Набор олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления вируса герпеса человека 6В Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/6876 C12N15/38 G01N33/50 C12R1/93 

Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии и может быть использовано в клинической практике для видовой идентификации ДНК вируса герпеса человека 6В (ВГЧ-6В).

ВГЧ-6В (Human betaherpesvirus 6В) – ДНК–содержащий вирус семейства Herpesviridae подсемейства Betaherpesvirinae рода Roseolavirus – является ближайшим генетическим родственником вируса герпеса человека 6А (ВГЧ-6А, Human betaherpesvirus 6А), а также цитомегаловируса человека (Human betaherpesvirus 5) и вируса герпеса человека 7 (Human betaherpesvirus 7). На текущий момент для ВГЧ-6В и ВГЧ-6А сохраняется общее название – вирус герпеса человека 6 (ВГЧ-6, ВГЧ-6А/В).

ВГЧ-6 впервые выделен в 1986 г. из В-лимфоцитов периферической крови ВИЧ- инфицированных больных неходжкинскими лимфомами. В 1992 г. предложено разделить ВГЧ-6 на два варианта (далее типа) А и В, которые в 2012 г. были классифицированы как отдельные виды: ВГЧ-6А и ВГЧ-6В. Установлено, что ВГЧ-6А и ВГЧ-6В способны эффективно интегрировать в теломеры хромосом клетки-хозяина как in vivo, так и in vitro, благодаря особенностям организации генома.

Вирус проявляет тропизм к широкому спектру клеток хозяина: T-клетки, моноциты-макрофаги, гемопоэтические клетки костного мозга, эпителиальные клетки почек и слюнных желез, эндотелиальные клетки, клетки центральной нервной системы (микроглиальные клетки, олигодендроциты и астроциты). Для ВГЧ-6В, как и для других герпес-вирусов, характерна способность к персистенции и латенции в организме инфицированного человека. ВГЧ-6В-инфекция – антропоноз. Источником и резервуаром инфекции является человек, больной ВГЧ-6В-инфекцией, а также вирусоноситель.

Показана высокая патогенетическая значимость ВГЧ-6А/В: он может вызывать острые поражения кожи у детей раннего возраста (внезапная экзантема новорожденных), лихорадку новорожденных с судорожным синдромом, мононуклеозоподобный синдром; участвовать в развитии миалгического энцефаломиелита; у иммунокомпрометированных лиц – быть причиной лихорадки, пневмонии, гепатита, поражения центральной нервной системы. Доказано, что ВГЧ-6А/В может выступать и в качестве кофактора ВИЧ. Наряду с возникновением первичной инфекции, возможна реактивация вируса. Верификация диагноза ВГЧ-6В–инфекции осуществляется только при положительных результатах лабораторных исследований.

ВГЧ-6В значительно чаще, чем ВГЧ-6А, вызывает острые инфекции у детей (внезапная экзантема, лихорадка без сыпи), а также ассоциирован с фебрильными судорогами и височной эпилепсией. К тому же ВГЧ-6В, в отличие от ВГЧ-6А, резистентен к противовирусному действию альфа- и бета-интерферонов.

ВГЧ-6А и ВГЧ-6В различаются по последовательности нуклеотидов, особенностям культивирования, эпидемиологическим данным. Нуклеотидные последовательности ВГЧ- 6А и ВГЧ-6В совпадают в 75–95% в зависимости от сравниваемого гена. Вирусы используют разные клеточные рецепторы для проникновения: ВГЧ-6А – CD46, ВГЧ-6В – CD134. Эти различия могут объяснять различную тропность вирусов к тканям и отличающийся спектр патологии.

С каждым годом сведения о различиях между ВГЧ-6А и ВГЧ-6В обновляются, чаще для дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В используются молекулярно-биологические методы: ПЦР и секвенирование.

Известен способ дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В [Патент JP2003135100, дата подачи 26.07.2002] на основе разницы длин амплифицируемых фрагментов для различных подтипов с последующей электрофоретической детекцией. Для анализа выбран ген U89/90, отличающийся наличием инсерций размером 108 и 228 п.н. для ВГЧ-6В относительно ВГЧ-6А. Недостатком способа является использование для анализа электрофоретической детекции и вариабельность размеров инсерций.

Для обнаружения ВГЧ-6А используют различные методы для дискриминации аллельных вариантов: на основе лигирования [Landegren U., et al. A Ligase-Mediated Gene Detection Technique// Science. – 1988. – Vol. 241. – P. 1077-1080], масс-спектроскопии [Griffin T. J., et al. Direct genetic analysis by matrix-assisted laser desorptiony/ionization mass spectrometry // Proc. Natl. Acad. Sci. – 1999. – Vol. 25. – P. 6301-6306]; ДНК-микрочипа [Wang D.G, et al. Large-Scale Identification, Mapping, and Genotyping of Single-Nucleotide Polymorphisms in the Human Genome // Science. – 1998 – Vol. 280. – P. 1077-1082]; анализа длин рестрикционных фрагментов [Saiki R.K., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science. – 1985. – Vol. 230. – No. 4732. – P. 1350-1354]; зондов типа TaqMan [Livak K.J., et al. 12 Oligonucleotides with Fluorescent Dyes at Ends Provide a Quenched Probe System Useful for Detecting PCR Product and Nucleic Acid Hybridization // PCR Wethods Appl. – 1995. – Vol. 4. – P. 357-362]; анализа кривой плавления [Ririe K. M., et al. Product Differentiation by Analysis of DNA Melting Curves during the Polymerase Chain Reaction//Anal. Biochem. – 1997. – Vol. 245 – P. 154-160].

Из уровня техники известен зонд для обнаружения герпес вируса человека типа 6А и/или 6В (патент JP2018085961, дата подачи 29.11.2016), который применяют в наборе для

проведения ПЦР в режиме реального времени, при этом тип флуоресцентного красителя, содержащегося в зонде для обнаружения HHV6 типа B, отличается от типа флуоресцентного красителя, которым обладает зонд для обнаружения HHV типа 6A.

При практической реализации упомянутого решения наблюдалось достаточно большое количество ложноположительных результатов, что является его недостатком.

Также из уровня техники известен способ идентификации вариантов А и В вируса герпеса человека 6-го типа (патент RU 2627607, дата приоритета 28.09.2016), который позволяет определять специфические для ВГЧ-6А и ВГЧ-6В однонуклеотидные полиморфизмы в гене U67 ВГЧ - 6 методом ПЦР в формате реального времени с использованием праймеров HHV6F 5'-CGGATACAGTAAGACGGGATAT-3' и HHV6R 5'- ACGTAAGCTTGCACAATGC-3' и двух флуоресцентно меченных зондов HHV6AZ F1- GCAATAGATTTGGAAACGCGGCAT-Q1 и HHV6BZ F2-

GCAATAGATTCGGAAATGCGGCAT-Q2, где о наличии ВГЧ-6А или ВГЧ-6В судят в случае регистрации экспоненциального накопления сигнала флуоресценции в соответствующих зондам каналах. Данный способ основан на определении однонуклеотидных полиморфизмов в гене U67 и не содержит данных о его чувствительности.

Несмотря на то, что спрос на быстрые, производительные, недорогие тесты для определения ДНК различных инфекционных агентов привел к развитию различных лабораторных методик, существует потребность в расширении точного диагностического решения, позволяющего в короткие сроки и с наименьшими затратами идентифицировать различные виды вируса герпеса человека, в частности ВГЧ-6В, которые бы позволяли быстро, с наименьшими затратами и однозначная интерпретировать результаты с диагностической целью и при популяционных исследованиях возбудителя.

В связи с этим существует потребность в разработке набора олигонуклеотидов для выявления ВГЧ-6В: праймеров и флоуресцентного зонда для проведения ПЦР-РВ.

Технический результат заявляемого изобретения направлен на выявление ДНК ВГЧ-6В с высокой степенью специфичности в образцах биологического материала посредством такого набора олигонуклеотидов – праймеров и флоуресцентного зонда, который позволяет эффективно идентификацию вируса с использованием широко распространенных методик и доступных материалов.

Технический результат достигается за счет применения в ПЦР-РВ набора химически-синтезированных олигонуклеотидов для определения наличия ДНК ВГЧ-6В в образце биологического материала, имеющих следующий нуклеотидный состав:

прямой праймер HHV-6A/B-for – SEQ ID NO: 1;

обратный праймер HHV-6A/B-rev – SEQ ID NO: 2;

флуоресцентно-меченый зонд HHV-6В-probe – SEQ ID NO: 3.

Праймеры представляют собой последовательности олигонуклеотидов для амплификации участка гена U31, флоуресцентный зонд является олигонуклеотидом, содержащим флуорофор и гаситель флуоресценции, позволяющим детектировать амплифицированный фрагмент.

Набор олигонуклеотидных праймеров и зонда для осуществления заявляемого способа разработан на основе известной последовательности гена U31 Human betaherpesvirus 6В (референс-геном эталонного экзогенного штамма Human betaherpesvirus 6В HST, AB021506.1), представленной в базе данных National Center for Biotechnology Information (NCBI) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ AB021506.1].

К выбранному фрагменту подобраны праймеры и зонд для определения фрагмента размером 200 п.н.: прямой праймер HHV-6A/B-for – SEQ ID NO: 1; обратный праймер HHV-6A/B-rev – SEQ ID NO: 2 и флуоресцентный зонд HHV-6В-probe – SEQ ID NO: 3.

Заявляемое изобретение является результатом исследования, проведенного в ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, Россия) в рамках выполнения работы по совершенствованию диагностики герпес-вирусных заболеваний человека.

Для подбора последовательностей-мишеней – мест посадки олигонуклеотидов, использовали последовательности фрагмента гена U31 штаммов/изолятов ВГЧ-6В Human betaherpesvirus 6В, представленных в базе данных National Center for Biotechnology Information (NCBI) [http://www.ncbi.nlm.nih.gov]. Для поиска консервативных последовательностей применяли современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Mega, олигокалькуляторы (Oligo Calculators) «Thermo Fisher Scientific» (США). Составляли перечень уникальных последовательностей, характерных для ВГЧ-6В. Затем подбирали олигонуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров, а также флуоресцентно-меченого зонда. Упомянутые последовательности набора олигонуклеотидных праймеров и зонда приведены в Таблице 1.

Анализ упомянутых последовательностей с использованием ресурса Primer BLAST показал, что при использовании прямого праймера HHV-6A/B-for (SEQ ID NO: 1), обратного праймера HHV-6A/B-rev (SEQ ID NO: 2) и флуоресцентного зонда HHV-6В- probe – SEQ ID NO: 3, выявляется участок ВГЧ-6В со 100 % специфичностью.

Таблица 1. Оценка специфичности набора олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления вируса герпеса человека 6В (ВГЧ-6В).

Длина специфичного
фрагмента (п.н.) SEQ ID NO Название 5’-3’ последовательность Оценка специфичност и для ВГЧ-6B 200 SEQ ID NO: 1 HHV-
6A/B-for 5´GTGCAAGAATACGAAGCGA CA 3´ 100% SEQ ID NO: 2 HHV-
6A/B-rev 5´GATTGGCTCTTGGGCATAAG TC 3´ SEQ ID NO: 3 HHV-6B-
probe (F)TGTCTACTCGCCCATACAAC CTTAGCT(Q)

Где F – флуорофор, Q – гаситель флуоресценции, соответствующий красителю канала флуорофора.

В качестве биологического материала предпочтительно использовать цельную кровь, мазки со слизистой оболочки ротоглотки, мочу, тканевый материал.

ПЦР-исследование проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для экстракции ДНК может быть использован комплект реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или любой аналогичный набор/комплект реагентов для выделения ДНК.

ПЦР-РВ проводится с применением заявляемого набора олигонуклеотидов – праймеров и зонда, представленных в Таблице 1, при следующих условиях:

Общий объем реакционной смеси – 25 мкл. Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:

(а) 10 мкл смеси, содержащей:

- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 1, 2 – по 0,6 пмоль/мкл;

- флоуресцентный зонд SEQ ID NO: 3 – 0,15 пмоль/мкл;

- dNTPs – 0,44 мM.

(b) ПЦР-буфер, содержащий MgCl2 и рекомбинантный фермент Taq ДНК- полимеразу, например, 5 мкл ПЦР-буфер-Н (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или любого аналогичного коммерческого реагента в соответствии с инструкцией производителя.

(с) ДНК, экстрагированная из образцов биологического материала – 10 мкл.

Постановку и анализ результатов амплификации проводят на приборе с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени», например, Rotor-Gene Q («Qiagen», Германия) в соответствии с инструкцией производителя или аналогичном.

Амплификацию проводят по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, затем 45 циклов при температуре 95°С – 10 секунд / 60°С – 20 сек. Детекция флуоресценции проводится на этапе 60°С по каналу для флуорофора (F).

Анализ полученных результатов проводят с помощью программного обеспечения прибора, используемого для проведения ПЦР-РВ.

Для анализа результатов задают пороговую линию, соответствующую величине 0,03. Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции S-образной (сигмообразной) формы с установленной на соответствующем уровне пороговой линией. Это определяет наличие или отсутствие для анализируемой пробы ДНК значения порогового цикла. Образцы, для которых по каналу для флуорофора (F) кривые флуоресценции пересекают пороговую линию, и, при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала является экспоненциальной, являются положительными, то есть содержат ДНК ВГЧ-6В.

Реализация заявляемого изобретения поясняется следующими примерами:

Пример 1. Получение набора олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления вируса герпеса человека 6В (ВГЧ-6В).

Для подбора последовательностей-мишеней – мест посадки олигонуклеотидов, использовали последовательности фрагмента гена U31 штаммов/изолятов ВГЧ-6В Human betaherpesvirus 6В, представленных в базе данных National Center for Biotechnology Information (NCBI) [http://www.ncbi.nlm.nih.gov]. Для поиска консервативных последовательностей применили современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Mega, олигокалькуляторы (Oligo Calculators) «Thermo Fisher Scientific» (США). Составили перечень уникальных последовательностей, характерных для ВГЧ-6В, к которым подобрали уникальные олигонуклеотидные последовательности прямого HHV-6A/B-for и обратного HHV-6A/B-rev праймеров, а также флуоресцентный зонд HHV-6В-probe.

Анализ упомянутых последовательностей с использованием ресурса Primer BLAST показал, что при использовании данного набора олигонуклеотидных праймеров и флуоресцентного зонда выявляется участок ДНК ВГЧ-6В со 100 % специфичностью.

Набор олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления ВГЧ-6В – прямой праймер HHV-6A/B-for, обратный праймер HHV-6A/B-rev, флуоресцентный зонд HHV-

6В-probe, представлен уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1–3 соответственно.

Пример 2. Условия проведения ПЦР-РВ для выявления ДНК ВГЧ-6В.

Определение ДНК ВГЧ-6В проводили методом ПЦР-РВ при следующих условиях: Общий объем реакционной смеси – 25 мкл.

Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:

(а) 10 мкл смеси, содержащей:

- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 1, 2 – по 0,6 пмоль/мкл;

- флуоресцентный зонд SEQ ID NO: 3 – 0,15 пмоль/мкл;

- dNTPs – 0,44 мM.

(b) 5 мкл ПЦР-буфер-Н (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего MgCl2, рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу.

(с) ДНК, экстрагированная из образцов биологического материала – 10 мкл.

Подготовленный таким образом материал, содержащий набор олигонуклеотидных праймеров и зонда с уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1–3 использовали для выявления ДНК ВГЧ-6В в образцах биологического материала.

Постановку и анализ результатов амплификации проводили на приборе с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» Rotor-Gene Q («Qiagen», Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Пример 3. Выявление ДНК ВГЧ-6B в образцах биологического материала.

Для выявления ДНК ВГЧ-6B типа в образцах биологического материала выбрано 73 пробы, с подтвержденным наличием ДНК ВГЧ-6А/В.

Для исследования использовали следующие образцы биологического материала цельная венозная и пуповинная кровь (18/73), тканевый материал (14/73), мазок со слизистой оболочки ротоглотки (30/73), моча (11/73). Наличие ДНК ВГЧ-6А/В подтверждено лабораторно с применением набора реагентов «АмплиСенс^® HHV6-скрин- титр-FL» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).

ПЦР-исследование проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для экстракции ДНК использовали набор реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

ПЦР-РВ проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием набора олигонуклеотидных праймеров и зонда с уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1–3.

Амплификацию проводили по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С – 10 секунд / 60°С – 20 сек. Детекцию флуоресценции проводили на этапе 60°С по каналу для флуорофора Cy5. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 0,03.

Для 58/73 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию, при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала была экспоненциальной, что свидетельствовало о том, что данные образцы содержат ДНК ВГЧ-6В.

Для данных 58/73 образцов наличие ДНК ВГЧ-6В подтверждено с помощью метода прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей (по Сэнгеру), которое выполнялось на анализаторе ABI 3500xL («Applied Biosystems», США) в соответствии с инструкцией производителя. Выравнивание и анализ полученных последовательностей осуществляли с помощью программы AlignX («Thermo Fisher Scientific», США).

Для 15/73 образцов кривая флуоресценции не пересекла пороговую линию, что свидетельствовало о том, что данные образцы не содержали ДНК ВГЧ-6А. В данных 15/73 образцов без флуоресцентного сигнала подтверждено наличие ДНК ВГЧ-6А с помощью метода прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей (по Сэнгеру), выполняемого в условиях описанных выше.

Таким образом, из всей выборки исследуемого биологического материала выявлено 58 образцов, содержащих ДНК ВГЧ-6В.

Пример 4. Выявление ДНК ВГЧ-6В в образцах биологического материала.

Для выявления ДНК ВГЧ-6А в образцах биологического материала выбрано 13 проб, с подтвержденным наличием ДНК ВГЧ-6А/В.

Для исследования использовали следующие образцы биологического материала: цельная венозная кровь (5/13), тканевой материал (3/13), мазок со слизистой оболочки ротоглотки (5/13). Наличие ДНК ВГЧ-6А/В подтверждено лабораторно с применением набора реагентов «АмплиСенс^® HHV6-скрин-титр-FL» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).

ПЦР-исследование проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для экстракции ДНК использовали набор реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

ПЦР-РВ проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием набора олигонуклеотидных праймеров и зонда с уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1–3.

Амплификацию проводили по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С – 10 секунд / 60°С – 20 сек. Детекцию флуоресценции проводили на этапе 60°С по каналу для флуорофора R6G. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 0,03.

Для 9/13 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию и, при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала была экспоненциальной, что свидетельствовало о том, что данные образцы содержат ДНК ВГЧ-6В.

Для данных 9/13 образцов наличие ДНК ВГЧ-6В подтверждено с помощью метода прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей (по Сэнгеру), которое выполнялось на анализаторе ABI 3500xL («Applied Biosystems», США) в соответствии с инструкцией производителя. Выравнивание и анализ полученных последовательностей осуществляли с помощью программы AlignX («Thermo Fisher Scientific», США).

Для 4/13 образцов кривая флуоресценции не пересекла пороговую линию, что свидетельствовало о том, что данные образцы не содержали ДНК ВГЧ-6В. В данных 4/13 образцов без флуоресцентного сигнала подтверждено наличие ДНК ВГЧ-6А с помощью метода прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей (по Сэнгеру), выполняемого в условиях описанных выше.

Таким образом, из всей выборки исследуемого биологического материала выявлено 9 образцов, содержащих ДНК ВГЧ-6В.

Пример 5. Выявление ДНК ВГЧ-6В в образцах биологического материала.

Для выявления ДНК ВГЧ-6В в образцах биологического материала выбрано 27 проб, с подтвержденным наличием ДНК различных видов вируса герпеса человека.

Для исследования использовали следующие образцы биологического материала: цельная венозная кровь (9/27), тканевой материал (6/27), мазок со слизистой оболочки ротоглотки (12/27). Наличие ДНК вирусов герпеса человека подтверждено лабораторно с применением наборов реагентов «АмплиСенс^® HHV6-скрин-титр-FL», «АмплиСенс^® HHV8-скрин/монитор-FL», «АмплиСенс^® HHV7-скрин/монитор-FL», «АмплиСенс^® HSV I, II-FL» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).

ПЦР-исследование проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для

экстракции ДНК использовали набор реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

ПЦР-РВ проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием набора олигонуклеотидных праймеров и зонда с уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1–3.

Амплификацию проводили по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С – 10 секунд / 60°С – 20 сек. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 0,03. Кривая флуоресценции не пересекла пороговую линию, что свидетельствовало о том, что в выборке отсутствуют образцы, содержащие ДНК ВГЧ-6В. Принадлежность образцов к другим видам вируса герпеса человека подтверждено с помощью метода прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей (по Сэнгеру), которое выполнялось на анализаторе ABI 3500xL («Applied Biosystems», США) в соответствии с инструкцией производителя. Выравнивание и анализ полученных последовательностей осуществляли с помощью программы AlignX («Thermo Fisher Scientific», США). Дискордантных результатов не обнаружено.

Таким образом, заявляемое изобретение позволяет со 100 % специфичностью проводить видовую идентификацию вируса герпеса человека 6В (ВГЧ-6В) в образцах биологического материала методом ПЦР-РВ, использование набора синтезированных уникальных олигонуклеотидных праймеров и зонда SEQ ID NO: 1–3 исключает получение перекрестных реакций с другими видами вируса герпеса человека и позволяет однозначно интерпретировать полученные результаты.

Изобретение относится к области биотехнологии, медицины и молекулярной биологии. Предложен набор олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления вируса герпеса человека 6В (ВГЧ-6В). Указанный набор имеет следующий нуклеотидный состав: прямой праймер HHV-6A/B-for – SEQ ID NO: 1, обратный праймер HHV-6A/B-rev – SEQ ID NO: 2, флуоресцентный зонд HHV-6В-probe – SEQ ID NO: 3. Изобретение позволяет со 100 % специфичностью выявлять ДНК ВГЧ-6В в образцах биологического материала и однозначно интерпретировать полученные результаты. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 5 пр.

1. Набор олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления вируса герпеса человека 6В, имеющий следующий нуклеотидный состав:

прямой праймер HHV-6A/B-for – SEQ ID NO: 1;

обратный праймер HHV-6A/B-rev – SEQ ID NO: 2;

флуоресцентный зонд HHV-6В-probe – SEQ ID NO: 3.

2. Набор олигонуклеотидных праймеров и зонда для выявления вируса герпеса человека 6В по п. 1, где для создания прямого и обратного праймеров, флуоресцентного зонда используют фрагмент гена U31 Human betaherpesvirus 6В.