НОВЫЙ ШТАММ-ПРОДУЦЕНТ РАМОПЛАНИНА ACTINOPLANES RAMOPLANINIFER Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 C12R1/01 A61P31/04 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, и касается нового штамма-продуцента антибиотика рамопланина.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Рамопланин - циклический пептидный антибиотик, получаемый в результате ферментации бактерий рода Actinoplanes sp.

Рамопланин проявляет активность в отношении клинически важных грамположительных патогенов с множественной лекарственной устойчивостью, включая ванкомицин-резистентных бактерий рода Enterococcus и Clostridium difficile, метициллин-резистентного Staphylococcus aureus.

Рамопланин воздействует на клеточную стенку бактерий благодаря уникальному механизму связывания промежуточного пептидогликана липида II (M.Cruz et al., Production of Ramoplanin and Ramoplanin Analogs by Actinomycetes // Frontiers in Microbiology February.- 2017.- 8:343).

Рамопланин используется преимущественно для перорального применения, поскольку в крови метаболизируется до неактивных соединений. При энтеральном введении антибиотик рамопланин не всасывается в системный кровоток, поэтому является перспективным препаратом для лечения кишечных инфекций (Решетько О.В., и др., Инновационные антибиотики для системного применения // КМАХ.- 2015.- №4).

Большинство используемых в медицине антимикробных препаратов разработано на основе природных метаболитов бактерий и грибов. Актиномицеты, грамположительные мицелиальные бактерии порядка Actinomycetales являются продуцентами таких классов антибиотиков, как макролиды, антрациклины, полиэфирные антибиотики, циклополилактоны, аминогликозиды, стрептотрицины, актиномицины, хиноксалиновые пептиды, гликопептиды и др. Для поиска актиномицетов - продуцентов биологически активных соединений разрабатываются различные методы селективной изоляции (Синева О.Н. Выделение актиномицетов редких родов - продуцентов антибиотиков из почв с применением сока Aloe arborescens. Антибиотики и Химиотерапия.- 2021.- 66(9-10), 4-11).

Известен дикий штамм, продуцирующий рамопланин, который относится к виду Actinoplanes ramoplaninifer - хранится в коллекции American Standard Bacteria Bank, номер депозита ATCC33076 (Marcone GL, et al., Classification of Actinoplanes sp. ATCC 33076, an actinomycete that produces the glycolipodepsipeptide antibiotic ramoplanin, as Actinoplanes ramoplaninifer sp. nov. Int J Syst Evol Microbiol.- 2017 Oct.- 67(10), 4181-4188), который был рассмотрен авторами настоящего изобретения в качестве ближайшего аналога.

Известен генетически-модифицированный штамм Actinomyces mobilis продуцирующий рамопланин не содержащий сахара (CN103911336, опубл. 09.07.2014).

Цель настоящего изобретения - получение нового штамма микроорганизма, превосходящего по уровню накопления рамопланина известные ранее штаммы.

Техническим результатом заявленного изобретения является увеличение продуктивности нового штамма Actinoplanes ramoplaninifer VKPM Ac-2183, сокращение времени культивирования, снижение количества примесей в субстанции антибиотика рамопланина, высокая биохимическая активность и повышенная устойчивость нового штамма к неблагоприятным факторам, в том числе, при хранении и культивировании.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В процессе индуцированного мутагенеза и последующего ступенчатого отбора из штамма дикого типа, выделенного из образца дерново-подзолистой почвы (Мордовия), был выделен высокопродуктивный штамм, продуцирующий антибиотик рамопланин.

Для повышения секреции рамопланина штамм дикого типа подвергался индуцированному мутагенезу путем воздействия на него ультрафиолета при низких температурах. Полученному высокопродуктивному штамму был присвоен внутренний номер RAM 20-08.

Далее полученный штамм RAM 20-08 был идентифицирован по макро- и микроморфологическим признакам, а родовая принадлежность была подтверждена секвенированием гена, кодирующего 16S рРНК.

По результатам анализа секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм оказался наиболее близок к виду Actinoplanes ramoplaninifer.

Полученный новый штамм Actinoplanes ramoplaninifer депонирован в Национальный Биоресурсный Центр Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Ac-2183.

Таким образом, одним из вариантов настоящего изобретения является штамм продуцент рамопланина Actinoplanes ramoplaninifer VKPM Ac-2183. Другим вариантом настоящего изобретения является применение штамма Actinoplanes ramoplaninifer VKPM Ac-2183 для получения антибиотика рамопланина. Еще одним из вариантов настоящего изобретения является способ получения антибиотика рамопланина, который заключается в том, что осуществляют культивирование штамма Actinoplanes ramoplaninifer VKPM Ac-2183, выделение рамопланина из культуральной жидкости с последующей очисткой (Фиг.1).

ТЕРМИНЫ и ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Ниже приведены термины, которые могут использоваться при описании настоящего изобретения. Если не указано иное, все технические и специальные термины, использованные в описании, имеют общепринятое в данной области техники значение.

Термин «антибиотик» включает в себя любую молекулу, которая может ингибировать рост, разрушать или приводит к гибели микроорганизмов, но не является смертельным для пациента в интервалах концентрации и дозировании, предполагаемых для введения. Согласно настоящему изобретению указанные антибиотики могут быть классифицированы как бактерицидные (т.е. непосредственно приводящие к гибели микроорганизма) или бактериостатические (т.е. предотвращающие деление и/или размножение микроорганизма). В контексте настоящего изобретения антибиотик не является токсичным для пациента, в интервалах вводимых концентраций и дозирования.

Использование термина «антибиотический» в контексте настоящего изобретения означает эффект или тип воздействия в лечении или профилактике инфекций, вызванных грамотрицательными и/или грамположительными бактериями.

Термин «биомасса» в контексте настоящего изобретения относится к совокупной массе клеток Actinoplanes ramoplaninifer VKPM Ac-2183, отделенных в процессе центрифугирования от супернатанта культуральной жидкости, полученной в результате культивирования, в том числе, в качалочных колбах или биореакторах (например, при культивировании батарейным способом).

Термин «культуральная жидкость» в контексте настоящего изобретения означает газожидкостную питательную (или ферментационную) среду, в которую в процессе глубинного культивирования микроорганизмы выделяют продукты метаболизма (в т.ч. вторичные метаболиты).

Термин «биореактор» в контексте настоящего изобретения относится к сосуду или устройству, в котором осуществляются процесс глубинного культивирования микроорганизмов для наработки целевого продукта (в рамках настоящего изобретения, антибиотика рамопланина).

Термин «продуктивность штамма» в контексте настоящего изобретения относится к количеству полученного антибиотика рамопланина, рассчитанному на единицу объема культуральной жидкости, при глубинном культивировании штамма Actinoplanes ramoplaninifer VKPM Ac-2183 в условиях биореактора, выраженному в граммах рамопланина на литр культуральной жидкости.

При использовании в описании термина «примерно», «приблизительно», «около» следует считать, что он характеризует плюс минус десять процентов от указанной величины.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано посредством Фиг. 1.

На Фиг. 1 изображены основные этапы скрининга штамма Actinoplanes ramoplaninifer VKPM Ac-2183 и наработки рамопланина из его культуральной жидкости, полученной после глубинного культивирования.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Согласно настоящему изобретению предложен новый штамм продуцент рамопланина - штамм Actinoplanes ramoplaninifer депонированный в Национальном Биоресурсном Центре Всероссийская коллекция промышленных микроорганизмов НИЦ «Курчатовский институт» под номером VKPM Ac-2183 (Фиг.1).

Культурально-морфологические признаки штамма продуцента рамопланина:

При культивировании на плотной среде нижеуказанного состава штамм образует типичные колонии, вросшие в агар, цвет - от персикового до оранжевого, диаметр 2-4 мм, редко до 5 мм, край волнистый, поверхность неровная.

Физико-биохимические признаки штамма продуцента рамопланина: хорошо утилизирует сахарозу, крахмал, фруктозу, глюкозу, монозу, глицерин, умеренно - рамнозу, ксилозу, арабинозу, не утилизирует - рафинозу, лактозу, целлюлозу. Обладает протеолитической активностью. Разжижает желатин.

Для хранения и приготовления посевного материала используется среда следующего состава, г/л: мясной экстракт - 3.0-10.0; дрожжевой экстракт - 3.0-15.0; соевый пептон -0.5 - 7.0; растворимый крахмал -0.6 - 10.0; глюкоза - 1.0-7.0; гидролизат казеина - 1.5-2.5; карбонат кальция - 3.0-10.0; агар-агар - 10-30. рН 7.2±0.3.

Условия поверхностного культивирования для выделения единичных колоний: 5-12 суток, при температуре 25-31°С.

ПРИМЕРЫ

Изобретение поясняется следующими иллюстративными примерами, которые не ограничивают заявленный объем охраны.

Пример 1. Способ селективного выделения штамма-продуцента рамопланина из образца почвы

Объектами исследования были образцы дерново-подзолистой почвы. Образцы почвы были отобраны в Республике Мордовия в летний период из верхних горизонтов почвы.

Для выделения штамма дикого типа - продуцента рамопланина из образцов почв использовали метод посева на твердые питательные среды. Гомогенизированный образец почвы массой 1 г помещали в колбу со 100 мл стерильной водопроводной воды, далее готовили разведение 1:300 и проводили посев на чашки с питательной средой Гаузе 1. В питательную среду Гаузе 1 добавляли антибиотики широкого спектра для ограничения роста и активности нежелательных микроорганизмов.

Посевы инкубировали при температурах 20 - 30°С до появления видимых колоний. Чистую культуру выводили путем последовательных пересевов до единичной колонии. Контроль чистоты культуры проводили микроскопически.

Пример 2. Получение высокопродуктивного штамма-продуцента рамопланина

Путем многоступенчатой селекции с применением мутагенных факторов и направленных методов отбора модификантов штамма дикого типа был получен новый высокопродуктивный штамм-продуцент рамопланина RAM 20-08.

Для этого осуществляли воздействие УФ с длиной волны 250 нм (лампа Mineralight) водной суспензии спор и клеток штамма дикого типа, размещенного на расстоянии 55 см от лампы в течение 20 минут при температуре 0^оС. Полученному штамму был присвоен внутренний номер RAM 20-08.

Пример 3. Идентификация штамма RAM 20-08 до вида с помощью анализа 16S рРНК

Выделение ДНК штамма RAM 20-08 для ПЦР проводили по стандартной методике (PCR Protocols. A Guide to methods and applications. Innis M, Gelfand D., Sninsky J.p.14-15.

Для секвенирования использовали консервативные праймеры для наработки 16S rDNA:

8f - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG

926r - CCG TCA ATT CCT TTR AGT TT

Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе АЕ3000 с режимами реакции:

1. 95^оС - 3мин

2. 35 циклов

95^оС - 30 с

57^оС - 30 с

72^оС - 1 мин 30 с

3. 72^оС - 5 мин

Для анализа секвенированных последовательностей использовали специализированные филогенетические компьютерные программы. Для стабильности воспроизведения результатов проводили не менее трех повторов ПЦР-реакций.

Далее проводили электрофорез ПЦР исследуемых образцов в 1,0% агарозном геле, при напряженности электрического поля 5 В/см.

Первичный скрининг по базе данных GenBank показал, что исследуемый штамм принадлежит к следующим систематическим группам: Bacteria; Actinobacteria; Micromonosporales; Micromonosporaceae; Actinoplanes.

Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий, доступными из базы данных GenBank.

Обработку секвенированных последовательностей проводили при помощи биоинформатического программного обеспечения в открытом доступе - программы Blast (Basic Local Alignment Search Tool), предназначенной в т.ч. для определения степени филогенетической близости живых организмов.

По результатам анализа последовательностей вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм RAM 20-08 оказался наиболее близок к виду Actinoplanes ramoplaninifer.

Пример 4. Методика культивирования

Проводили подготовку посевного материала путем посева культуры Actinoplanes ramoplaninifer VKPM Ac-2183 в чашках Петри. Для этого агаризованную среду засевали исходной посевной культурой, и выдерживали в термостате от 5 до 12 суток, при температуре 25-34°С.

Далее проводили наработку культуры в колбах в жидкой среде при 25-34°С °С в течение 24-48 часов на термостатируемой качалочной установке при 200-300 об/мин.

Далее проводили наработку посевной культуры в ферментере объемом 15/100 л, для этого проводили засев ферментера путем внесения посевной культуры в количестве 5-15% от объема среды в ферментере, при непрерывной подаче стерильного воздуха во время культивирования при перемешивании в течении 144-192 часов.

Контроль содержания антибиотика проводили методом ВЭЖХ. При максимальном накоплении антибиотика процесс ферментации прекращали.

Пример 5. Определение содержания рамопланина в культуральной жидкости методом ВЭЖХ

Анализ содержания рамопланина в культуральной жидкости методом ВЭЖХ проводили на колонке С18, 100 Å, 250*4,6 мм, 5 мкм; подвижная фаза А - 0,1 % ацетонитрила в 0,1 % водном растворе трифторуксусной кислоты; подвижная фаза В: 0,1 % изопропилового спирта и 0,1 % подвижной фазы А в ацетонитриле скорость потока -1,1 мл/мин; длина волны детектирования - 254 нм.

Полученные данные представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Выход целевого продукта при глубинном культивировании Штамм Продуктивность штаммов (г/л культуральной жидкости ±0,2 г/л) в ферментере объемом 15 литров в ферментере объемом 100 литров Actinoplanes ramoplaninifer
VKPM Ac-2183 3,51
3,72
3,42 3,74
3,91
3,65 Actinoplanes sp.
ATCC 33076 1,21
1,11
1,15 1,00
1,10
1,15

Результаты исследований позволяют сделать вывод о том, что штамм обладает высоким биотехнологическим потенциалом, значительно увеличенной продуктивностью и может применяться для промышленного производства антибиотика рамопланина.

Пример 6. Методика выделения рамопланина

После культивирования микроорганизма Actinoplanes ramoplaninifer VKPM Ac-2183 проводили отделение биомассы от культуральной жидкости центрифугированием. Нативный раствор утилизировали, а биомассу, содержащую рамопланин, переносили на стадию дальнейшей очистки.

В полученную биомассу, содержащую рамопланин, добавляли изопропиловый спирт при перемешивании. Полученную суспензию фильтровали, осадок утилизировали.

Полученный фильтрат наносили на колонку с сорбентом СПС-Bio. Наличие рамопланина во фракциях контролировали методом ВЭЖХ. Фракции с содержанием рамопланина менее 0,1 г/л утилизировали. Далее элюировали колонку 2 % раствором NaCl в изопропиловом спирте. Элюат фракционировали, фракции анализировали методом ВЭЖХ. Фракции, содержащие рамопланин с чистотой не менее 90 % объединяли. Очищенный раствор рамопланина осветляли перемешиванием в течение 30 мин с 0.5 %масс. угля апирогенного. Уголь отделяли фильтрованием через слой силикагеля. Далее раствор рамопланина концентрировали при помощи ротационного испарителя в вакууме при температуре не выше 40 °С до 1/3 от первоначального объема. Концентрат охлаждали, выпавший осадок отделяли фильтрованием.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и касается штамма-продуцента антибиотика рамопланина Actinoplanes ramoplaninifer VKPM Ac-2183. Штамм обладает высоким биотехнологическим потенциалом и может применяться для промышленного производства антибиотика рамопланина. 3 н.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 6 пр.

1. Штамм Actinoplanes ramoplaninifer VKPM Ac-2183 продуцент рамопланина.

2. Применение штамма по п.1 для получения рамопланина.

3. Способ получения рамопланина, включающий культивирование штамма по п.1 и выделение антибиотика рамопланина из культуральной жидкости с последующей очисткой.