Способ оценки индивидуальной стрессовой устойчивости мелких лабораторных животных Российский патент 2023 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к области биологии, экспериментальной медицины, гигиены и может быть использовано для определения стрессовой устойчивости мелких лабораторных животных путем оценки их поведенческих реакций на стандартизированный акустический раздражитель.

Известен способ выявления и отбора стрессоустойчивых животных [RU 2146444, 20.03.2000], заключающийся в их тестировании после кормления для распределения по поведенческим классам. Недостатком данного способа является его применимость исключительно к сельскохозяйственным животным для их этологического выявления и отбора на племя.

Известен способ определения стрессовой устойчивости у лабораторных животных [RU 2098015, 10.12.1997]. Способ заключается в отборе лабораторных животных по общим критериям здоровья, воздействии на них переменного электрического тока, и по определяемому уровню минимального порога болевой чувствительности распределению их на группы с низкой, средней и высокой устойчивостью к воздействию стресс-фактора.

Также известен способ моделирования "боевого стресса" в эксперименте на лабораторных животных с использованием воспроизведения реальной боевой обстановки [RU 2530750, 10.10.2014]. Он заключается в размещении биообъектов в ограниченном пространстве, обеспечивающем их визуальный контакт без физического соприкосновения. На третьи сутки после указанного размещения подопытных животных непосредственно под местом их нахождения осуществляют взрыв порохового заряда, после чего проводят анализ крови биообъектов и наблюдают за их поведением в течение последующих 8 часов.

Недостатком обоих рассмотренных выше способов является использование для воздействия на биообъекты стресс-факторов искусственного происхождения, не характерных для их жизни в естественных условиях обитания. Указанная особенность может существенным образом повлиять на адекватность моделирования и на точность полученных результатов.

Известны способы анализа поведенческой активности мелких лабораторных животных с использованием различных исследовательских лабиринтов [RU 2316057, 27.01.2008], [RU 2551308, 20.05.2015]. Сущность способов заключается в исследовании действий биообъектов при обходе ими площадок лабиринта в поиске воды (пищи). Недостатком способов является необходимость проведения многократных опытов, заключающихся в анализе действий животных при изменении места размещения поилки (кормушки) в лабиринте. Кроме того, оценка стрессоустойчивости биообъектов данным образом затруднена ввиду того, что воздействие стресса существенно снижает пищевую мотивацию животных.

Известен способ исследования поведения лабораторных крыс после воздействия на них витального стресса [Бензин Г.В. Структурно-функциональные основы нарушений поведения на модели посттравматического стрессового расстройства у крыс. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук. Санкт-Петербург, 2013]. Способ заключается в моделировании острого витального стресса у крыс путем помещения грызунов в террариум к удаву, предварительно отделенного прозрачной перегородкой. После угасания у крыс ориентировочной активности перегородка убирается, что позволяет удаву атаковать и заглотить одну или двух особей. Через 20-25 минут переживания ситуации угрозы жизни в замкнутом пространстве крыс изымают из террариума и рассаживают в те же клетки, где они содержались до опыта.

Для исследования поведения крыс после предъявления им острого витального стресса используется, в том числе, установка «открытое поле». С ее помощью на раннем сроке (от 3 до 8 дней) после воздействия витального стресс-фактора осуществляется оценка уровня двигательной активности животных, исследовательской деятельности, эмоциональности и тревожности. Полученные показатели сравниваются с аналогичными у грызунов из контрольной группы, не подвергавшихся стрессовому воздействию.

Основным недостатком данного способа является получение исключительно усредненных показателей поведения подвергшихся стрессированию животных. Кроме того, его реализация предполагает гибель одного или нескольких грызунов, а также необходимость размещения в виварии удава, что создает дополнительные сложности, связанные с его содержанием. Еще одним существенным недостатком представляется невозможность планирования и проведения регулярных экспериментов из-за специфического режима приема и переваривания пищи змеями.

Известен способ оценки спонтанной двигательной активности мелких лабораторных животных реализуемый с помощью тест-установки «открытое поле». С ее помощью в новых нестандартных условиях оцениваются такие показатели, как двигательная активность, ориентировочная активность, исследовательская активность и эмоциональный статус биообъекта.

Тест «открытого поля» проводится внутри квадратной (в некоторых модификациях круглой) белой площадки площадью 1 м² с непрозрачными бортами высотой 40 см. На белом полу вольера наносится черная координатная сетка, делящая поле на 25 (5 × 5) равных квадратов. Помимо этого, красным цветом выделяется центральная зона (внутренние 9 квадратов в центре арены). В точках пересечения основных линий делаются отверстия. Экспериментальный вольер освещается лампой мощностью 50 Вт, расположенной на высоте 150 см над центром поля. Тестирование проводится в тихой комнате в течение нескольких минут и начинается с помещения лабораторного животного в центральную зону. Наблюдение за животным ведется через зеркало, закрепленное над площадкой, в котором отражается поведенческая активность биообъекта [Рогова Л.Н., Поветкина В.Н., Шестернина Н.В., Тихаева К.Ю., Замечник Т.В., Фастова И.А., Старавойтов В.А., Дьячкова С.Ю., Панкова Г. В. Показатели групповой стресс-резистентности у интактных крыс при воздействии физиологического стрессора // Волгоградский научно-медицинский журнал. №1, 2021, с. 25-28]. При этом интервал времени, в течение которого осуществляется регистрация показателей двигательной активности грызунов, может меняться и в различных вариантах методики составлять от 3 до 5 минут [Нотова С.В., Казакова Т.В., Маршинская О.В. Современные методы и оборудование для оценки поведения лабораторных животных (обзор) // Животноводство и кормопроизводство. 2918, том 101 №1; Гостюхина А.А., Замощина Т.А., Светлик М.В., Жукова О.Б., Зайцев К.В., Абдулкина Н.Г. Поведенческая активность крыс в «открытом поле» после световой или темновой деприваций и физического переутомления. Бюллетень сибирской медицины, том 15, №3, с. 16-23; RU 2771256, 29.04.2022; RU 95192036, 27.03.1997]. Способ предполагает регистрацию следующих показателей:

- горизонтальная активность - число пересеченных квадратов в площадке «открытое поле» всеми четырьмя лапами крысы через разделяющую линию;

- вертикальная активность - число подъемов животного на задние лапы со свободными передними конечностями или вставаний с опорой на стенку арены;

- поисковая активность - число засовываний головы животным внутрь отверстий на пересечении разграничивающих линий «по глаза» или число обнюхиваний краев этих отверстий;

- центральная зона - количество выходов крысы в центральный сектор площадки «открытого поля», выделенный красной краской;

- грумминг -быстрые непродолжительные движения лап вокруг носа и морды животного (короткий грумминг) и длительный грумминг (умывание области глаз, зоны за ушами и умывание всей головы, лап, туловища, боков, области ануса и гениталий, а также хвоста);

- болюсы - число болюсов, оставленных в экспериментальной установке животным по окончании тестирования.

Указанный способ выбран в качестве прототипа.

Его основным недостатком является невозможность оценить вынужденную двигательную активность животного, вызванную действием стрессирующего фактора.

Патентуемый способ предполагает оценку индивидуальной стрессовой устойчивости мелких лабораторных животных путем сравнения показателей их спонтанной двигательной активности с использованием установки «открытое поле» до воздействия и вызванной двигательной активности в процессе воздействия стресс-фактора, в качестве которого выступает акустический раздражитель.

Технический результат, на решение которого направлено изобретение, заключается в разработке способа, обеспечивающего оценку стрессоустойчивости мелких лабораторных животных путем сравнения количественных показателей их спонтанной двигательной активности после помещения в тест-установку «открытое поле» с количественными показателями двигательной активности, вызванной действием стрессирующего акустического фактора.

Достижение технического результата обеспечивается размещением мелкого лабораторного животного в тест-установке «открытое поле», включающей площадку с высоким бортом, расчерченную на сектора, оценке его спонтанной двигательной активности по таким показателям, как число горизонтальных перемещений и актов грумминга в течение 3-5 минут после посадки, воздействием на него в течение интервала времени равного интервалу оценки спонтанной двигательной активности акустическим излучением частотой 6-800 ГЦ и уровнем звукового давления 100-110 дБ, в ходе которого оценивают его вызванную двигательную активность по числу горизонтальных перемещений и актов грумминга, а индивидуальную стрессоустойчивость определяют по разнице аналогичных показателей спонтанной двигательной активности до акустического воздействия и вынужденной двигательной активности во время акустического воздействия, при этом животное с повысившимися показателями двигательной активности считают стрессоустойчивым, животное, с понизившимися показателями двигательной активности считают стрессонеустойчивым, а животное с неизменными показателями двигательной активности - исходно реагирующим на стресс.

Установлено, что в группе биообъектов всегда присутствуют особи как устойчивые, так и чувствительные к действию стресс-факторов, а один и тот же фактор может вызвать у различных животных разнообразные ответные реакции [Судаков К.В. Антистрессорные эффекты пептида, вызывающего 8-сон / К.В. Судаков // Физиол.журн. СССР. - 1991. - Т. 77, №3. - с. 1-13; Юматов Е.А. Прогнозирование устойчивости к эмоциональному стрессу на основе индивидуального поведения / Е.А. Юматов, О.А. Мещерякова // ЖВНД. - 1990. - Т. 40, №3. - с. 575-579]. При этом усреднение экспериментальных данных не позволяет наглядно выявить достоверный эффект. В связи с этим особую актуальность приобретает моделирование стресса с учетом индивидуальной типологической характеристики животных. [Вальдман А.В. Фармакологическая регуляция эмоционального стресса / Вальдман А.В., КозловскаяМ. М., Медведев О.С.- М.: Медицина, 1979]. В то же время известные способы, основанные на использовании установки «открытое поле» предусматривают проведение только сравнительных групповых оценок контрольных (исходных) и подопытных групп животных.

Известно, что в ответ на неблагоприятный неконтролируемый раздражитель у биологического объекта в состоянии стресса возникает стереотипное поведение. Данная реакция запускается для ощущения субъективного контроля ситуации и для снижения психического напряжения. С точки зрения биологической целесообразности различные стратегии поведения под воздействием стресс-фактора (избегание и замирание) эволюционно значимы, так как обеспечивают выживание животного в различных условиях среды обитания. При этом параметры двигательной активности выступают в качестве показателей эмоционального состояния и уровня стрессирования биообъекта, а по мере возрастания силы стресс-фактора более четко проявляются их индивидуальные особенности реагирования [Китаев-Смык Л.А. Психология стресса-М.: Наука, 1983].

Воздействие стресс-фактора неизбежно приводит к изменению поведенческой активности животного. Важным нюансом в этом случае является использование биологически адекватного стрессирующего фактора. В частности, применение сильного и неожиданного акустического раздражителя в качестве сигнального, информационного стресс-фактора оказывает в большей степени психологическое воздействие на биообъект и воспринимается им как сигнал опасности. Громкий звук в настоящее время является признанной моделью индукции стрессового состояния у мелких лабораторных животных [Patchev V.K., Patchev A.V. Experimental models of stress // Dialogues Clin. Neurosci. 2006. Vol. 8. N 4. P. 417-432].

Также установлено, что динамика восстановления по показателям состояния сердечно-сосудистой системы (электрокардиограммы) после стресса различна для активных и пассивных крыс, что позволяет использовать это обстоятельство в качестве патофизиологических моделей изучения нарушений при стрессе у человека, а также для оценок эффективности лекарственных препаратов с целью купирования этих патологических состояний [Коплик Е.В., Классина С.Я. Особенности динамики восстановления сердечной деятельности у крыс с различным поведением после постстрессорного геморрагического инсульта. // Вестник новых медицинских технологий - 2018 - т. 25, №2 - с. 54-61].

При этом, действие умеренного стресс-фактора, каким является новизна обстановки в установке «открытое поле», позволяет выделять стрессустойчивых крыс, имеющих показатели горизонтальной двигательной активности выше, чем у стресснеустойчивых особей на 63%, показатели поисковой двигательной активности выше в 2,5 раза, а показатели грумминга выше в 2,7 раза. Кроме того, между активными и пассивными группами животных установлены различия в электролитном составе крови и в морфологии клеток слизистой желудка [Рогова Л.Н., Поветкина В.Н., Шестернина Н.В., Тихаева К.Ю., Замечник Т.В., Фастова И.А., Старавойтов В.А., Дьячкова С.Ю., Панкова Г.В. Показатели групповой стресс-резистентности у интактных крыс при воздействии физиологического стрессора. // Волгоградский научно-медицинский журнал. 2021, №1, с. 25-28].

Применение более сильного стресс-раздражителя в виде акустического излучения с уровнем звукового давления 100-110 дБ и частотой от 6 до 800 ГЦ в течение нескольких минут вызывает изменения в организме крыс, которые интерпретируются как развитие стресс-реакции, при этом изменения показателей двигательной активности становятся более выраженными. Так, время остановок животных сокращается в 42,6 раза, что свидетельствует о высокой двигательной активности, а показатель грумминга вырастает в 6,2 раза, что характерно для развития сильной стресс-реакции у животного [Бережной Д.С., Киселев Н.А., Новоселецкая А.В. и др. Влияние акустических воздействий высокой интенсивности на поведение крыс // Вестник Московского университета, сер. 16, Биология, 2015, №2, с. 3-7].

Таким образом, можно сделать вывод о том, что горизонтальные перемещения, а также количество актов грумминга являются наиболее информативными и признанными показателями, свидетельствующими о развитии стресс-реакции у мелких лабораторных животных.

Рассмотрим пример реализации патентуемого способа. Подопытный биообъект помещается в тест-установку «открытое поле», после чего экспериментатор оценивает спонтанную двигательную активность животного в течение 3-5 минут по количеству горизонтальных перемещений и актов грумминга.

Далее, находящееся в установке «открытое поле» животное в течение интервала времени, равного интервалу оценки его спонтанной двигательной активности подвергается воздействию стрессирующего фактора в виде акустического излучения частотой 6-800 Гц и уровнем звукового давления 100-110 дБ, в ходе которого оценивается его вызванная двигательная активность по тем же показателям, что и в начале эксперимента.

Сравнительный анализ показателей двигательной активности мелких лабораторных животных позволяет осуществить их распределение по группам с различными уровнями стрессовой устойчивости. Так, животных, которые отреагировали на воздействие акустического стресс-фактора повышением показателей двигательной активности, относят к группе активно реагирующих, т.е. стрессоустойчивых. Животных, которые отреагировали на стресс-фактор снижением двигательной активности, определяют как пассивно реагирующих (стрессонеустойчивых), а биообъекты с неизмененными показателями двигательной активности - исходно реагирующих на стресс.

Применение указанного подхода к определению стрессоустойчивости биообъектов позволяет стандартизировать и объективизировать процесс выявления в общей популяционной группе лабораторных животных особей с различной индивидуальной чувствительностью к стресс-фактору.

Таким образом, предлагаемый способ оценки индивидуальной стрессовой устойчивости мелких лабораторных животных расширяет диагностические возможности известного метода изучения поведения биообъектов «открытое поле» путем применения дополнительного акустического стрессового раздражителя. В этом случае проявляются их более выраженные индивидуальные поведенческие реакции, по которым можно категорировать форму индивидуального реагирования животного на стресс: активную, пассивную, исходную.

Установлено, что индивидуальные типы реагирования на стресс-фактор лабораторных животных характеризуются и особенностями в выполнении ими инструментальных навыков, в частности, теста «челночная камера» [Бережной Д.С., Киселев Н.А., Новоселецкая А.В. и др. Влияние акустических воздействий высокой интенсивности на поведение крыс // Вестник Московского университета, сер.16, Биология, 2015, №2, с. 3-7].

Изобретение относится к экспериментальной медицине и может быть использовано для оценки индивидуальной стрессовой устойчивости мелких лабораторных животных. Размещают животное в тест-установке «открытое поле» и оценивают его спонтанную двигательную активность по таким показателям, как число горизонтальных перемещений и актов грумминга. Затем воздействуют на мелкое лабораторное животное в течение интервала времени, равного интервалу оценки спонтанной двигательной активности, акустическим излучением частотой 6-800 ГЦ и уровнем звукового давления 100-110 дБ, в ходе которого оценивают его вызванную двигательную активность по числу горизонтальных перемещений и актов грумминга. При этом животное с повысившимися показателями двигательной активности оценивают как стрессоустойчивое, животное с понизившимися показателями двигательной активности оценивают как стрессонеустойчивое, а животное с неизменной двигательной активностью - исходно реагирующим на стресс. Способ позволяет определить стрессовую устойчивость мелких лабораторных животных за счет сравнения количественных показателей их спонтанной двигательной активности после помещения в тест-установку «открытое поле» с количественными показателями двигательной активности, вызванной действием стрессирующего акустического фактора.

Способ оценки индивидуальной стрессовой устойчивости мелких лабораторных животных, включающий размещение животного в тест-установке «открытое поле», включающей площадку с бортом, расчерченную на сектора, оценку его спонтанной двигательной активности по таким показателям, как число горизонтальных перемещений и актов грумминга в течение 3-5 минут после посадки, отличающийся тем, что после оценки спонтанной двигательной активности воздействуют на мелкое лабораторное животное в течение интервала времени, равного интервалу оценки спонтанной двигательной активности, акустическим излучением частотой 6-800 ГЦ и уровнем звукового давления 100-110 дБ, в ходе которого оценивают его вызванную двигательную активность по числу горизонтальных перемещений и актов грумминга, а индивидуальную стрессоустойчивость определяют по разнице аналогичных показателей спонтанной двигательной активности до акустического воздействия и вызванной двигательной активности во время акустического воздействия, при этом животное с повысившимися показателями двигательной активности оценивают как стрессоустойчивое, животное с понизившимися показателями двигательной активности оценивают как стрессонеустойчивое, а животное с неизменной двигательной активностью - исходно реагирующим на стресс.