Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для видовой дифференциации вируса герпеса человека 6А и вируса герпеса человека 6В и способ его применения Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/6876 C12Q1/6888 

Изобретение относится к области медицины и молекулярной биологии и может быть использовано в клинической практике для видовой идентификации ДНК вирусов герпеса человека, в частности вируса герпеса человека 6А (ВГЧ-6А) и вируса герпеса человека 6В (ВГЧ-6В).

ВГЧ-6А (Human betaherpesvirus 6А) и ВГЧ-6В (Human betaherpesvirus 6В) - ДНК-содержащие вирусы семейства Herpesviridae подсемейства Betaherpesvirinae рода Roseolavirus - являются ближайшим генетическим родственниками цитомегаловируса человека (Human betaherpesvirus 5) и вируса герпеса человека 7 (Human betaherpesvirus 7). На текущий момент для ВГЧ-6В и ВГЧ-6А сохраняется общее название - вирус герпеса человека 6 (ВГЧ-6, ВГЧ-6А/В).

ВГЧ-6 впервые выделен в 1986 г. из В-лимфоцитов периферической крови ВИЧ-инфицированных больных неходжкинскими лимфомами. В 1992 г. предложено разделить ВГЧ-6 на два варианта (далее типа) А и В, которые в 2012 г. были классифицированы как отдельные виды: ВГЧ-6А и ВГЧ-6В. Установлено, что ВГЧ-6А и ВГЧ-6В способны эффективно интегрировать в теломеры хромосом клетки-хозяина как in vivo, так и in vitro, благодаря особенностям организации генома.

Вирус проявляет тропизм к широкому спектру клеток хозяина: Т-клетки, моноциты-макрофаги, гемопоэтические клетки костного мозга, эпителиальные клетки почек и слюнных желез, эндотелиальные клетки, клетки центральной нервной системы (микроглиальные клетки, олигодендроциты и астроциты). Для ВГЧ-6А/В, как и для других герпес-вирусов, характерна способность к персистенции и латенции в организме инфицированного человека. ВГЧ-6А/В-инфекция - антропоноз. Источником и резервуаром инфекции является человек, больной ВГЧ-6А/В-инфекцией, а также вирусоноситель.

Показана высокая патогенетическая значимость ВГЧ-6А/В: он может вызывать острые поражения кожи у детей раннего возраста (внезапная экзантема новорожденных), лихорадку новорожденных с судорожным синдромом, мононуклеозоподобный синдром; участвовать в развитии миалгического энцефаломиелита; у иммунокомпрометированных лиц быть причиной лихорадки, пневмонии, гепатита, поражения центральной нервной системы. Доказано, что ВГЧ-6А/В может выступать и в качестве кофактора ВИЧ. Наряду с возникновением первичной инфекции, возможна реактивация вируса. Верификация диагноза ВГЧ-6А/В-инфекции осуществляется только при положительных результатах лабораторных исследований.

ВГЧ-6А чаще выявляется у взрослых людей с хроническими заболеваниями, а также лиц с установленным наследуемым хромосомно-интегрируемым ВГЧ-6А/В-статусом. ВГЧ-6В значительно чаще, чем ВГЧ-6А, вызывает острые инфекции у детей (внезапная экзантема, лихорадка без сыпи), а также ассоциирован с фебрильными судорогами и височной эпилепсией. К тому же ВГЧ-6В, в отличие от ВГЧ-6А, резистентен к противовирусному действию альфа- и бета-интерферонов.

ВГЧ-6А и ВГЧ-6В различаются по последовательности нуклеотидов, особенностям культивирования, эпидемиологическим данным. Нуклеотидные последовательности ВГЧ-6А и ВГЧ-6В совпадают в 75-95% в зависимости от сравниваемого гена. Вирусы используют разные клеточные рецепторы для проникновения: ВГЧ-6А - CD46, ВГЧ-6В - CD134. Эти различия могут объяснять различную тропность вирусов к тканям и отличающийся спектр патологии.

С каждым годом сведения о различиях между ВГЧ-6А и ВГЧ-6В обновляются, чаще для дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В используются молекулярно-биологические методы: ПЦР и секвенирование.

Известен способ дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В [Патент JP2003135100, дата подачи 26.07.2002] на основе разницы длин амплифицируемых фрагментов для различных подтипов с последующей электрофоретической детекцией. Для анализа выбран ген U89/90, отличающийся наличием инсерций размером 108 и 228 п. н. для ВГЧ-6В относительно ВГЧ-6А. Недостатком способа является использование для анализа электрофоретической детекции и вариабельность размеров инсерций.

Для обнаружения ВГЧ-6А используют различные методы для дискриминации аллельных вариантов: на основе лигирования [Landegren U., et al. A Ligase-Mediated Gene Detection Technique// Science. - 1988. - Vol. 241. - P. 1077-1080], масс-спектроскопии [Griffin T. J., et al. Direct genetic analysis by matrix-assisted laser desorptiony/ionization mass spectrometry // Proc. Natl. Acad. Sci. - 1999. - Vol. 25. - P. 6301-6306]; ДНК-микрочипа [Wang D.G, et al. Large-Scale Identification, Mapping, and Genotyping of Single-Nucleotide Polymorphisms in the Human Genome // Science. - 1998 - Vol. 280. - P. 1077-1082]; анализа длин рестрикционных фрагментов [Saiki R.K., et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science. - 1985. - Vol. 230. - No. 4732. - P. 1350-1354]; зондов типа TaqMan [Livak K.J., et al. 12 Oligonucleotides with Fluorescent Dyes at Ends Provide a Quenched Probe System Useful for Detecting PCR Product and Nucleic Acid Hybridization // PCR Wethods Appl. - 1995. - Vol. 4. - P. 357-362]; анализа кривой плавления [Ririe K. M., et al. Product Differentiation by Analysis of DNA Melting Curves during the Polymerase Chain Reaction//Anal. Biochem. 1997. Vol. 245 - P. 154-160].

Из уровня техники известен зонд для обнаружения герпес вируса человека типа 6А и/или 6В (патент JP2018085961, дата подачи 29.11.2016), который применяют в наборе для проведения ПЦР в режиме реального времени, при этом тип флуоресцентного красителя, содержащегося в зонде для обнаружения HHV6 типа В, отличается от типа флуоресцентного красителя, которым обладает зонд для обнаружения HHV типа 6А.

При практической реализации упомянутого решения наблюдалось достаточно большое количество ложноположительных результатов, что является его недостатком.

Также из уровня техники известен способ идентификации вариантов А и В вируса герпеса человека 6-го типа (патент RU 2627607, дата приоритета 28.09.2016), который позволяет определять специфические для ВГЧ-6А и ВГЧ-6В однонуклеотидные полиморфизмы в гене U67 ВГЧ - 6 методом ПЦР в формате реального времени с использованием праймеров HHV6F 5'-CGGATACAGTAAGACGGGATAT-3' и HHV6R 5'-ACGTAAGCTTGCACAATGC-3' и двух флуоресцентно меченных зондов HHV6AZ F1-GCAATAGATTTGGAAACGCGGCAT-Q1 и HHV6BZ F2-GCAATAGATTCGGAAATGCGGCAT-Q2, где о наличии ВГЧ-6А или ВГЧ-6В судят в случае регистрации экспоненциального накопления сигнала флуоресценции в соответствующих зондам каналах. Данный способ основан на определении однонуклеотидных полиморфизмов в гене U67 и не содержит данных о его чувствительности.

Несмотря на то, что спрос на быстрые, производительные, недорогие тесты для определения ДНК различных инфекционных агентов привел к развитию различных лабораторных методик, существует потребность в расширении точного диагностического решения, позволяющего в короткие сроки и с наименьшими затратами проводить видовую дифференциацию видов вируса герпеса человека, в частности ВГЧ-6А и ВГЧ-6В, которые бы позволяли быстро, с наименьшими затратами и однозначная интерпретировать результаты с диагностической целью и при популяционных исследованиях возбудителя.

В связи с этим существует потребность в разработке набора олигонуклеотидов для одновременного выявления и дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В: праймеров и флоуресцентных зондов для проведения ПЦР-РВ.

Технический результат заявляемого изобретения направлен на выявление ДНК вирусов герпеса человека, а именно ВГЧ-6А или ВГЧ-6В, с высокой степенью специфичности в образцах биологического материала посредством такого набора олигонуклеотидов праймеров и флоуресцентных зондов, которые позволяют эффективно дифференцировать виды ВГЧ-6А/В с использованием широко распространенных методик и доступных материалов.

Технический результат достигается за счет применения в ПЦР-РВ набора химически-синтезированных олигонуклеотидов, позволяющих определять ДНК ВГЧ-6А и ДНК ВГЧ-6В в образце биологическом материала:

прямой праймер HHV-6A/B-for - SEQ ID NO: 1;

обратный праймер HHV-6A/B-rev - SEQ ID NO: 2;

флуоресцентно-меченый зонд HHV-6A-probe - SEQ ID NO: 3;

флуоресцентно-меченый зонд HHV-6B-probe - SEQ ID NO: 4.

Видовую дифференциацию ВГЧ-6А и ВГЧ-6В осуществляют посредством оценки кривых накопления флуоресцентных сигналов по соответствующим каналам для флуорофоров.

Праймеры представляют собой последовательности олигонуклеотидов для амплификации участка гена U31, флоуресцентные зонды являются олигонуклеотидами, содержащими флуорофор и гаситель флуоресценции, позволяющими детектировать амплифицированные фрагменты.

Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для осуществления заявляемого способа разработан на основе известных последовательностей: гена U31 Human betaherpesvirus 6А (референс-геном эталонного экзогенного штамма Human betaherpesvirus 6А U1102, NC 001664.4), представленной в базе данных National Center for Biotechnology Information (NCBI) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_001664.4]; гена U31 Human betaherpesvirus 6B (референс-геном эталонного экзогенного штамма Human betaherpesvirus 6B HST, AB021506.1), представленной в базе данных National Center for Biotechnology Information (NCBI) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ AB021506.1].

К выбранным фрагментам подобраны праймеры и зонды для определения фрагмента размером 200 п.н: прямой праймер HHV-6A/B-for - SEQ ID NO: 1; обратный праймер HHV-6A/B-rev SEQ ID NO: 2, флуоресцентный зонд HHV-6A-probe SEQ ID NO: 3 и флуоресцентный зонд HHV-6B-probe SEQ ID NO: 4.

Заявляемое изобретение является результатом исследования, проведенного в ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, Россия) в рамках выполнения работы по совершенствованию диагностики герпес-вирусных заболеваний человека.

Для подбора последовательностей-мишеней - мест посадки олигонуклеотидов, использовали последовательности фрагмента гена U31 штаммов/изолятов ВГЧ-6А Human betaherpesvirus 6А и фрагмента гена U31 штаммов/изолятов ВГЧ-6В Human betaherpesvirus 6В, представленных в базе данных National Center for Biotechnology Information (NCBI) [http://www.ncbi.nlm.nih.gov]. Для поиска консервативных последовательностей применяли современные алгоритмы in silico анализа нуклеотидных последовательностей и программы, находящиеся в открытом доступе, включая Mega, олигокалькуляторы (Oligo Calculators) «Thermo Fisher Scientific» (США). Составляли перечень уникальных последовательностей, характерных для ВГЧ-6А и ВГЧ-6В. Затем подбирали олигонуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров, а также флуоресцентно-меченых зондов. Упомянутые последовательности набора олигонуклеотидных праймеров и зондов приведены в Таблице 1.

Анализ указанных последовательностей с использованием ресурса Primer BLAST показал, что при использовании прямого праймера HHV-6A/B-for (SEQ ID NO: 1), обратного праймера HHV-6A/B-rev (SEQ ID NO: 2), а также флуоресцентных зондов HHV-6A-probe - SEQ ID NO: 3 и HHV-6B-probe - SEQ ID NO: 4, участки ВГЧ-6А и ВГЧ-6B выявляются со 100% специфичностью.

В качестве биологического материала предпочтительно использовать цельную кровь, мазки со слизистой оболочки ротоглотки, мочу, тканевый материал.

ПЦР-исследование проводят в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для экстракции ДНК может быть использован комплект реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или любой аналогичный набор/комплект реагентов для выделения ДНК.

ПЦР-РВ проводят в формате мультиплекса с применением заявляемого набора олигонуклеотидных праймеров и зонда, представленных в Таблице 1, при следующих условиях:

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл. Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:

(a) 10 мкл смеси, содержащей:

- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 1, 2 - по 0,6 пмоль/мкл;

- флоуресцентный зонд SEQ ID NO: 3, 4 - по 0,15 пмоль/мкл;

- dNTPs - 0,44 мМ.

(b) ПЦР-буфер, содержащий MgCl₂ и рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу, например, 5 мкл ПЦР-буфер-Н (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или любого аналогичного коммерческого реагента в соответствии с инструкцией производителя.

(c) ДНК, экстрагированная из образцов биологического материала 10 мкл. Постановку и анализ результатов амплификации проводят на приборе с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени», например, Rotor-Gene Q («Qiagen», Германия) в соответствии с инструкцией производителя или аналогичном.

Амплификацию проводят по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, затем 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 сек. Детекция флуоресценции проводится на этапе 60°С по заданным каналам для флуорофоров F₁ и F₂.

Анализ полученных результатов проводят с помощью программного обеспечения прибора, используемого для проведения ПЦР-РВ.

Для анализа результатов задают пороговую линию, соответствующую величине 0,03. Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флуоресценции S-образной (сигмообразной) формы с установленной на соответствующем уровне пороговой линией. Это определяет наличие или отсутствие для анализируемой пробы ДНК значения порогового цикла. В процессе амплификации ДНК зонды конкурируют за связывание с матрицей ДНК, содержащем два праймера SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 2. При этом преимущество получает зонд, соответствующий представленному в образце виду вируса герпеса человека 6А/В. Если присутствуют оба вида ВГЧ-6А/В, гибридизуются оба зонда. Таким образом, образцы, для которых кривые флуоресценции пересекают пороговую линию, и, при этом кинетика накопления флуоресцентного сигнала является экспоненциальной, являются положительными: для ВГЧ-6А - по каналу F₁, для ВГЧ-6В - по каналу F₂, для ВГЧ-6А и ВГЧ-6В - каналы F₁ и F₂ одновременно.

Реализация заявляемого изобретения поясняется следующими примерами: Пример 1. Получение набора олигонуклеотидных праймеров и зондов для видовой дифференциации вируса герпеса человека 6А (ВГЧ-6А) и вируса герпеса человека 6В (ВГЧ-6В).

Для подбора последовательностей-мишеней - мест посадки олигонуклеотидов, использовали известные последовательности: гена U31 Human betaherpesvirus 6А (референс-геном эталонного экзогенного штамма Human betaherpesvirus 6А U1102, NC_001664.4), представленной в базе данных National Center for Biotechnology Information (NCBI) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_001664.4]; гена U31 Human betaherpesvirus 6B (референс-геном эталонного экзогенного штамма Human betaherpesvirus 6B HST, AB021506.1), представленной в базе данных National Center for Biotechnology Information (NCBI) [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/ АВ021506.1]. Составили перечень уникальных последовательностей, характерных для ВГЧ-6А и ВГЧ-6В, к которым подобрали уникальные олигонуклеотидные последовательности прямого HHV-6A/B-for и обратного HHV-6A/B-rev праймеров, а также флуоресцентные зонды HHV-6A-probe и HHV-6B-probe.

Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для видовой дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В прямой праймер HHV-6A/B-for, обратный праймер HHV-6A/B-rev, флуоресцентные зонды HHV-6A-probe и HHV-6B-probe, представлен уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1-4 соответственно.

Анализ указанных последовательностей с использованием ресурса Primer BLAST показал, что при использовании уникальных последовательностей SEQ ID NO: 1-3 выявляется участок ВГЧ-6А со 100% специфичностью, а при использовании уникальных последовательностй SEQ ID NO: 1, 2, 4 со 100% специфичностью выявляется участок ВГЧ-6В.

Пример 2. Способ применения набора олигонуклеотидных праймеров и зондов для видовой дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В.

Для видовой дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В в образцах биологического материала выбрано 24 пробы, с подтвержденным наличием ДНК ВГЧ-6А/В.

Для исследования использовали следующие образцы биологического материала цельная венозная и пуповинная кровь (11/24), тканевый материал (4/24), мазок со слизистой оболочки ротоглотки (9/24). Наличие ДНК ВГЧ-6А/В подтверждено лабораторно с применением набора реагентов «АмплиСенс® HHV6-скрин-титр-FL» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).

ПЦР-исследование проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для экстракции ДНК использовали набор реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

ПЦР-РВ проводили в формате мультиплекса с применением заявляемого набора олигонуклеотидных праймеров и зондов, представленных в Таблице 1, при следующих условиях:

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл. Компоненты ПЦР смешивали следующим образом:

(a) 10 мкл смеси, содержащей:

- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 1, 2 - по 0,6 пмоль/мкл;

- флуоресцентный зонд SEQ ID NO: 3, 4 - по 0,15 пмоль/мкл;

- dNTPs - 0,44 мМ.

(b) 5 мкл ПЦР-буфер-Н (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего MgCl₂, рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу.

(c) ДНК, экстрагированная из образцов биологического материала - 10 мкл. Постановку и анализ результатов амплификации проводили на приборе с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» Rotor-Gene Q («Qiagen», Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Амплификацию проводили по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 сек. Детекцию флуоресценции проводили на этапе 60°С по каналам для флуорофоров: R6G - для ВГЧ-6А, ROX - для ВГЧ-6В. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 0,03. Для 9 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию по каналу для флуорофора R6G, для 15 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию по каналу для флуорофора ROX, при этом кинетика накопления флуоресцентных сигналов была экспоненциальной.

По каналу для флуорофора R6G определили наличие ДНК ВГЧ-6А, по каналу для флуорофора ROX определили наличие ДНК ВГЧ-6В.

Результаты исследования были подтверждены с помощью метода прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей (по Сэнгеру), которое выполнялось на анализаторе ABI 3500xL («Applied Biosystems», США) в соответствии с инструкцией производителя. Выравнивание и анализ полученных последовательностей осуществляли с помощью программы AlignX («Thermo Fisher Scientific», США). Дискордантных результатов не обнаружено.

Пример 3. Способ применения набора олигонуклеотидных праймеров и зондов для видовой дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В.

Для видовой дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В в образцах биологического материала выбрано 65 проб, с подтвержденным наличием ДНК различных видов вируса герпеса человека.

Для исследования использовали следующие образцы биологического материала: цельная венозная кровь (17/65), мазок со слизистой оболочки ротоглотки (19/65), тканевый материал (13/65), моча (16/65). Наличие ДНК вирусов герпеса человека подтверждено лабораторно с применением наборов реагентов «АмплиСенс® HHV6-скрин-титр-FL», «АмплиСенс® HHV8-скрин/монитор-FL», «АмплиСенс® HHV7-скрин/монитор-FL», «АмплиСенс® HSV I, II-FL» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).

ПЦР-исследование проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для экстракции ДНК использовали набор реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

ПЦР-РВ проводили в формате мультиплекса с применением заявляемого набора олигонуклеотидных праймеров и зондов, представленных в Таблице 1, при следующих условиях:

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл.

Компоненты ПЦР смешивали следующим образом:

(a) 10 мкл смеси, содержащей:

- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 1, 2 - по 0,6 пмоль/мкл;

- флуоресцентный зонд SEQ ID NO: 3, 4 - по 0,15 пмоль/мкл;

- dNTPs - 0,44 мМ.

(b) 5 мкл ПЦР-буфер-Н (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего MgCl₂, рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу.

(c) ДНК, экстрагированная из образцов биологического материала 10 мкл.

Постановку и анализ результатов амплификации проводили на приборе с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» Rotor-Gene Q («Qiagen», Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Амплификацию проводили по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 сек. Детекцию флуоресценции проводили на этапе 60°С по каналам для флуорофоров: FAM для ВГЧ-6А, Су5 - для ВГЧ-6В. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 0,03.

Для 32/65 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию по каналу для флуорофора FAM, для 25/65 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию по каналу для флуорофора Су5, при этом кинетика накопления флуоресцентных сигналов была экспоненциальной.

По каналу для флуорофора FAM определили наличие ДНК ВГЧ-6А, по каналу для флуорофора Су5 определили наличие ДНК ВГЧ-6В.

Результаты исследования были подтверждены с помощью метода прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей (по Сэнгеру), которое выполнялось на анализаторе ABI 3500xL («Applied Biosystems», США) в соответствии с инструкцией производителя. Выравнивание и анализ полученных последовательностей осуществляли с помощью программы AlignX («Thermo Fisher Scientific», США).

Принадлежность 8/65 образцов к другим видам вируса герпеса человека подтверждено с помощью метода прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей (по Сэнгеру), которое выполнялось на анализаторе ABI 3500xL («Applied Biosystems», США) в соответствии с инструкцией производителя. Выравнивание и анализ полученных последовательностей осуществляли с помощью программы AlignX («Thermo Fisher Scientific», США). Дискордантных результатов не обнаружено.

Пример 4. Способ применения набора олигонуклеотидных праймеров и зондов для видовой дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В.

Для видовой дифференциации ВГЧ-6А и ВГЧ-6В в образцах биологического материала выбрано 93 пробы, с подтвержденным наличием ДНК различных видов вируса герпеса человека.

Для исследования использовали следующие образцы биологического материала: цельная венозная кровь (31/93), мазок со слизистой оболочки ротоглотки (39/93), тканевый материал (15/93), моча (8/93). Наличие ДНК вирусов герпеса человека подтверждено лабораторно с применением наборов реагентов «АмплиСенс® HHV6-скрин-титр-FL», «АмплиСенс® HHV8-скрин/монитор-FL», «АмплиСенс® HHV7-скрин/монитор-FL», «АмплиСенс® HSV I, II-FL» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).

ПЦР-исследование проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для экстракции ДНК использовали набор реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) в соответствии с инструкцией производителя.

ПЦР-РВ проводили в формате мультиплекса с применением заявляемого набора олигонуклеотидных праймеров и зонда, представленных в Таблице 1, при следующих условиях:

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл.

Компоненты ПЦР смешивали следующим образом:

(a) 10 мкл смеси, содержащей:

- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO: 1, 2 - по 0,6 пмоль/мкл;

- флуоресцентный зонд SEQ ID NO: 3, 4 - по 0,15 пмоль/мкл;

- dNTPs - 0,44 мМ.

(b) 5 мкл ПЦР-буфер-Н (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего MgCl₂, рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу.

(c) ДНК, экстрагированная из образцов биологического материала 10 мкл. Постановку и анализ результатов амплификации проводили на приборе с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» Rotor-Gene Q («Qiagen», Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Амплификацию проводили по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 сек. Детекцию флуоресценции проводили на этапе 60°С по каналам для флуорофоров: ROX - для ВГЧ-6А, FAM - для ВГЧ-6В. Для анализа результатов задали пороговую линию, соответствующую величине 0,03.

Для 31/93 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию по каналу для флуорофор ROX, для 46/93 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию по каналу для флуорофора FAM, для 5 образцов кривая флуоресценции пересекла пороговую линию по двум каналам для флуорофоров ROX и FAM одновременно. При этом кинетика накопления флуоресцентных сигналов была экспоненциальной.

По каналу для флуорофоров ROX определили наличие ДНК ВГЧ-6А, по каналу для флуорофоров FAM определили наличие ДНК ВГЧ-6В, наличие сигналов по двум каналам для флуорофоров ROX и FAM одновременно подтвердили присутствие ДНК двух видов вируса герпеса человека - ВГЧ-6А и ВГЧ-6В. Результаты исследования были подтверждены с помощью метода прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей (по Сэнгеру), которое выполнялось на анализаторе ABI 3500xL («Applied Biosystems», США) в соответствии с инструкцией производителя. Выравнивание и анализ полученных последовательностей осуществляли с помощью программы AlignX («Thermo Fisher Scientific», США).

Для 11/93 образцов кривая флуоресценции не пересекла пороговую линию, что свидетельствовало о том, что в выборке отсутствуют образцы, содержащие ДНК ВГЧ-6А, ДНК ВГЧ-6В. Принадлежность данных 11/93 образцов к другим видам вируса герпеса человека подтверждено с помощью метода прямого секвенирования нуклеотидных последовательностей (по Сэнгеру), которое выполнялось на анализаторе ABI 3500xL («Applied Biosystems», США) в соответствии с инструкцией производителя. Выравнивание и анализ полученных последовательностей осуществляли с помощью программы AlignX («Thermo Fisher Scientific», США). Дискордантных результатов не обнаружено.

Таким образом, заявляемое изобретение позволяет со 100% специфичностью проводить видовую дифференциацию вируса герпеса человека 6А и вируса герпеса человека 6В) в образцах биологического материала методом ПЦР-РВ, использование набора синтезированных уникальных олигонуклеотидных праймеров и зондов SEQ ID NO: 1-4 исключает получение перекрестных реакций с другими видами вируса герпеса человека, позволяют однозначная интерпретировать полученные результаты.

--->

<?xml version="1.0" encoding="ISO-8859-1"?>

<!DOCTYPE ST26SequenceListing SYSTEM "ST26SequenceListing_V1_2.dtd"

PUBLIC "-//WIPO//DTD Sequence Listing 1.2//EN">

<ST26SequenceListing productionDate="2023-08-08"

softwareVersion="1.0.0" softwareName="WIPO Sequence" fileName="Nabor

oligonukleotidnyh prajmerov i zondov dlya vidovoj differenciacii

virusa gerpesa cheloveka 6AB" dtdVersion="V1_2">

<ApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022134976</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-12-28</FilingDate>

</ApplicationIdentification>

<EarliestPriorityApplicationIdentification>

<IPOfficeCode>RU</IPOfficeCode>

<ApplicationNumberText>2022134976</ApplicationNumberText>

<FilingDate>2022-12-28</FilingDate>

</EarliestPriorityApplicationIdentification>

<ApplicantName languageCode="ru">ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии

Роспотребнадзора</ApplicantName>

<ApplicantNameLatin>FBUN CRIE</ApplicantNameLatin>

<InventionTitle languageCode="ru">Набор олигонуклеотидных праймеров и

зондов для видовой дифференциации вируса герпеса человека 6А и вируса

герпеса человека 6В и способ его применения</InventionTitle>

<SequenceTotalQuantity>4</SequenceTotalQuantity>

<SequenceData sequenceIDNumber="1">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>21</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..21</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>HHV-6A/B</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gtgcaagaatacgaagcgaca</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="2">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>22</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..22</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>HHV-6A/B</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>gattggctcttgggcataagtc</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="3">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>HHV-6A</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>agtctactcgcccgggtaaacaaacct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

<SequenceData sequenceIDNumber="4">

<INSDSeq>

<INSDSeq_length>27</INSDSeq_length>

<INSDSeq_moltype>DNA</INSDSeq_moltype>

<INSDSeq_division>PAT</INSDSeq_division>

<INSDSeq_feature-table>

<INSDFeature>

<INSDFeature_key>source</INSDFeature_key>

<INSDFeature_location>1..27</INSDFeature_location>

<INSDFeature_quals>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>mol_type</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>other DNA</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

<INSDQualifier>

<INSDQualifier_name>organism</INSDQualifier_name>

<INSDQualifier_value>HHV-6B</INSDQualifier_value>

</INSDQualifier>

</INSDFeature_quals>

</INSDFeature>

</INSDSeq_feature-table>

<INSDSeq_sequence>tgtctactcgcccatacaaccttagct</INSDSeq_sequence>

</INSDSeq>

</SequenceData>

</ST26SequenceListing>

<---

Настоящее изобретение относится к области молекулярной биологии. Описан набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для видовой дифференциации вируса герпеса человека 6А и вируса герпеса человека 6В. Также описан способ применения указанного набора олигонуклеотидных праймеров и зондов. Способ включает экстракцию ДНК из биологического материала и проведение ПЦР-РВ с использованием вышеупомянутого набора олигонуклеотидных праймеров и зондов, амплификацию, анализ и интерпретацию результатов. Технический результат, достигаемый изобретением, заключается в разработке средства для выявления ДНК вирусов герпеса человека, а именно ВГЧ-6А и ВГЧ-6В, с высокой степенью специфичности. 2 н. и 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 пр.

1. Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов для видовой дифференциации вируса герпеса человека 6А и вируса герпеса человека 6В, имеющий следующий нуклеотидный состав:

прямой праймер HHV-6A/B-for – SEQ ID NO: 1;

обратный праймер HHV-6A/B-rev – SEQ ID NO: 2;

флуоресцентный зонд HHV-6А-probe – SEQ ID NO: 3,

флуоресцентный зонд HHV-6В-probe – SEQ ID NO: 4.

2. Набор олигонуклеотидных праймеров и зондов по п. 1, где для создания прямого и обратного праймеров, флуоресцентных зондов используют фрагмент гена U31 Human betaherpesvirus 6А и фрагмент гена U31 Human betaherpesvirus 6В.

3. Способ применения набора олигонуклеотидных праймеров и зондов по п. 1, включающий экстракцию ДНК из биологического материала и проведение ПЦР-РВ с использованием набора олигонуклеотидных праймеров и зондов по п. 1, амплификацию, анализ и интерпретацию результатов, где о наличии ВГЧ-6А или ВГЧ-6В судят посредством оценки кривых накопления флуоресцентных сигналов по соответствующим каналам для флуорофоров.

4. Способ применения набора олигонуклеотидных праймеров и зондов по п. 3, при котором наличие в образце биологического материала ДНК ВГЧ-6А и ДНК ВГЧ-6В определяется посредством оценки кривых накопления флуоресцентных сигналов по двум каналам одновременно.

5. Способ применения набора олигонуклеотидных праймеров и зондов по п. 3 или 4, где для анализа результатов задают пороговую линию, соответствующую величине 0,03.