почв.

Объектами исследования были образцы дерново-подзолистой почвы, отобранные в Республике Мордовия в летний период из верхних горизонтов почвы.

Для выделения штамма дикого типа - продуцента ванкомицина из образцов почв использовали метод посева на твердые питательные среды. Гомогенизированный образец почвы массой 1 г помещали в колбу со 100 мл воды для инъекций, далее готовили разведение 1:300 и проводили посев на чашки с питательной средой Гаузе 1. В питательную среду добавляли антибиотики широкого спектра для ограничения роста и активности нежелательных микроорганизмов.

Посевы инкубировали при температурах 20 - 30°С до появления видимых колоний с морфологией, характерной для данного штамма. Чистую культуру выводили путем последовательных пересевов до единичной колонии. Контроль чистоты культуры проводили микроскопически.

Пример 2. Получение высокопродуктивного штамма-продуцента ванкомицина.

Путем многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов и направленных методов отбора модификантов штамма дикого типа был получен новый высокопродуктивный штамм - продуцент ванкомицина V-0509.

Для этого проводили облучение УФ с длиной волны 250 нм (лампа Mineralight) водной суспензии спор и клеток штамма дикого типа, размещенного на расстоянии 55 см от лампы в течение 20 минут при температуре 0°C. Полученному штамму был присвоен внутренний номер V-0509.

Пример 3. Идентификация штамма V-0509 до вида с помощью ПЦР-анализа 16sРНК.

Выделение ДНК штамма V-0509 для ПЦР проводили по стандартной методике (PCR Protocols. A Guide to methods and applications. Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15.

Для секвенирования использовали консервативные праймеры для наработки 16S rDNA -

8F - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG

926R - CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT

Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе АЕ3000 с режимами реакции:

1. 95°С - 3мин.

2. 35 циклов

95°С - 30 сек.

57°С - 30 сек.

72°С- 1 мин. 30 сек.

3. 72°С - 5мин

Для анализа секвенированных последовательностей использовали специализированные филогенетические компьютерные программы. Для стабильности воспроизведения результатов проводили не менее трех повторов ПЦР-реакций.

Далее проводили электрофорез ПЦР исследуемых образцов в 1,0% агарозном геле, при напряженности электрического поля 5 В/см.

Согласно базе данных GenBank, исследуемый штамм относился к следующим систематическим группам: Bacteria; Actinobacteria; Micromonosporales; Micromonosporaceae; Actinoplanes.

Последовательности были выровнены в соответствии с последовательностями ближайших видов бактерий, доступными в базе данных GenBank.

Также обработку секвенированных последовательностей проводили при помощи модуля программы BLAST (Basic Local Alignment Search Tool), предназначенной в том числе для определения степени филогенетической близости микроорганизмов.

По результатам анализа последовательностей вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, исследуемый штамм V-0509 был наиболее близок к штаммам вида Amycolatopsis keratiniphila.

Пример 4. Методика культивирования.

Проводили подготовку посевного материала путем посева культуры Amycolatopsis keratiniphila VKPM Ac-2192 на чашках Петри. Для этого агаризованную среду засевали исходной посевной культурой, и выдерживали в термостате от 5 до 12 суток, при температуре 25-34°С.

Дальнейшее культивирование осуществляли в качалочных колбах в жидкой среде при 25-34°С в течение 24-48 часов на термостатируемой качалочной установке при 200-300 об/мин.

Далее нарабатывали посевную культуру в ферментере объемом 15/100 л, для этого проводили засев ферментера путем внесения посевной культуры в количестве 5-15% от объема среды в ферментере, также производили непрерывную подачу стерильного воздуха во время культивирования при перемешивании в течении 120-170 часов.

Контроль содержания антибиотика проводили методом ВЭЖХ. При максимальном накоплении антибиотика процесс ферментации прекращали.

Пример 5. Определение содержания ванкомицина в культуральной жидкости методом ВЭЖХ.

Анализ содержания ванкомицина в культуральной жидкости методом ВЭЖХ проводили на колонке С18, 100 Å, 250*4,6 мм, 5 мкм; подвижная фаза А - 0,1 % ацетонитрила в 0,1 % водном растворе трифторуксусной кислоты; подвижная фаза В: 0,1 % изопропилового спирта и 0,1 % подвижной фазы А в ацетонитриле скорость потока -1,1 мл/мин; длина волны детектирования - 254 нм.

Полученные данные представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Выход целевого продукта при глубинном культивировании Штамм Продуктивность штаммов (г/л культуральной жидкости±0,5 г/л) в ферментере объемом 15 литров в ферментере объемом 100 литров Amycolatopsis keratiniphila VKPM Ac-2192 16,09
15,60
15,93 17,05
17,59
16,95 Amycolatopsis orientalis
ВКПМ Ac-1505 9,02
8,45
8,95 8,05
8,95
8,70

Также, согласно литературным данным продуктивность мутантного штамма Amycolatopsis orientalis составляла до 8,9 г/л (CN101608209, 23.12.2009).

Результаты исследований позволяют сделать вывод о том, что новый штамм по настоящему изобретению обладает высоким биотехнологическим потенциалом, значительно увеличенной продуктивностью и может применяться для промышленного производства антибиотика ванкомицина.

Пример 6. Методика выделения ванкомицина.

После завершения культивирования микроорганизма Amycolatopsis keratiniphila VKPM Ac-2192 культуральную жидкость, полученную в процессе глубинного культивирования в биореакторе, подкисляли раствором хлористоводородной кислоты до значений pH ~ 1,8-2,5, далее биомассу отделяли путем двух последовательных этапов центрифугирования. Очищенную от биомассы культуральную жидкость переносили на стадию дальнейшей очистки, а отработанную биомассу утилизировали.

Супернатант очищали от низкомолекулярных примесей способом диализа через полупроницаемую мембрану после чего пропускали его через адсорбционную колонку. Вытесненный с колонки раствор утилизировали. Затем осуществляли десорбцию колонки водным раствором аммиака с концентрацией 3,3 г/л.

Полученный на предыдущем этапе элюат наносили на колонку с гидрофобным сорбентом НР-20. Вытесненный с колонки раствор утилизировали. Колонку промывали водой очищенной. Элюат собирали и фильтровали.

Полученный раствор снова наносили на колонку с сорбентом НР-20. Колонку промывали водой очищенной. Затем колонку элюировали 50 % водным этанолом с добавлением уксусной кислоты. Контроль осуществляли методом ВЭЖХ/УФ.

Далее элюат фракционировали, фракции анализировали методом ВЭЖХ. Фракции, содержащие ванкомицин с чистотой не менее 92 %, объединяли. Менее чистые фракции подавали на повторную очистку. Очищенный раствор ванкомицина деколоризировали перемешиванием в течение 30 мин. с 0.5 % масс. угля апирогенного. Уголь отделяли фильтрованием через слой силикагеля.

Далее раствор ванкомицина фильтровали и проводили процесс кристаллизации. Полученный состав дополнительно фильтровали.

Группа изобретений относится к микробиологии и биотехнологии. Предложен штамм Amycolatopsis keratiniphila VKPM Ac-2192 – продуцент ванкомицина. Предложено также применение указанного штамма для получения ванкомицина. Культивируют указанный штамм и выделяют ванкомицин из культуральной жидкости с последующей очисткой. Группа изобретений обеспечивает увеличение продуктивности штамма-продуцента ванкомицина, сокращение времени культивирования, снижение количества примесей в субстанции антибиотика ванкомицина, высокую биохимическую активность и повышенную устойчивость нового штамма к неблагоприятным факторам, в том числе при хранении и культивировании. 3 н.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 6 пр.

1. Штамм Amycolatopsis keratiniphila VKPM Ac-2192 – продуцент ванкомицина.

2. Применение штамма по п.1 для получения ванкомицина.

3. Способ получения ванкомицина, включающий культивирование штамма по п.1 и выделение ванкомицина из культуральной жидкости с последующей очисткой.