СПОСОБ ОЦЕНКИ АНКСИОГЕННЫХ ЭФФЕКТОВ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2008 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к области исследований, касающихся изучения спектра нейропсихотропной активности и побочных эффектов новых фармакологических веществ, действующих преимущественно на центральную нервную систему, а именно к способам выявления и оценки анксиогенного эффекта потенциальных лекарственных препаратов.

Актуальность разработки нового способа выявления и оценки анксиогенного эффекта потенциальных лекарственных препаратов обусловлена необходимостью надежного и достоверного выявления данного побочного действия фармакологических веществ на этапе экспериментального (доклинического) исследования на лабораторных животных с целью обеспечения безопасности их будущего клинического применения.

К настоящему времени в практике исследований влияния различных химических веществ на поведение биологических объектов существуют различные способы оценки их тревожно-фобических состояний. Разработанные способы отличаются по используемым видам лабораторных животных, поведенческим моделям, последовательности процедуры тестирования, а также по критериям оценки степени выраженности состояния тревожности у биообъектов.

Известен способ оценки тревожно-фобического состояния в открытом поле. Методика открытого поля в традиционном варианте широко используется в психофармакологии для изучения влияния веществ на ориентировочно-исследовательское поведение, двигательную активность и выявление анксиолитического либо анксиогенного действия [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ; под. ред. В.П.Фисенко. - Москва. 2000. - С.121-137]. Основными оцениваемыми показателями, характеризующими эмоциональную реактивность по данной методике, являются вегетативные проявления. Вегетативные проявления, которые удобно учитывать вместе с измерением активности, - это дефекация, мочеиспускание [Hall C.S. Emotional behavior in the rat. I Defecation and urination as measures of individual differences in emotionality. J. сотр. Physiol. - 1934. - Vol.18. - P.385-403]. Однако без учета характера эмоционально-стрессовой реакции животных в условиях этой модели анксиолитическое либо анксиогенное действие не выявляется отчетливо. Ведь известно, что в зависимости от индивидуальных, наследственных, конституционных характеристик эмоционально-стрессовое воздействие по-разному влияет на отдельных особей. У одних - стрессовый ответ сопровождается активацией деятельности и ее продуктивности, а у других эмоциональный стресс приводит к дезорганизации поведения или к пассивному отстранению от решения проблем [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ; под. ред. В.П.Фисенко. - Москва. - 2000. - С.121-137]. Поэтому методика открытого поля не является высокочувствительным тестом для оценки тревожно-фобического состояния животных.

Ранее предлагался метод оценки тревожно-фобического состояния в темно-светлой камере [Куприянов В.В., Караганов Я.Л., Козлов В.И. Микроциркуляторое русло. - М. 1975], основанный на исследовании поведения в конфликтной ситуации (конфликт между ориентировочно-исследовательской мотивацией, направленной на ознакомление со всей камерой, и норковым рефлексом - убеганием в предпочитаемый темный отсек). Очевидным преимуществом подобного метода является доступность, простота обслуживания, требующая незначительного времени тестирования. Однако описанный метод не обладает надежной воспроизводимостью полученных результатов. Ни один из испытанных анксиолитиков и анксиогенов не оказывал стабильного воспроизводимого действия на частоту переходов между светлым и темным отсеками и на предпочтение темноты в темно-светлой камере [Лапин И.П. Отсутствие воспроизводимых эффектов анксиолитиков и анксиогенов на поведение мышей разных линий в темно-светлой камере // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 1992. - Т. - 55. - №1. - с.10-13].

В начале 90-х годов прошлого столетия рядом ученых был разработан многопараметровый метод оценки тревожно-фобического состояния животных [Родина В.И., Крупина Н.А., Крыжановский Г.Н., Окнина Н.Б. Новый метод оценки тревожно-фобических состояний у крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1992. - №7 - С.11-13], основанный на балльной интерпретации полученных результатов, с использованием оценочной шкалы, с целью максимальной объективизации оценочных критериев [Sturgeon R.D., Fessler R.G. Behavioral rating scales for accessing phencyclidine - induced locomotor activity, stereotyped behavior and ataca in rats // Europ.J. Pharm. - 1979. - Vol.94. - P.169-179].

Несомненно, указанный метод оценки тревожно-фобического состояния животных является перспективным и необходимым и позволяет дать комплексную характеристику индивидуального уровня тревожности у животных и его изменений при многократном тестировании по совокупности поведенческих реакций в батарее этологически адекватных тестов, основанных на создании эмоциогенных ситуаций. [Родина В.И., Крупина Н.А., Крыжановский Г.Н., Окнина Н.Б. Новый метод оценки тревожно-фобических состояний у крыс. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1992. - №7 - С.11-13]. Тем не менее, недостатком указанного метода является длительность процедуры тестирования.

Возможность оценки тревожно-фобического состояния описана в способе-прототипе приподнятого крестообразного лабиринта [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ; под. ред. В.П.Фисенко. - Москва. - 2000. - С.127-128], основанного на конкуренции двух процессов - страха (фобии) и исследовательского любопытства [Gray J.A. The psysiologi of fear and stress. - Cambridge.- 1987. - P.463]. Способность большинства позвоночных избегать опасных последствий спуска (падения) с поднятой платформы на нижележащую поверхность является врожденной реакцией, имеющей большую адаптивную значимость для всех млекопитающих [Bures J., Buresova О., Huston J. Technigues and basic experiments for the study of brain and behaviour. - Amsterdam - N.Y.:Els. Sci. Pub., 1991. - 396 р.].

Следует отметить, что результаты тестирования животных в приподнятом крестообразном лабиринте зависят от множества факторов, из-за чего результаты оценки известных лекарственных препаратов, обладающих анксиогенными побочными эффектами, бывают достаточно неоднозначными. В литературе имеется описание нескольких разновидностей алгоритмов тестирования биообъектов в приподнятом крестообразном лабиринте. Из них наиболее часто встречается методика тестирования, начинающаяся с помещения мелких лабораторных животных на центральную площадку лабиринта, головой к открытому рукаву [И.П.Лапин. Модели тревоги на мышах: оценка в эксперименте и критика методики // Эксперим. и клин. фармакология. - 2000. - №3. - с.58-62].

Использование такого методического подхода в ходе наших собственных экспериментальных исследований показало, что при проведении исходных тестирований большинство животных после размещения на центральной площадке тотчас убегали в один из закрытых рукавов и не покидали его на протяжении всего пятиминутного сеанса, хотя и перемещались достаточно активно внутри этого рукава. Исходные количественные показатели методики при этом были сопоставимы с изменениями поведения, характерными для тревожного состояния. Кроме того, в существующем способе не учитывается влияние на состояние экспериментальных животных процедуры тестирования и манипуляции введения оцениваемых препаратов. Данные обстоятельства существенно затрудняют интерпретацию полученных результатов.

Таким образом, недостатком способа-прототипа оценки тревожно-фобического состояния мелких лабораторных животных на основе использования приподнятого крестообразного лабиринта является весьма низкая достоверность получаемых результатов вследствие сильной зависимости последних от процедуры проведения эксперимента, а также отсутствие возможности учитывать влияние на состояние биообъектов манипуляции введения оцениваемых препаратов.

Задачей настоящего изобретения является повышение достоверности результатов оценки тревожно-фобического состояния мелких лабораторных животных.

Решение поставленной задачи осуществлялось путем разработки и последующего использования математической модели, описывающей вероятность развития у экспериментальных животных тревожно-фобического состояния в условиях приподнятого крестообразного лабиринта.

Как было показано выше, для этих условий развитие тревожно-фобического состояния у животных может быть обусловлено следующими основными факторами:

а) специфическим действием изучаемого лекарственного препарата;

б) воздействием самой процедуры тестирования и манипуляции введения изучаемого лекарственного препарата.

Вероятность развития тревожно-фобического состояния вследствие воздействия на организм лекарственного препарата обозначим как Р_лп. Вероятность развития тревожно-фобического состояния вследствие воздействия на состояние животного процедуры тестирования и манипуляции введения изучаемого лекарственного препарата обозначим как Р_к.р.. Вероятность развития у животного тревожно-фобического состояния, обусловленного общим воздействием рассматриваемых факторов, обозначим как Р_тфс. С учетом общего правила сложения вероятностей [Львовский Е.Н. Статистические методы построения эмпирических формул. - М.: Высшая школа, 1982. - 223 с.] математическая модель, описывающая вероятность развития у экспериментальных животных тревожно-фобического состояния в условиях приподнятого крестообразного лабиринта, имеет вид:

Р_тфс=Р_к.р.+Р_лп-Р_к.р.·Р_лп, (1)

где Р_тфс - вероятность развития у биообъектов опытной группы тревожно-фобического состояния, обусловленного общим воздействием процедуры тестирования, манипуляции введения и действием самого лекарственного препарата;

Р_к.р. - вероятность развития тревожно-фобического состояния у биообъектов контрольной группы вследствие воздействия на состояние животного процедуры тестирования и манипуляции введения изучаемого лекарства;

Р_лп - вероятность развития тревожно-фобического состояния у биообъектов опытной группы вследствие воздействия на организм оцениваемого лекарства.

Однако при проведении оценки анксиогенного эффекта лекарственного препарата необходимо установить именно Р_лп.. Для этого полученную математическую модель после несложных преобразований можно привести к окончательному виду для количественной оценки животных в тревожно-фобическом состоянии за счет воздействия изучаемого лекарственного препарата:

Экспериментальное обоснование заявленного способа провели на модели тревожно-фобического состояния, возникающего вследствие воздействия холецистокинина-4, обладающего анксиогенным эффектом, путем сравнительной оценки экспериментальных данных, полученных при использовании заявляемого способа и существующего способа-прототипа.

Опыты проводили на клинически здоровых крысах-самцах с массой тела 200-260 грамм, содержавшихся в условиях вивария (температура воздуха +20°С ±3°С, относительная влажность воздуха 40-60%) при свободном доступе к воде и пище. Эксперименты проводили при температуре окружающего воздуха 18-27°С, относительной влажности 40-80%.

В качестве показателя, по которому оценивалось поведение животных при тестировании, использовали число заглядываний под открытые рукава, являющееся самым надежным объективным показателем поведения в приподнятом крестообразном лабиринте [Лапин И.П. Модели тревоги на мышах: оценка в эксперименте и критика методики // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2000. - №3. - С.58-62]. Тревожно-фобическое состояния у крыс констатировали, если число заглядываний под открытые рукава лабиринта составляло менее 3. Данное критериальное значение является нижней границей 95% доверительного интервала среднегруппового показателя, рассчитанного на репрезентативной выборке белых нелинейных крыс - самцов (число животных составляло 60).

Процедура проведения оценки анксиогенного эффекта холецистокини-на-4 состояла в следующем:

1) Экспериментальное определение вероятности развития тревожно-фобического состояния вследствие воздействия процедуры тестирования и манипуляции введения лекарственного препарата с последующим расчетом показателя Р_к.р. на 18 животных контрольной группы после введения им растворителя, при этом 6 животных в начале теста размещали в открытом рукаве лабиринта 6 - в закрытом, и 6 - на центральной площадке;

2) Экспериментальное определение вероятности развития тревожно-фобического состояния вследствие воздействия процедуры тестирования и манипуляции введения лекарственного препарата, а также вследствие действия самого лекарственного препарата с последующим расчетом показателя Р_тфс на 18 животных опытной группы после введения изучаемого лекарственного препарата;

3) Расчет показателя Р_лп проводили по формуле (2), т.е. определяли анксиогенный эффект самого лекарственного препарата.

Результаты проведенных экспериментальных исследований представлены в табл.1. Сравнительный анализ результатов, характеризующих анксиогенный эффект холецистокинина-4, которые были получены с использованием способа-прототипа и данных, рассчитанных с использованием модели по заявляемому способу (табл.2), позволяет вполне обоснованно сделать следующие выводы о преимуществе последнего:

а) существенно (на 2 порядка, после введения холецистокиниа-4) повысилась чувствительность способа;

б) объективно оценивается воздействие на экспериментальных животных именно оцениваемый лекарственный препарат (в нашем случае холецистокини-4) и исключается из итоговой оценки влияние процедуры тестирования и манипуляции введения препарата;

в) выявляется четкая дозозависимость оцениваемого эффекта, позволяющая давать количественную характеристику специфической активности изучаемых лекарств.

Таким образом, применение заявленного способа позволяет с высокой достоверностью проводить оценку тревожно-фобического состояния мелких лабораторных животных в условиях приподнятого крестообразного лабиринта. Новизна разработанного способа заключается в возможности определения биологических эффектов анксиогенных и анксиолитических веществ различного происхождения в низких дозах, а также обеспечения более надежной воспроизводимости экспериментальных результатов оценки тревожно-фобического статуса мелких лабораторных животных. Предлагаемый способ может быть применен в клинической фармакологии для выявления и оценки анксиогенного эффекта потенциальных лекарственных препаратов с целью обеспечения безопасности их будущего клинического применения.

Таблица 1Результат тестирования белых нелинейных крыс в приподнятом крестообразном лабиринте по существующему и заявляемому способамЭкспериментальные группыДоза,мг/кгКоличество животных в тревожно-фобическом состоянии / число животных в группе (отн. единицы)Существующий способЗаявляемый способРазмещение на центральной площадкеРазмещение в закрытых рукавахРазмещение в открытых рукавахСуммарный результатКонтроль (введение растворителя )-1/6(0,17)1/6(0,17)1/6(0,17)1/6(0,17)3/18 (0,17)Холецистоки-нин-40,00010/6 (0,0)0/6 (0,0)1/6 (0,17)2/6 (0,33)3/18 (0,17)Холецистоки-нин-40,0010/6 (0,0)0/6 (0,0)4/6 (0,67)3/6 (0,5)7/18 (0,39)Холецистоки-нин-40,011/6 (0,17)1/6 (0,17)4/6 (0,67)4/6 (0,67)9/18 (0,5)Холецистоки-нин-40,13/6 (0,5)3/6 (0,5)5/6 (0,83)5/6 (0,83)13/18 (0,72)Холецистоки-нин-40,35/6 (0,83)5/6 (0,83)6/6 (1,0)6/6 (1,0)17/18 (0,94)Примечание - в качестве растворителя использовался физиологический раствор, в количестве 0,5 мл/кг, внутрибрюшинно.

Таблица 2Результаты сравнительного анализа тестирования белых нелинейных крыс в приподнятом крестообразном лабиринте по существующему и заявляемому способам (экспериментально полученные данные и расчетные показатели)Экспериментальные группыДоза, мг/кгКоличество животных в тревожно-фобическом состоянии / число животных в группе (отн. единицы)Существующий способЗаявляемый способСуммарный результат (полученное экспериментально)Непосредственное влияние ФАВ (рассчитанное с использованием разработанной модели)Контроль (введение растворителя )-1/6 (0,17)3/18 (0,17)0/18 (0,0)Холецистоки-нин-40,00010/6 (0,0)3/18 (0,17)0/18 (0,0)Холецистоки-нин-40,0010/6 (0,0)7/18 (039)5/18 (0,27)Холецистоки-нин-40,011/6 (0,17)9/18 (0,5)7/18 (0,39)Холецистоки-нин-40,13/6 (0,5)13/18 (0,72)9/18 (0,52)Холецистоки-нин-40,35/6 (0,83)17/18 (0,94)17/18 (0,92)Примечание - в качестве растворителя использовался физиологический раствор, в количестве 0,5 мл/кг, внутрибрюшинно.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для оценки анксиогенных эффектов потенциальных лекарственных препаратов. Для этого тестируют 18 животных контрольной группы после введения им растворителя. При этом 6 животных размещают в открытом рукаве лабиринта, 6 - в закрытом, 6 - на центральной площадке. Затем определяют количество животных в тревожно-фобическом состоянии. Рассчитывают показатель Р_к.р - вероятность развития тревожно-фобического состояния у животных вследствие влияния самой процедуры тестирования и введения растворителя. Затем также тестируют 18 животных экспериментальной группы после введения им изучаемого препарата. Определяют количество животных в тревожно-фобическом состоянии. Рассчитывают показатель Р_тфс - вероятность развития тревожно-фобического состояния у животных вследствие влияния самой процедуры тестирования и введения изучаемого препарата. После чего рассчитывают показатель Р, характеризующий вероятность развития анксиогенного побочного эффекта самого лекарственного препарата по формуле Способ позволяет оценить анксиогенный эффект потенциального лекарственного препарата, исключив при этом влияние процедуры тестирования и манипуляции введения оцениваемого препарата. 2 табл.

Способ оценки анксиогенных побочных эффектов потенциальных лекарственных препаратов, отличающийся тем, что тестируют 18 животных контрольной группы после введения им растворителя, при этом 6 животных размещают в открытом рукаве лабиринта, 6 - в закрытом, 6 - на центральной площадке, определяют количество животных в тревожно-фобическом состоянии, рассчитывают показатель Р_к.р. - вероятность развития тревожно-фобического состояния у животных вследствие влияния самой процедуры тестирования и введения растворителя, затем тестируют 18 животных экспериментальной группы после введения им изучаемого препарата, при этом 6 животных размещают в открытом рукаве лабиринта, 6 - в закрытом, 6 - на центральной площадке, определяют количество животных в тревожно-фобическом состоянии, рассчитывают показатель Р_тфс - вероятность развития тревожно-фобического состояния у животных вследствие влияния самой процедуры тестирования и введения изучаемого препарата, после чего рассчитывают показатель Р, характеризующий вероятность развития анксиогенного побочного эффекта самого лекарственного препарата по формуле