АНТИТЕЛА ПРОТИВ ВИРУСА ГЕПАТИТА В И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2023 года по МПК A61K31/20 A61K39/42 C07K16/08 C12N15/13 C12P21/00 

Область техники

Настоящее изобретение относится к области молекулярной вирусологии и иммунологии, в частности, к области лечения инфекции, вызванной вирусом гепатита B (HBV). Конкретно, настоящее изобретение относится к антителу против поверхностного антигена вируса гепатита B (HBsAg) и нуклеиновой кислоте, кодирующей антитело, и их применению. Анти-HBsAg антитело по настоящему изобретению имеет более высокую аффинность связывания с HBsAg при нейтральном значении pH, чем при кислом значении pH. Новое антитело можно использовать для профилактики и/или лечения HBV инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV инфекцией (например, гепатита B), для нейтрализации вирулентности HBV у субъекта (например, человека) или для снижения сывороточного уровня HBV ДНК и/или HBsAg у субъекта. Следовательно, настоящее изобретение дополнительно относится к применению антитела и его варианта в производстве фармацевтической композиции для профилактики и/или лечения HBV инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV инфекцией (например, гепатита B), для нейтрализации вирулентности HBV у субъекта (например, человека), для снижения сывороточного уровня HBV ДНК и/или HBsAg у субъекта или для активации гуморального иммунного ответа на HBV у субъекта (например, человека с хронической HBV инфекцией или пациента с хроническим гепатитом B).

Уровень техники

Инфекция, вызванная вирусом гепатита B, особенно хроническая HBV инфекция, является одной из наиболее серьезных проблем здравоохранения в мире (Dienstag J.L., Hepatitis B virus influenza, N. Engl. J. Med., 2008 Oct 2; 359 (14): 1486-1500). Хроническая HBV инфекция может привести к ряду заболеваний печени, таких как хронический гепатит B (CHB), цирроз печени (LC) и первичная гепатоцеллюлярная карцинома (HCC) (Liaw Y.F., Chu C.M., Liaw Y.F., Chu C.M., Hepatitis B virus infection, Lancet, 2009 Feb 14;373(9663): 582-592). По имеющимся данным, в настоящее время в мире насчитывается примерно 2 миллиарда человек, инфицированных HBV, также в настоящее время имеется примерно 350 миллионов человек с хроническими инфекциями, вызванными вирусом гепатита B, и риск того, что эти инфицированные люди в конечном итоге умрут от заболеваний печени, связанных с HBV инфекцией, может достигать от 15% до 25%, и более одного миллиона человек ежегодно умирают от этих болезней во всем мире (Dienstag J.L., там же; и Liaw Y.F. et al., там же).

Современные лекарственные препараты для лечения хронической инфекции HBV можно разделить на интерфероны (IFN) и аналоги нуклеозидов или нуклеотидов (NA) (Dienstag J.L., там же; Kwon H., Lok A.S., Hepatitis B therapy, Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol., 2011 May;8(5): 275-284; и Liaw Y.F. et al., там же). Для пациентов, инфицированных HBV (например, пациентов с хроническим гепатитом B), вышеуказанные лекарственные препараты самостоятельно или в комбинации могут эффективно подавлять репликацию вируса в организме и значительно снижать уровни HBV ДНК; в частности, после 52 недель или более таких курсов лечения частота ответа, когда уровень HBV ДНК в организме ниже нижнего предела определения (вирусологический ответ) может достигать 40-80% (Kwon H. et al., там же). Однако лечение вышеуказанными препаратами самостоятельно или в комбинации не может полностью элиминировать вирус HBV у инфицированных людей, и частота ответа, выражающегося в HBsAg-негативной конверсии или сероконверсии HBsAg (полный клиренс вируса HBV у инфицированного человека), вызванного при этом, обычно составляет менее 5% (Kwon H. et al., там же).

Разработка новых лекарственных препаратов для лечения хронической HBV инфекции на основе иммунологических средств является одним из важных направлений исследований в данной области. Иммунотерапия хронической HBV инфекции обычно проводится двумя способами: активная иммунотерапия (соответствующие лекарственные формы, включающие вакцины и т. д.) и пассивная иммунотерапия (соответствующие лекарственные формы, включающие антитела, и т. д.). Активная иммунотерапия относится к введению терапевтической вакцины (в том числе белковой вакцины, пептидной вакцины, вакцины на основе нуклеиновой кислоты и т. д.) для стимуляции организма человека с хронической HBV инфекцией, для активного формирования клеточного иммунного ответа (эффект CTL и т. д.) или/и гуморального иммунного ответа против HBV (антитела и т.д.) для достижения цели ингибирования или элиминации HBV. В настоящее время отсутствует однозначно значимый и эффективный активный иммунотерапевтический препарат/вакцина, который можно было бы использовать для лечения хронической HBV инфекции. Пассивная иммунотерапия (на примере антител) относится к введению инфицированному HBV человеку антитела с терапевтическими свойствами, и терапевтический эффект может достигаться антитело-опосредованной нейтрализацией вируса с блокированием HBV от инфицирования гепатоцитов новорожденных, или антитело-опосредованным иммунным клиренсом с удалением вирусов и инфицированных клеток печени из организма. В настоящее время поликлональные анти-HBs антитела, выделенные из сыворотки/ плазмы субъектов, имевших ответ на профилактическую вакцину против гепатита B, или субъектов, выздоровевших от HBV инфекции, а именно иммуноглобулин с высокой активностью против гепатита B (HBIG), широко используются для блокирования вертикальной передачи HBV от матери ребенку, предупреждения реинфицирования HBV после трансплантации печени у пациентов с хронической HBV инфекцией и предупреждения инфицирования людей, случайно подвергшихся воздействию HBV. Однако прямое применение HBIG для лечения пациентов, инфицированных HBV (например, пациентов с хроническим гепатитом B), не имеет очевидного эффекта и имеет множество ограничений, таких как небольшое число источников высокоактивной плазмы, высокая цена, нестабильный характер и потенциальные проблемы, связанные с безопасностью.

Следовательно, срочно и необходимо разработать инновационные способы лечения и лекарственные препараты для инфицированных HBV людей, которые могут более эффективно элиминировать вирус HBV, в частности, HBsAg.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения ранее разработали гуманизированное анти-HBsAg антитело с превосходными свойствами, которое может нейтрализовать вирулентность HBV in vivo и снизить сывороточные уровни HBV ДНК и/или HBsAg. На основе результатов предыдущих исследований авторы настоящего изобретения вложили много творческой работы по проведению глубоких исследований и конструированию гуманизированного антитела, тем самым разработав анти-HBsAg антитело с pH-зависимой способностью связываться с антигеном. Анти-HBsAg антитело по настоящему изобретению имеет более высокую аффинность связывания с HBsAg при нейтральном значении pH, чем при кислом значении pH, за счет чего в результате реализуется повторное использование антитела, период полураспада антитела значительно увеличивается, и эффективность клиренса HBV повышается. Кроме того, авторы настоящего изобретения получили антитело-«мусорщик» и дополнительно пролонгировали период полураспада антитела введением мутации в Fc-область вышеуказанного антитела для повышения его аффинности к hFcRn или mFcγRII в нейтральных условиях.

Антитело по настоящему изобретению является чрезвычайно преимущественным, поскольку оно не только сохраняет активность к снижению сывороточного уровня HBV ДНК и/или HBsAg, но также имеет более длительное время подавления антигена, тем самым существенно снижая инъекционную дозу и частоту введения при лечении, и имеет большое клиническое значение.

Антитело по изобретению

Следовательно, в одном аспекте настоящее изобретение относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, способному специфически связываться с HBsAg, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с HBsAg с более высокой аффинностью при нейтральном значении pH, чем при кислом значении pH.

В некоторых вариантах осуществления нейтральное значение pH составляет от рН 6,7 до рН 7,5, например, pH 7,4.

В некоторых вариантах осуществления кислое значение pH составляет от pH 4,0 до pH 6,5, например, pH 6,0.

В некоторых вариантах осуществления отношение K_D связывания с HBsAg при кислом pH (например, pH 6,0) к K_D связывания с HBsAg при нейтральном pH (например, pH 7,4) (т.е. значение K_D (кислый pH)/K_D (нейтральный pH)) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составлят выше 1, например не ниже 1,5, не ниже 2, не ниже 3, не ниже 4, не ниже 5, не ниже 6, не ниже 7, не ниже 8, не ниже 9, не ниже 10, не ниже 15, не ниже 20, не ниже 30, не ниже 40, не ниже 50, не ниже 60, не ниже 70, не ниже 80, не ниже 90, не ниже 100, не ниже 300, не ниже 500, не ниже 800, не ниже 1000, не ниже 2000, не ниже 5000 или не ниже 10000. В некоторых вариантах осуществления значение K_D (кислый pH)/K_D (нейтральный pH) выше 1 и не выше 10000, например, не выше 5000, не выше 2000, не выше 1000, не больше 900, не выше 800, не выше 700, не выше 600, не выше 500, не выше 400, не выше 300, не выше 200, не выше 100, не выше 90, не выше 80, не выше 70, не выше 60, не выше 50, не выше 40, не выше 30, не выше 20 или не выше 10. K_D можно измерить с использованием метода, известного в данной области техники, например, методом SPR (например, Biacore).

В некоторых вариантах осуществления отношение K_D связывания с HBsAg при pH 6,0 к K_D связывания с HBsAg при pH 7,4 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет выше 1, например не ниже 1,5, не ниже 2. В некоторых вариантах осуществления значение K_D антитела по изобретению при нейтральном значении pH может составлять 10^-7M, 10^-8M, 10^-9M, 10^-10M, 10^-11M, 10^-12M или ниже. В некоторых вариантах осуществления величина K_D антитела по настоящему изобретению при кислом значении pH может составлять 10^-9M, 10^-8M, 10^-7M, 10^-6M или более.

В некоторых вариантах осуществления отношение EC₅₀ связывания с HBsAg при кислом значении pH (например, pH 6,0) к EC₅₀ связывания с HBsAg при нейтральном значении pH (например, pH 7,4) (т.е. значение EC₅₀ (кислый pH)/EC₅₀ (нейтральный pH)) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет выше 1, например не ниже 1,5, не ниже 2, не ниже 3, не ниже 4, не ниже 5, не ниже 6, не ниже 7, не ниже 8, не ниже 9, не ниже 10, не ниже 15, не ниже 20, не ниже 30, не ниже 40, не ниже 50, не ниже 60, не ниже 70, не ниже 80, не ниже 90, не ниже 100, не ниже 300, не ниже 500, не ниже 800, не ниже 1000, не ниже 2000, не ниже 5000 или не ниже 10000. В некоторых вариантах осуществления значение EC₅₀ (кислый pH)/EC₅₀ (нейтральный pH) составляет выше 1 и не выше 10000, например, не выше 5000, не выше 2000, не выше е 1000, не выше 900 и не выше 800, не выше 700, не выше 600, не выше 500, не выше 400, не выше 300, не выше 200, не выше 100, не выше 90, не выше 80, не выше 70, не выше 60, не выше 50, не выше 40, не выше 30, не выше 20 или не выше 10. В некоторых вариантах осуществления ЕС₅₀ измеряется методом ELISA, например, рассчитывается с помощью регрессионного анализа кривой доза-ответ, построенной с использованием метода ELISA.

В некоторых вариантах осуществления отношение EC₅₀ связывания с HBsAg при pH 6,0 к EC₅₀ связывания с HBsAg при pH 7,4 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет выше 1, например, не ниже 1,5, или не ниже 2.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению получают из гуманизированного антитела против HBV 162 (которое подробно описано в заявке на патент Китая 201610879693.5).

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению связывается с аминокислотами 121-124 HBsAg с более высокой аффинностью при нейтральном значении pH, чем при кислом значении pH.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую HCDR1, HCDR2 и HCDR3, которая имеет одну или более следующих характеристик:

(i) HCDR1 имеет, по меньшей мере, одну аминокислоту (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот), замененную гистидином, по сравнению с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 11;

(ii) HCDR2 имеет, по меньшей мере, одну аминокислоту (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот), замененную гистидином, по сравнению с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 12; и/или

(iii) HCDR3 имеет, по меньшей мере, одну аминокислоту (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот), замененную гистидином, по сравнению с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 13.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VL), содержащую LCDR1, LCDR2 и LCDR3, которая имеет одну или более следующих характеристик:

(i) LCDR1 имеет, по меньшей мере, одну аминокислоту (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот), замененную гистидином, по сравнению с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 14;

(ii) LCDR2 имеет, по меньшей мере, одну аминокислоту (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот), замененную гистидином по сравнению с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 15; и/или

(iii) LCDR3 имеет, по меньшей мере, одну аминокислоту (например, 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот), замененную гистидином, по сравнению с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 16.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую следующие 3 CDR:

(i) HCDR1 с последовательностью X₁X₂YHX₃N (SEQ ID NO: 26), где X₁ выбрана из Y или H, X₂ выбрана из G или R, X₃ выбрана из W или Y;

(ii) HCDR2 с последовательностью YIX₄X₅DGSVX₆YNPSLEN (SEQ ID NO: 27), где X₄ выбрана из S, N или H, X₅ выбрана из Y или H, X₆ выбрана из L, H или Q; и

(iii) HCDR3 с последовательностью GFDH (SEQ ID NO: 13);

и/или

(b) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую следующие 3 CDR:

(iv) LCDR1 с последовательностью RSSQSLVHSYGDX₇YLH (SEQ ID NO: 28), где X₇ выбрана из T или N;

(v) LCDR2 с последовательностью KVSNRFS (SEQ ID NO: 15); и

(vi) LCDR3 с последовательностью SQNTHX₈PYT (SEQ ID NO: 29), где X₈ выбрана из V, L или H.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую следующие 3 CDR:

(i) HCDR1, который состоит из последовательности, выбранной из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 17, 21, 24;

(ii) HCDR2, который состоит из последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 18, 20, 22, 12; и

(iii) HCDR3, который состоит из последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13;

и/или

(b) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую следующие 3 CDR:

(iv) LCDR1, который состоит из последовательности, выбранной из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 14, 25;

(v) LCDR2, который состоит из последовательности, показанной в SEQ ID NO: 15; и

(vi) LCDR3, который состоит из последовательности, выбранной из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 19, 16, 23.

В некоторых вариантах осуществления X₁ выбрана из H, X₂ выбрана из G, X₃ выбрана из W или Y, X₄ выбрана из S или H, X₅ выбрана из Y, X₆ выбрана из L или H, X₇ выбрана из T или N, X₈ выбрана из V, L или H.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую следующие 3 CDR:

(i) HCDR1, который состоит из последовательности, выбранной из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 17, 24;

(ii) HCDR2, который состоит из последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 18, 12; и

(iii) HCDR3, который состоит из последовательности, показанной в SEQ ID NO: 13;

и/или

(b) вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую следующие 3 CDR:

(iv) LCDR1, который состоит из последовательности, выбранной из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 14, 25;

(v) LCDR2, который состоит из последовательности, показанной в SEQ ID NO: 15; и

(vi) LCDR3, который состоит из последовательности, выбранной из следующих последовательностей: SEQ ID NO: 19, 16, 23.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(1) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1, показанный в SEQ ID NO: 21, HCDR2, показанный в SEQ ID NO: 22, HCDR3, показанный в SEQ ID NO: 13; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1, показанный в SEQ ID NO: 14, LCDR2, показанный в SEQ ID NO: 15, LCDR3, показанный в SEQ ID NO: 23;

(2) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1, показанный в SEQ ID NO: 17, HCDR2, показанный в SEQ ID NO: 18, HCDR3, показанный в SEQ ID NO: 13; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1, показанный в SEQ ID NO: 14, LCDR2, показанный в SEQ ID NO: 15, LCDR3, показанный в SEQ ID NO: 19;

(3) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1, показанный в SEQ ID NO: 17, HCDR2, показанный в SEQ ID NO: 20, HCDR3, показанный в SEQ ID NO: 13; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1, показанный в SEQ ID NO: 14, LCDR2, показанный в SEQ ID NO: 15, LCDR3, показанный в SEQ ID NO: 16;

(4) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1, показанный в SEQ ID NO: 24, HCDR2, показанный в SEQ ID NO: 12, HCDR3, показанный в SEQ ID NO: 13; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1, показанный в SEQ ID NO: 25, LCDR2, показанный в SEQ ID NO: 15, LCDR3, показанный в SEQ ID NO: 16;

(5) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1, показанный в SEQ ID NO: 17, HCDR2, показанный в SEQ ID NO: 12, HCDR3, показанный в SEQ ID NO: 13; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1, показанный в SEQ ID NO: 25, LCDR2, показанный в SEQ ID NO: 15, LCDR3, показанный в SEQ ID NO: 23; или

(6) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1, показанный в SEQ ID NO: 17, HCDR2, показанный в SEQ ID NO: 12, HCDR3, показанный в SEQ ID NO: 13; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1, показанный в SEQ ID NO: 25, LCDR2, показанный в SEQ ID NO: 15, LCDR3, показанный в SEQ ID NO: 16.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит каркасную область иммуноглобулина человека (например, каркасную область, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодированной геном антитела зародышевой линии человека), и каркасная область необязательно содержит одну или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) обратных мутаций от остатков человека на остатки мыши.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодированной геном тяжелой цепи зародышевой линии человека, и/ или каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодированной геном легкой цепи зародышевой линии человека.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодированной геном тяжелой цепи зародышевой линии человека 4-28-02 (SEQ ID NO: 38), и каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодированной геном легкой цепи зародышевой линии человека 2D-28-01 (SEQ ID NO: 39), и каркасная область тяжелой цепи и/или каркасная область легкой цепи необязательно содержит одну или более (например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10) обратных мутаций из остатков человека на остатки мыши.

В некоторых вариантах осуществления VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH FR1, как показано в SEQ ID NO: 30, VH FR2, как показано в SEQ ID NO: 31, VH FR3, как показано в SEQ ID NO: 32, и VH FR4, показанную в SEQ ID NO: 33.

В некоторых вариантах осуществления VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL FR1, как показано в SEQ ID NO: 34, VL FR2, как показано в SEQ ID NO: 35, VL FR3, как показано в SEQ ID NO: 36, и VL FR4, показанную в SEQ ID NO: 37.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из следующих последовательностей:

(i) последовательности, показанной в любой из SEQ ID NO: 3, 5, 6, 8;

(ii) последовательности с заменой, делецией или добавлением одной или более аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, показанной в любой из SEQ ID NO: 3, 5, 6, 8; или

(iii) последовательности с идентичностью последовательности, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, показанной в любой из SEQ ID NO: 3, 5, 6, 8;

и

(b) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из следующих последовательностей:

(iv) последовательности, показанной в любой из SEQ ID NO: 4, 2, 7, 9, 10;

(v) последовательности с заменой, делецией или добавлением одной или более аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, показанной в любой из SEQ ID NO: 4, 2, 7, 9, 10; или

(vi) последовательности с идентичностью последовательности, по меньшей мере, 80%, по меньшей мере, 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, показанной в любой из SEQ ID NO: 4, 2, 7, 9, 10.

Предпочтительно замена, описанная в (ii) или (v), представляет собой консервативную замену.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(1) VH с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 3, и VL с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 4;

(2) VH с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 5, и VL с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 2;

(3) VH с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 6, и VL с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 7;

(4) VH с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 8, и VL с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 9;

(5) VH с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 3, и VL с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 10; или

(6) VH с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 3, и VL с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 9.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит константную область, полученную из иммуноглобулина человека.

В некоторых вариантах осуществления тяжелая цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит константную область тяжелой цепи, полученную из иммуноглобулина человека (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), и легкая цепь антитела или антигенсвязывающего фрагмента содержит константную область легкой цепи, полученную из иммуноглобулина человека (например, κ или λ).

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) константную область тяжелой цепи (СН) человеческого иммуноглобулина или его варианта, где вариант имеет замену, делецию или добавление одной или более аминокислот или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление максимум 20, максимум 15, максимум 10 или максимум 5 аминокислот или любую их комбинацию; например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот или любую их комбинацию) по сравнению с последовательность дикого типа, из которой она получена; и/ или

(b) константную область легкой цепи (CL) человеческого иммуноглобулина или его варианта, где вариант имеет замену, делецию или добавление одной или более аминокислот или любую их комбинацию (например, замену, делецию или добавление максимум 20, максимум 15, максимум 10 или максимум 5 аминокислот или любую их комбинацию; например, замену, делецию или добавление 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот или любую их комбинацию) по сравнению с последовательность дикого типа, из которой она получена.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи человеческого IgG1 или IgG4. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи (СН), как показано в SEQ ID NO: 40.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению содержит вариант константной области тяжелой цепи (СН) человеческого иммуноглобулина, где вариант имеет повышенную аффинность к hFcRn или mFcγRII при нейтральном значении pH (например, pH 7,4) по сравнению с последовательностью дикого типа, из которой он получен. В таких вариантах осуществления вариант обычно имеет замену, по меньшей мере, одной аминокислоты по сравнению с последовательностью дикого типа, из которой он получен.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG1, где вариант имеет следующие замены по сравнению с последовательностью дикого типа, из которой он получен: (i) M252Y , N286E, N434Y; или (ii) K326D, L328Y; где вышеуказанные аминокислотные положения являются положениями согласно системе нумерации Kabat. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи (СН), как показано в SEQ ID NO: 42 или 43.

В некоторых вариантах осуществления константная область легкой цепи представляет собой константную область легкой κ-цепи. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой цепи (CL), как показано в SEQ ID NO: 41.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(1) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 3, и CH, показанный в SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 4, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(2) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 3, и CH, показанный в SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 4, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(3) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 3, и CH, показанный в SEQ ID NO: 48, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 4, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(4) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 5, и CH, показанный в SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 2, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(5) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 5, и CH, показанный в SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 2, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(6) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 5, и CH, показанный в SEQ ID NO: 48, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 2, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(7) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 6, и CH, показанный в SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 7, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(8) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 6, и CH, показанный в SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 7, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(9) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 6, и CH, показанный в SEQ ID NO: 48, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 7, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(10) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 8, и CH, показанный в SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 9, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(11) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 8, и CH, показанный в SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 9, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(12) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 8, и CH, показанный в SEQ ID NO: 48, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 9, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(13) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 3, и CH, показанный в SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 10, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(14) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 3, и CH, показанный в SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 10, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(15) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 3, и CH, показанный в SEQ ID NO: 48, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 10, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(16) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 3, и CH, показанный в SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 9, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(17) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 3, и CH, показанный в SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 9, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41; или

(18) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 3, и CH, показанный в SEQ ID NO: 48, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 9, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41.

Получение антитела

Антитело по настоящему изобретению может быть получено различными способами, известными в данной области, например, можно получить с использованием генной инженерии или технологии рекомбинантной ДНК. Например, молекулы ДНК, кодирующие гены тяжелой и легкой цепей антитела по настоящему изобретению, получают химическим синтезом или ПЦР-амплификацией. Полученную молекулу ДНК вставляют в экспрессионный вектор и затем трансфектируют в клетку-хозяин. Затем трансфектированную клетку-хозяин культивируют в определенных условиях, и экспрессируется антитело по настоящему изобретению.

Антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению может быть получен гидролизом полной молекулы антитела (см. Morimoto et al., J. Biochem. Biophys. Methods, 24: 107-117 (1992) и Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). Кроме того, данные антигенсвязывающие фрагменты также могут быть непосредственно продуцированы рекомбинантными клетками-хозяевами (см. обзор в публикации Hudson, Curr. Opin. Immunol., 11: 548-557 (1999); Little et al., Immunol. Today, 21: 364- 370 (2000)). Например, Fab'-фрагменты можно получить непосредственно из клеток-хозяев; Fab'-фрагменты можно химически связать с образованием фрагментов F(ab')₂ (Carter et al., Bio/Technology, 10: 163-167 (1992)). Кроме того, фрагменты Fv, Fab или F(ab')₂ также можно непосредственно выделить из культуральной среды рекомбинантных клеток-хозяев. Специалисты в данной области полностью осведомлены о других методах получения этих антигенсвязывающих фрагментов.

Следовательно, в еще одном аспекте настоящее изобретение относится к выделенной молекуле нуклеиновой кислоты, содержащей нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению, или его вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления выделенная молекула нуклеиновой кислоты кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению или его вариабельную область тяжелой цепи и/или вариабельную область легкой цепи.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к вектору (например, вектору клонирования или вектору экспрессии), содержащему выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления вектор по настоящему изобретению представляет собой, например, плазмиду, космиду, бактериофаг и т.п.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к клетке-хозяину, содержащей выделенную молекулу нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению или вектор по настоящему изобретению. Такая клетка-хозяин включает, не ограничиваясь этим, прокариотическую клетку, такую как клетка E. coli, и эукариотическую клетку, такую как дрожжевая клетка, клетка насекомого, растительная клетка и животная клетка (например, клетка млекопитающего, такая как клетка мыши, клетка человека и т. д.). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления клетка-хозяин по настоящему изобретению представляет собой клетку млекопитающего, такую как CHO (например, CHO-K1, CHO-S, CHO DG44).

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению, который включает культивирование клетки-хозяина по настоящему изобретению в условиях, которые обеспечивают экспрессию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры культивированных клеток-хозяев.

Производное антитела

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению можно дериватизировать, например, связать с другой молекулой (например, с другим полипептидом или белком). Как правило, дериватизация (например, мечение) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента не будет оказывать отрицательного влияния на его связывание с HBsAg. Следовательно, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению также включает такие дериватизированные формы. Например, антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению может быть функционально связан (посредством химического связывания, слияния генов, нековалентного связывания или другими способами) с одной или более другими молекулярными группами, такими как другое антитело (например, для образования биспецифического антитела), агент для детектирования, фармацевтический агент и/или белок или полипептид, способный опосредовать связывание антитела или антигенсвязывающего фрагмента с другой молекулой (например, авидиновой или полигистидиновой меткой).

Следовательно, в некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению является меченным. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению несет детектируемую метку, такую как фермент, радионуклид, флуоресцентный краситель, люминесцентное вещество (например, хемилюминесцентное вещество) или биотин. Детектируемая метка по настоящему изобретению может представлять собой любое вещество, которое можно детектировать посредством флуоресценции, спектроскопии, фотохимии, биохимии, иммунологии, электрических, оптических или химических средств. Такие метки хорошо известны в данной области, примеры которых включают, не ограничиваясь этим, фермент (например, пероксидазу хрена, щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, уреазу, глюкозооксидазу и т. д.), радионуклид (например, ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C или ³²P), флуоресцентный краситель (например, флуоресцеина изотиоцианат (FITC), флуоресцеин, тетраметилродамина изотиоцианат (TRITC), фикоэритрин (PE), техасский красный, родамин, квантовые точки или производные цианиновых красителей (например, Cy7, Alexa 750)), люминесцентное вещество (например, хемилюминесцентное вещество, такое как производное сложного эфира акридина), магнитные частицы (например, Dynabeads®), калориметрический маркер, такой как коллоидное золото или цветное стекло или пластик (например, полистирол, полипропилен, латекс и т.д.), и биотин, используемый для лигирования авидина (например, стрептавидина), модифицированный вышеуказанным маркером. В некоторых вариантах осуществления такая метка может подходить для иммунологического анализа (например, иммуноферментного анализа, радиоиммуноанализа, флуоресцентного иммуноанализа, хемилюминесцентного иммуноанализа и т. д.). В некоторых вариантах осуществления детектируемую метку, как описано выше, можно лигировать с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по настоящему изобретению через линкер разной длины для уменьшения потенциального стерического затруднения.

Фармацевтическая композиция и терапевтическое применение

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению можно использовать для профилактики или лечения HBV инфекции у субъекта (например, человека) или заболевания, ассоциированного с HBV инфекцией (например, гепатита B), для нейтрализация вирулентности HBV in vitro или у субъекта (например, человека), для снижения сывороточного уровня HBV ДНК и/или HBsAg у субъекта (например, человека) и для активации гуморального иммунного ответа на HBV у субъекта (например, пациента с хронической HBV инфекцией или хроническим гепатитом В).

Следовательно, в еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, которая включает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению и фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент. Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может также включать дополнительный фармацевтически активный агент. В некоторых вариантах осуществления дополнительный фармацевтически активный агент представляет собой лекарственное средство, используемое для профилактики или лечения HBV инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV инфекцией (например, гепатита B), например лекарственное средство на основе интерферона, такое как интерферон или пегилированный интерферон.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению в производстве лекарственного средства для профилактики и/или лечения HBV инфекции (например, у человека) или заболевания, ассоциированного с HBV инфекцией (например, гепатита B) у субъекта, для нейтрализации вирулентности HBV in vitro или у субъекта (например, у человека), для снижения сывороточного уровня HBV ДНК и/или HBsAg у субъекта (например, у человека) и/или для активации гуморального иммунного ответа на HBV у субъекта (например, у пациента с хронической HBV инфекцией или хроническим гепатитом B).

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики или лечения HBV инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV инфекцией (например, гепатита B) у субъекта (например, у человека), для нейтрализации вирулентности HBV in vivo или у субъекта (например, у человека), для снижения сывороточного уровня HBV ДНК и/или HBsAg у субъекта (например, у человека) и/ или для активации гуморального иммунного ответа на HBV у субъекта (например, у пациента с хронической HBV инфекцией или хроническим гепатитом B), где способ включает введение эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению или фармацевтической композиции по настоящему изобретению субъекту, нуждающемуся в этом.

Лекарственные препараты и фармацевтические композиции, обеспеченные настоящим изобретением, можно использовать самостоятельно или в комбинации, и также можно использовать в комбинации с другими фармацевтически активными агентами (например, другими противовирусными агентами, такими как препараты на основе интерферона, такие как интерферон или пегилированный интерферон).

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить обычным путем введения, включая, не ограничиваясь этим, пероральный, буккальный, сублингвальный, внутриглазной, местный, парентеральный, ректальный, интратекальный, в цитоплазматический ретикулум, ингвинальный, внутрипузырный, местный (например, порошок, мазь или капли) или назальный путь. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению можно вводить различными способами, известными в данной области. Однако для многих терапевтических применений предпочтительным путем/способом введения является парентеральное введение (например, внутривенная инъекция, подкожная инъекция, внутрибрюшинная инъекция, внутримышечная инъекция). Специалисту в данной области должно быть понятно, что путь и/или способ введения будут варьироваться в зависимости от предполагаемой цели. В предпочтительном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению вводят внутривенной инфузией или инъекцией.

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно формулировать в виде различных лекарственных форм, таких как жидкие, полутвердые и твердые формы, например раствор (например, инъекционный раствор), дисперсия или суспензия, таблетка, порошок, гранула, эмульсия, пилюля, сироп, порошок, липосома, капсула и суппозиторий. Предпочтительная лекарственная форма зависит от предполагаемого способа введения и терапевтического применения.

Например, одной предпочтительной лекарственной формой является инъекционный раствор. Такой инъекционный раствор может представлять собой стерильный раствор для инъекций. Например, стерильный раствор для инъекций может быть приготовлен следующим способом: необходимую дозу антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению включают в подходящий растворитель и, необязательно, другие предполагаемые ингредиенты (в том числе, не ограничиваясь этим, регулятор pH, поверхностно-активное вещество, адъювант, усилитель ионной силы, изотонический агент, консервант, разбавитель или любую их комбинацию) включают одновременно, и затем проводят стерилизацию фильтрованием. Кроме того, стерильный раствор для инъекций может быть приготовлен в виде стерильного порошка (например, полученного вакуумной сушкой или сублимационной сушкой) для удобства хранения и применения. Такой стерильный порошок перед использованием можно диспергировать в подходящем носителе, таком как стерильная апирогенная вода.

Другой предпочтительной лекарственной формой является дисперсия. Дисперсию можно приготовить следующим способом: антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению включают в стерильный носитель, содержащий основную дисперсионную среду и, возможно, другие предполагаемые ингредиенты (в том числе, не ограничиваясь этим, регулятор pH, поверхностно-активное вещество, адъювант, усилитель ионной силы, изотонический агент, консервант, разбавитель или любую их комбинацию). Кроме того, в дисперсию также может быть включен агент, замедляющий всасывание, такой как соль моностеарат и желатин, чтобы получить ожидаемые фармакокинетические свойства.

Другой предпочтительной лекарственной формой является твердая лекарственная форма для перорального введения, включающая капсулу, таблетку, порошок, гранулы и т.п. Такая твердая лекарственная форма обычно содержит, по меньшей мере, одно из следующего: (а) инертный эксципиент (или носитель) для лекарственного препарата, такой как цитрат натрия и фосфат кальция; (b) наполнитель, такой как крахмал, лактоза, сахароза, манноза и кремниевая кислота; (c) связующее вещество, такое как карбоксиметилцеллюлоза, альгинат, желатин, поливинилпирролидон, сахароза и аравийская камедь; (d) увлажнитель, такой как глицерин; (e) разрыхлитель, такой как агар, карбонат кальция, картофельный или тапиоковый крахмал; (f) замедлитель всасывания, такой как олефин; (g) ускоритель всасывания, такой как соединение четвертичного аммония; (h) смачивающий агент, такой как цетиловый спирт и моностеарат глицерина; (i) адсорбент, такой как каолин и бентонит; (j) смазывающее вещество, такое как тальк, стеарат кальция, стеарат магния, твердый полиэтиленгликоль, додецилсульфат натрия или любая их комбинация. В случае лекарственных форм в виде таблеток и капсул также может быть включен буфер.

Кроме того, модификатор скорости высвобождения (т.е. агент, способный изменять скорость высвобождения лекарственного средства) также может быть добавлен к твердой лекарственной форме для перорального введения для получения лекарственной формы с модифицированным высвобождением или импульсным высвобождением. Такой модификатор скорости высвобождения включает, не ограничиваясь этим, карбоксипропилметилцеллюлозу, метилцеллюлозу, натрий карбоксиметилцеллюлозу, этилцеллюлозу, ацетилцеллюлозу, полиэтиленоксид, ксантановую камедь, сополимер изоакриловой кислоты, гидрогенизированное ароматизирующее масло, карнаубский воск, парафин, ацетилфталилцеллюлозу, фталат карбоксипропилметилцеллюлозы, сополимер метакриловой кислоты или любую их комбинацию. Лекарственная форма с модифицированным высвобождением или импульсным высвобождением может содержать один или группу модификаторов скорости высвобождения.

Другой предпочтительной лекарственной формой является жидкая лекарственная форма для перорального введения, включающая эмульсию, раствор, суспензию, сироп и т.п. В дополнение к активным ингредиентам такая жидкая лекарственная форма для перорального введения может дополнительно содержать инертные растворители, обычно используемые в данной области, например воду или другие растворители, такие как этиловый спирт, изопропанол, пропиленгликоль, 1,3-бутиленгликоль, масло (например, такое как масло из семян хлопчатника, арахисовое масло, кукурузное масло, оливковое масло, ароматизирующее масло и кунжутное масло), глицерин, полиэтиленгликоль и сложный эфир жирной кислоты и сорбитана и любые их комбинации. В дополнение к этим инертным растворителям такая жидкая лекарственная форма для перорального применения может дополнительно содержать увлажнитель, эмульгирующий агент, суспендирующий агент, подслащивающий агент, вкусовое вещество, ароматизирующий агент и т.п.

Кроме того, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению может находиться в разовой лекарственной форме в фармацевтической композиции для удобства введения. Фармацевтическая композиция согласно изобретению должна быть стерильной и стабильной в условиях производства и хранения.

Лекарственный препарат и фармацевтическая композиция, обеспеченные изобретением, могут использоваться самостоятельно или в комбинации, или могут использоваться в комбинации с дополнительным фармацевтически активным агентом (например, другими противовирусными агентами, например агентами типа интерферона, такими как интерферон или пегилированный интерферон). В некоторых предпочтительных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению используют в комбинации с другим противовирусным агентом(ами) для профилактики и/или лечения заболевания, ассоциированного с HBV инфекцией. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по изобретению и такой противовирусный агент(ы) можно вводить одновременно, по отдельности или последовательно. Такие противовирусные средства включают, не ограничиваясь этим, средства типа интерферона, рибавирин, адамантан, гидроксимочевину, IL-2, L-12 и пентакарбоксицитозольную кислоту и т. д.

Фармацевтическая композиция по изобретению может содержать «терапевтически эффективное количество» или «профилактически эффективное количество» антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению. «Профилактически эффективное количество» относится к количеству, которое достаточно для предупреждения, подавления или замедления развития заболевания (такого как HBV инфекция или заболевание, ассоциированное с HBV инфекцией). «Терапевтически эффективное количество» относится к количеству, которое достаточно для лечения или, по меньшей мере, частичного подавления заболевания и его осложнений у пациента с этим заболеванием. Терапевтически эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению может варьироваться в зависимости от следующих факторов: тяжести заболевания, подлежащего лечению, общего состояния иммунной системы пациента, общих показателей пациента, таких как возраст, масса тела и пол, способов введения лекарственных препаратов, дополнительных методов лечения, применяемые одновременно, и т.п.

Режим дозирования можно скорректировать для обеспечения оптимального желаемого эффекта (например, терапевтического или профилактического эффекта). Например, можно ввести разовую дозу, или можно ввести несколько доз в течение периода времени, или доза может быть пропорционально снижена или повышена в зависимости от требований терапевтической ситуации.

Для антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по изобретению примерный и неограничивающий диапазон терапевтически или профилактически эффективного количества составляет от 0,025 до 50 мг/кг, более предпочтительно от 0,1 до 50 мг/кг, более предпочтительно от 0,1 до 25 мг/кг, от 0,1 до 10 мг/кг. Следует отметить, что доза может варьироваться в зависимости от типа и тяжести заболевания, которое требуется лечить. Кроме того, специалисту в данной области должно быть понятно, что для любого конкретного пациента конкретный режим дозирования должен корректироваться в течение времени в зависимости от потребностей пациента и профессиональной оценки, сделанной врачом; диапазон доз, представленный здесь, приводится только с целью иллюстрации, а не для определения применения или объема фармацевтической композиции по изобретению.

Набор и детектирование для применения

Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению может специфически связываться с HBsAg, так что его можно использовать для детектирования присутствия или уровня HBsAg в образце.

Следовательно, в еще одном аспекте настоящее изобретение относится к набору, содержащему антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению несет детектируемую метку. В еще одних вариантах осуществления набор дополнительно включает второе антитело, которое специфически распознает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению. Предпочтительно второе антитело дополнительно содержит детектируемую метку. Такие детектируемые метки хорошо известны специалистам в данной области и включают, не ограничиваясь этим, радиоизотоп, флуоресцентное вещество, люминесцентное вещество, окрашенное вещество и фермент (например, пероксидазу хрена) и т.п.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу детектирования присутствия или уровня белка HBsAg в образце, который включает: применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению дополнительно содержит детектируемую метку. В еще одних вариантах осуществления способ дополнительно включает применение второго антитела, несущего детектируемую метку, для детектирования антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению. Способ может использоваться для диагностических целей или для недиагностических целей (например, образец является образцом клеток, а не образцом от пациента).

В некоторых вариантах осуществления способ включает: (1) приведение образца в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом по настоящему изобретению; (2) детектирование образования комплекса между антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и белком HBsAg или определение количества комплекса. Образование комплекса указывает на присутствие белка HBsAg и/или HBV.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к способу диагностики того, инфицирован ли субъект HBV, который включает: применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению для детектирования присутствия белка HBsAg в образце от субъекта. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению дополнительно содержит детектируемую метку. В еще одних вариантах осуществления способ дополнительно включает использование второго антитела, несущего детектируемую метку, для детектирования антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к применению антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению в производстве набора для детектирования присутствия или уровня белка HBsAg в образце или для диагностики того, инфицирован ли субъект HBV.

Определение терминов

В настоящем изобретении, если не указано иное, то используемые здесь научные и технические термины имеют значения, обычно понимаемые специалистами в данной области. Кроме того, стадии культивирования клеток, биохимии, химии нуклеиновых кислот, иммунологические лабораторные исследования и другие рабочие стадии, использованные в данном описании, представляют собой обычные стадии, широко используемые в соответствующих областях. В то же время для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены определения и пояснения имеющих отношение терминов.

В рамках настоящего изобретения, термин «антитело» относится к молекуле иммуноглобулина, обычно состоящей из двух пар полипептидных цепей, где каждая пара имеет легкую цепь (LC) и тяжелую цепь (HC). Легкие цепи антитела можно разделить на легкие цепи κ (каппа) и λ (лямбда). Тяжелые цепи классифицируют как µ, δ, γ, α или ε, и изотипы антитела определяются как IgM, IgD, IgG, IgA и IgE соответственно. В легкой и тяжелой цепях вариабельные и константные области соединены «J»-областью примерно из 12 или более аминокислот, и тяжелая цепь также включает «D»-область примерно из 3 или более аминокислот. Каждая тяжелая цепь состоит из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области тяжелой цепи (CH). Константная область тяжелой цепи состоит из 3 доменов (CH1, CH2 и CH3). Каждая легкая цепь состоит из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL). Константная область легкой цепи состоит из домена CL. Константный домен не участвует непосредственно в связывании антитела и антигена, но проявляет различные эффекторные функции, такие как опосредование связывания иммуноглобулина с тканью или фактором хозяина, включая различные клетки иммунной системы (например, эффекторные клетки) и первый компонент классической системы комплемента (C1q). Области VH и VL также можно подразделить на гипервариабельные участки (называемые определяющими комплементарность участками (CDR)), перемежающиеся относительно более консервативными областями, называемыми каркасными областями (FR). Каждая VH и VL состоит из 3 CDR и 4 FR, расположенных в следующем порядке от аминоконца к карбоксиконцу: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Вариабельные области (VH и VL) каждой пары тяжелая цепь/легкая цепь образуют сайт связывания антигена соответственно. Отнесение аминокислот к каждой области или домену можно провести согласно определениям Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 и 1991)), или Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 878-883.

В рамках настоящего изобретения, термин «определяющий комплементарность участок» или «CDR» относится к аминокислотным остаткам в вариабельной области антитела, которые отвечают за связывание антигена. Каждая из вариабельных областей тяжелой цепи и легкой цепи содержит три CDR, названных CDR1, CDR2 и CDR3. Точные границы этих CDR могут быть определены согласно различным системам нумерации, известным в данной области, например, согласно системе нумерации Kabat (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991), системе нумерации Chothia (Chothia & Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901-917; Chothia et al. (1989) Nature 342: 878-883) или системе нумерации IMGT (Lefranc et al. al., Dev. Comparat. Immunol., 27: 55-77, 2003). Для любого конкретного антитела специалисты в данной области легко идентифицируют CDR, используя определения согласно каждой системе нумерации. Более того, соответствие между различными системами нумерации хорошо известно специалистам в данной области (например, см. публикацию Lefranc et al., Dev. Comparat. Immunol., 27: 55-77, 2003).

В настоящем изобретении CDR, содержащиеся в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте по настоящему изобретению, можно определить в соответствии с различными системами нумерации, известными в данной области. В некоторых вариантах осуществления CDR, содержащиеся в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте по настоящему изобретению, предпочтительно определяются с использованием системы нумерации Kabat, Chothia или IMGT. В некоторых вариантах осуществления CDR, содержащиеся в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте по настоящему изобретению, предпочтительно определяются с использованием системы нумерации Kabat.

В рамках настоящего изобретения, термин «каркасная область» или остатки «FR» относится к таким аминокислотным остаткам в вариабельной области антитела, которые не являются остатками CDR, как здесь определено выше.

Термин «антитело» не ограничивается каким-либо конкретным способом получения антитела. Например, термин включает рекомбинантное антитело, моноклональное антитело и поликлональное антитело. Антитело может представлять собой антитело разного изотипа, например, IgG (например, подтип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), антитело IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM.

В рамках настоящего изобретения, термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела относится к полипептиду, содержащему фрагмент полноразмерного антитела, который сохраняет способность специфически связываться с тем же антигеном, с которым связывается полноразмерное антитело, и/или конкурирует с полноразмерным антителом за специфическое связывание с антигеном, который также называют «антигенсвязывающим участком». См. в общем, монографию Fundamental Immunology, Ch. 7 (Paul W., ed., 2nd edition, Raven Press, NY (1989), которая в полном объеме включена здесь посредством ссылки для всех целей. Антигенсвязывающий фрагмент антитела может быть получен с использованием технологии рекомбинантной ДНК или ферментативного или химического расщепления интактного антитела. Неограничивающие примеры антигенсвязывающего фрагмента включают фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂, Fd, Fv, определяющий комплементарность участок (CDR), scFv, диатело, однодоменное антитело, химерное антитело, линейное антитело, нанотело (технологическая платформа Domantis), Probody и такие полипептиды, которые содержат, по меньшей мере, часть антитела, достаточную для придания полипептидам специфической антигенсвязывающей способности. Сконструированные варианты антител рассмотрены в публикации Holliger et al., 2005; Nat. Biotechnol., 23: 1126-1136.

В рамках настоящего изобретения, термин «полноразмерное антитело» относится к антителу, состоящему из двух «полноразмерных тяжелых цепей» и двух «полноразмерных легких цепей». Термин «полноразмерная тяжелая цепь» относится к полипептиду, состоящему из вариабельной области тяжелой цепи (VH), домена CH1 константной области тяжелой цепи, шарнирной области (HR), домена CH2 константной области тяжелой цепи и домена CH3 константной области тяжелой цепи в направлении от N-конца к C-концу; и, когда полноразмерное антитело относится к изотипу IgE, то необязательно оно также содержит домен CH4 константной области тяжелой цепи. Предпочтительно «полноразмерная тяжелая цепь» представляет собой полипептидную цепь, состоящую из VH, CH1, HR, CH2 и CH3 в направлении от N-конца к C-концу. «Полноразмерная легкая цепь» представляет собой полипептидную цепь, состоящую из вариабельной области легкой цепи (VL) и константной области легкой цепи (CL) в направлении от N-конца к C-концу. Две пары полноразмерных цепей антитела связаны дисульфидной связью между CL и CH1 и дисульфидной связью между HR двух полноразмерных тяжелых цепей. Полноразмерное антитело по настоящему изобретению может происходить от одного вида, такого как человек; также оно может представлять собой химерное антитело или гуманизированное антитело. Полноразмерное антитело по настоящему изобретению содержит два антигенсвязывающих сайта, образованных парами VH и VL соответственно, и два антигенсвязывающих сайта специфически распознают/связывают один и тот же антиген.

В рамках настоящего изобретения, термин «Fd» относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов VH и CH1; термин «фрагмент dAb» относится к фрагменту антитела, состоящему из домена VH (Ward et al., Nature, 341: 544 546 (1989)); термин «Fab-фрагмент» относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов VL, VH, CL и CH1; термин «F(ab')₂-фрагмент» относится к фрагменту антитела, состоящему из двух фрагментов Fab, соединенных дисульфидным мостиком в шарнирной области; термин «Fab'-фрагмент» относится к фрагменту, полученному восстановлением дисульфидной связи, соединяющей два фрагмента тяжелой цепи в фрагменте F(ab')₂, и состоит из интактной легкой цепи и фрагмента Fd (состоящего из доменов VH и CH1) тяжелой цепи.

В рамках настоящего изобретения, термин «Fv» относится к фрагменту антитела, состоящему из доменов VL и VH одного плеча антитела. Фрагмент Fv обычно считается наименьшим фрагментом антитела, который может образовывать полный антигенсвязывающий сайт. Обычно считается, что шесть CDR придают антителу антигенсвязывающую специфичность. Однако даже одна вариабельная область (например, фрагмент Fd, который содержит только три антигенспецифических CDR) может распознавать антиген и связываться с ним, хотя его аффинность может быть ниже, чем полный сайт связывания.

В рамках настоящего изобретения, термин «Fc» относится к фрагменту антитела, который образуется посредством связывания второй, третьей константной области первой тяжелой цепи антитела и второй, третьей константной области второй тяжелой цепи посредством дисульфидной связи. Фрагмент Fc антитела выполняет многочисленные различные функции, но не участвует в связывании антигена.

В рамках настоящего изобретения, термин «scFv» относится к одной полипептидной цепи, содержащей области VL и VH, где VL и VH связаны линкером (см., например, Bird et al., Science, 242:423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:5879-5883 (1988); и Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Roseburg and Moore eds, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)). Такие молекулы scFv могут иметь общую структуру: NH₂-VL-линкер-VH-COOH или NH₂-VH-линкер-VL-COOH. Подходящие линкеры предшествующего уровня техники состоят из повторяющихся аминокислотных последовательностей GGGGS или их вариантов. Например, можно использовать линкер, имеющий аминокислотную последовательность (GGGGS)₄, но также можно использовать его варианты (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448). Другие линкеры, которые можно использовать в настоящем изобретении, описаны в работах Alfthan et al. (1995), Protein Eng., 8:725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol., 31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res., 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol., 293:41-56 и Roovers et al. (2001), Cancer Immunol. В некоторых случаях также в scFv могут быть дисульфидные связи между VH и VL.

В рамках настоящего изобретения, термин «диатело» относится к фрагменту антитела, в котором VH- и VL-домены экспрессируются в одной полипептидной цепи, но используемый линкер является слишком коротким, чтобы позволить спариваться двум доменам одной и той же цепи, тем самым вынуждая один домен спариваться с комплементарным доменом другой цепи и образовывать два антигенсвязывающих сайта (см., например, работы Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993) и Poljak R.J. et al., Structure, 2: 1121-1123 (1994)).

Каждый из вышеуказанных фрагментов антитела сохраняет способность специфически связываться с тем же антигеном, с которым связывается полноразмерное антитело, и/или конкурировать с полноразмерным антителом за специфическое связывание с антигеном.

Обычные методы, известные специалистам в данной области (например, технология рекомбинантной ДНК или ферментативная или химическая фрагментация), могут использоваться для получения из конкретного антитела (например, антитела по настоящему изобретению) антигенсвязывающих фрагментов антитела (например, вышеуказанных фрагментов антител) и тестироваться на специфичность таким же образом, как и интактные антитела.

Здесь, если контекст явно не диктует иное, когда упоминается термин «антитело», то он включает не только интактное антитело, но также антигенсвязывающие фрагменты антитела.

В рамках настоящего изобретения, термины «моноклональное антитело», «McAb» и «mAb» имеют одинаковое значение и могут использоваться взаимозаменяемо. Термин относится к антителу или фрагменту антитела из популяции высокогомологичных молекул антител, т. е. к популяции полностью идентичных молекул антител, за исключением естественной мутации, которая может возникать спонтанно. Моноклональные антитела обладают высокой специфичностью к одному эпитопу антигена. Поликлональное антитело по сравнению с моноклональным антителом обычно включает, по меньшей мере, два или более разных антител, которые обычно распознают разные эпитопы на антигене. Кроме того, определение «моноклональное» просто указывает на характер антитела как полученного из высокогомогенной популяции антител и не должен толковаться как требующий получения антитела каким-либо конкретным методом.

В рамках настоящего изобретения, термин «химерное антитело» относится к антителу, часть легкой цепи или/или тяжелой цепи которого происходит от одного антитела (которое может происходить от определенного вида или относиться к определенному классу или подклассу антител), и другая часть его легкой цепи и/или тяжелой цепи происходит от другого антитела (которое может происходить от того же или разных видов или относиться к тому же или другому классу или подклассу антител), но в любом случае оно все еще сохраняет активность связывания с антигеном-мишенью (патент США № 4816567, Cabilly et al.; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851 6855 (1984)). Например, термин «химерное антитело» может включать такое антитело (например, человеческое-мышиное химерное антитело), в котором вариабельные области тяжелой и легкой цепей антитела происходят из первого антитела (например, мышиного антитела), тогда как константные области тяжелой цепи и легкой цепи антитела происходят из второго антитела (например, человеческого антитела). Для получения химерного антитела способы, известные в данной области, можно использовать для связывания вариабельных областей иммуноглобулина иммунизированного животного с константными областями иммуноглобулина человека (см., например, патент США № 4816567, Cabilly et al.). Например, ДНК, кодирующую VH, функционально связывают с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область тяжелой цепи, с получением гена полноразмерной тяжелой цепи. Последовательность гена константной области тяжелой цепи человека известна в данной области (см., например, Kabat E.A. et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication № 91-3242), и фрагменты ДНК, содержащие эти области, можно получить с помощью стандартной ПЦР-амплификации. Константная область тяжелой цепи может представлять собой константную область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM или IgD, но обычно предпочтительно представляет собой константную область IgG1 или IgG4. Например, ДНК, кодирующую VL, функционально связывают с другой молекулой ДНК, кодирующей константную область легкой цепи CL, с получением гена полноразмерной легкой цепи (и гена легкой цепи Fab). Последовательность гена константной области легкой цепи человека известна в данной области (см., например, Kabat E.A. et al. (1991), Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, NIH Publication № 91-3242), и фрагменты ДНК, содержащие эти области, могут быть получены стандартной ПЦР-амплификацией. Константная область легкой цепи может представлять собой константную область κ или λ, но обычно предпочтительно представляет собой константную область κ.

В рамках настоящего изобретения, термин «гуманизированное антитело» относится к сконструированному антителу «нечеловеческого» происхождения, аминокислотная последовательность которого была модифицирована для повышения гомологии с последовательностью человеческого антитела. В сущности, все или часть областей CDR гуманизированного антитела происходят из «нечеловеческого» антитела (донорного антитела), и все или часть областей не-CDR (например, FR вариабельной области и/или константная область) происходят из человеческого иммуноглобулина (реципиентного антитела). В некоторых вариантах осуществления CDR-участки гуманизированного антитела происходят из «нечеловеческого» антитела (донорного антитела), и все или часть не-CDR-участков (например, FR вариабельной области и/или константные области) происходят из человеческого иммуноглобулина (реципиентного антитела). Гуманизированное антитело обычно сохраняет ожидаемые свойства донорного антитела, включая, помимо прочего, антигенную специфичность, аффинность, реактивность и т. д. Донорным антителом может быть мышиное, крысиное, кроличье антитело или антитело примата, отличного от человека (например, яванского макака) с желаемыми свойствами (например, антигенной специфичностью, аффинностью, реактивностью и т. д.). Для получения гуманизированного антитела, методы, известные в данной области, можно использовать для вставки участков CDR иммунизированного животного в каркасные последовательности человека (см. патент США № 5225539, Winter; патент США № 5530101, Queen et al.; патенты США № 5585089; 5693762 и 6180370; и Lo, Benny, KC, editor, in Antibody Engineering: Methods and Protocols, volume 248, Humana Press, New Jersey, 2004).

В рамках настоящего изобретения, термин «ген антитела зародышевой линии» или «сегмент гена антитела зародышевой линии» относится к последовательности, присутствующей в геноме организма, кодирующего иммуноглобулин, который не претерпел процесса созревания, который может привести к генетическим перестройкам и мутациям для экспрессии определенного иммуноглобулина. В рамках настоящего изобретения, выражение «ген тяжелой цепи зародышевой линии» относится к гену антитела зародышевой линии или фрагменту гена, кодирующему тяжелую цепь иммуноглобулина, который включает ген V (вариабельный), ген D (обеспечивающий разнообразие), ген J (соединяющий) и ген C (константный); аналогично выражение «ген легкой цепи зародышевой линии» относится к гену антитела зародышевой линии или фрагменту гена, кодирующему легкую цепь иммуноглобулина, который включает ген V (вариабельный), ген J (соединяющий) и ген C (константный). В рамках настоящего изобретения, аминокислотная последовательность, кодированная геном антитела зародышевой линии или фрагментом гена антитела зародышевой линии, также называется «последовательностью зародышевой линии». Ген антитела зародышевой линии или фрагмент гена антитела зародышевой линии и соответствующие им последовательности зародышевой линии хорошо известны специалистам в данной области и могут быть получены или запрошены из профессиональных баз данных (например, IMGT, unswag, NCBI или VBASE2).

В рамках настоящего изобретения, термин «специфическое связывание» относится к неслучайной реакции связывания между двумя молекулами, такой как реакция между антителом и антигеном, на который оно направлено. Сила или аффинность специфического связывающего взаимодействия может выражаться константой равновесной диссоциации (K_D) взаимодействия. В настоящем изобретении термин «K_D» относится к константе равновесной диссоциации специфического взаимодействия антитело-антиген, которая используется для описания аффинности связывания между антителом и антигеном. Чем ниже константа равновесной диссоциации, тем прочнее связывание антитело-антиген и тем выше аффинность между антителом и антигеном. Параметры специфического связывания между двумя молекулами можно измерить с использованием методов, известных в данной области, например, с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR) на приборе BIACORE.

В данном контексте выражение «связывание при нейтральном значении pH с аффинностью выше, чем при кислом значении pH» или эквивалентное выражение «pH-зависимое связывание» относится к тому, что антитело по настоящему изобретению имеет значение K_D или значение EC₅₀ для связывания HBsAg при кислом значении pH, которое выше значения K_D или значения EC₅₀ для связывания HBsAg при нейтральном значении pH. K_D можно измерить с помощью метода, известного в данной области техники, например, с помощью метода SPR (например, Biacore). В настоящем изобретении термин «ЕС₅₀» относится к концентрации, обеспечивающей половинный максимальный эффект антитела-антигена, т. е. концентрации антитела, необходимой для достижения 50% максимального эффекта связывания между конкретным антителом и антигеном, и он используется для описания способности связывания между антителом и антигеном. Чем ниже значение ЕС₅₀, тем выше связывающая способность между антителом и антигеном. Концентрацию, обеспечивающую половинный максимальный эффект связывания антитела и антигена (ЕС₅₀) можно определить с использованием методов, известных в данной области, например, с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), в котором антиген связывается с твердофазным носителем, и антитело специфически связывается с антигеном.

В рамках настоящего изобретения, термин «нейтрализующее антитело» относится к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые могут существенно снизить или полностью ингибировать вирулентность (например, способность инфицировать клетки) вируса-мишени. В сущности, нейтрализующие антитела могут распознавать и связываться с вирусом-мишенью и предотвращать проникновение вируса-мишени/инфицирование вирусом-мишенью клеток субъекта. Антитело по настоящему изобретению представляет собой нейтрализующее антитело.

Однако следует понимать, что в рамках настоящей заявки способность антитела нейтрализовать вирус не эквивалентна способности антитела к клиренсу вируса. В рамках настоящего изобретения, термин «нейтрализация вируса» означает, что вирулентность вируса-мишени нейтрализуется (т.е. вирулентность вируса-мишени значительно снижается или полностью ингибируется) посредством ингибирования проникновения вируса-мишени/инфицирования вирусом-мишенью клетки субъекта. В рамках настоящего изобретения, термин «клиренс вируса» означает, что вирус-мишень (независимо от того, инфицирует он клетку или нет) элиминируется из организма, и, следовательно, организм переходит в состояние до инфицирования вирусом (например, результат серологического теста вируса становится отрицательным). Следовательно, как правило, нейтрализующие антитела не обязательно обладают способностью «очищать» от вируса. Однако в рамках настоящей заявки авторы изобретения неожиданно обнаружили, что антитела по изобретению могут не только нейтрализовать HBV, но также и элиминировать вирус (т.е. могут «очистить» от HBV ДНК и/или HBsAg in vivo, «очистить» от HBV и HBV-инфицированных клеток in vivo), и, следовательно, имеют важное клиническое значение.

В рамках настоящего изобретения, термин «выделенный» относится к состоянию, полученному из естественного состояния с использованием искусственных средств. Если в природе присутствует определенное «выделенное» вещество или компонент, то это возможно, потому что его естественная среда изменяется, или вещество выделяется из естественной среды, или и то, и другое. Например, определенный невыделенный полинуклеотид или полипептид находится в природе в организме определенного живого животного, и такой же полинуклеотид или полипептид с высокой чистотой, выделенный из такого естественного состояния, называется выделенным полинуклеотидом или полипептидом. Термин «выделенное» не исключает ни смешанное искусственное или синтезированное вещество, ни другие нечистые вещества, которые не оказывают влияния на активность выделенного вещества.

В рамках настоящего изобретения, термин «вектор» относится к носителю нуклеиновой кислоты, в который может быть вставлен полинуклеотид. Когда вектор обеспечивает экспрессию белка, кодированного вставленным полинуклеотидом, то этот вектор называется экспрессионным вектором. Вектор можно ввести в клетку-хозяин трансформацией, трансдукцией или трансфекцией, так что в результате элементы генетического материала, переносимые вектором, могут экспрессироваться в клетке-хозяине. Векторы хорошо известны специалистам в данной области и включают, не ограничиваясь этим: плазмиды; фагемиды; космиды; искусственные хромосомы, такие как искусственные хромосомы дрожжей (YAC), бактериальные искусственные хромосомы (BAC) или искусственные хромосомы на основе ДНК фага P1 (PAC); бактериофаги, такие как фаг λ или фаг M13, и вирусы животных. Вирусы животных, которые могут использоваться в качестве векторов, включают, не ограничиваясь этим, ретровирусы (включая лентивирусы), аденовирусы, аденоассоциированные вирусы, вирусы герпеса (например, вирус простого герпеса), поксвирусы, бакуловирусы, вирусы папилломы, паповавирусы (например, SV40). Вектор может содержать различные элементы, которые контролируют экспрессию, включая, помимо прочего, последовательность промотора, последовательность инициации транскрипции, последовательность энхансера, элемент селекции и репортерный ген. Кроме того, вектор может содержать сайт инициации репликации.

В рамках настоящего изобретения, термин «клетка-хозяин» относится к клетке, в которую может быть введен вектор, которая включает, не ограничиваясь этим, прокариотическую клетку, такую как Escherichia coli или Bacillus subtilis, грибковую клетку, такую как дрожжевая клетка или Aspergillus, клетку насекомого, такую как клетка S2 Drosophila или Sf9, или клетку животного, такую как фибробласт, клетка CHO, клетка COS, клетка NSO, клетка HeLa, клетка BHK, клетка HEK 293 или клетка человека.

В рамках настоящего изобретения, термин «идентичность» относится к степени соответствия между двумя полипептидами или между двумя нуклеиновыми кислотами. Когда две последовательности, подлежащие сравнению, содержат одну и ту же мономерную субъединицу, основание или аминокислоту, в определенном положении (например, каждая из двух молекул ДНК имеет аденин в определенном положении или каждый из двух полипептидов имеет лизин в определенном сайте), то две молекулы идентичны в данном положении. Процент идентичности между двумя последовательностями является функцией числа идентичных положений, общих для двух последовательностей, к общему числу положений, подвергшихся сравнению, умноженному на 100. Например, если совпадают 6 из 10 положений двух последовательностей, эти две последовательности имеют идентичность 60%. Например, последовательности ДНК: CTGACT и CAGGTT идентичны на 50% (совпадают 3 из 6 положений). Обычно сравнение двух последовательностей проводится таким образом, чтобы обеспечить максимальную идентичность. Такое выравнивание можно проводить с использованием компьютерной программы, такой как программа Align (DNAstar, Inc.), которая основана на методе Needleman, et al. (J. Mol. Biol., 48: 443-453, 1970). Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями также можно определить с помощью алгоритма E. Meyers и W.Miller (Comput. Appl. Biosci., 4: 11-17 (1988)), который был включен в программу ALIGN (версия 2.0), с использованием таблицы весовых значений остатков PAM120, штраф за длину гэпа, равный 12, и штраф за гэп, равный 4. Кроме того, процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить с помощью алгоритма Needleman и Wunsch (J. Mol. Biol., 48: 444-453 (1970)), который был включен в программу GAP в пакете программного обеспечения GCG (доступен на http://www.gcg.com), с использованием матрицы Blossum 62 или матрицы PAM250, и вес гэпа равен 16, 14, 12, 10, 8, 6 или 4, и вес длины последовательности равен 1, 2, 3, 4, 5 или 6.

Двадцать обычных аминокислот, участвующих здесь, экспрессируются обычным образом. См., например, монографию Immunology-A Synthesis (2^nd Edition, E. S. Golub и D. R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland, Mass. (1991)), которая включена здесь посредством ссылки. В настоящем описании термины «полипептид» и «белок» имеют одинаковое значение и используются взаимозаменяемо. Также в настоящем описании аминокислоты обычно представлены однобуквенными и трехбуквенными символами, известными в данной области. Например, аланин может быть представлен символами A или Ala. Кроме того, используемые здесь термины «моноклональное антитело» и «McAb» имеют одинаковое значение и могут использоваться взаимозаменяемо; термины «поликлональное антитело» и «PcAb» имеют одинаковое значение и могут использоваться взаимозаменяемо.

В рамках настоящего изобретения, термин «фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент» относится к носителю и/ или эксципиенту, фармакологически и/или физиологически совместимому с субъектом и активным веществом, который хорошо известен в данной области (см., например, монографию Remington's Pharmaceutical Sciences, Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995), и включает, помимо прочего, регулятор pH, поверхностно-активное вещество, адъювант, усилитель ионной силы, разбавитель, агент, регулирующий осмотическое давление, агент, замедляющий всасывание, и консервант. Например, регулятор pH включает, не ограничиваясь этим, фосфатный буфер. Поверхностно-активное вещество включает, не ограничиваясь ими, катионогенное, анионогенное или неионогенное поверхностно-активное вещество, например Твин-80. Усилитель ионной силы включает, не ограничиваясь этим, хлорид натрия. Консервант включает, не ограничиваясь этим, различные антибактериальные агенты и противогрибковые препараты, такие как парабен, хлорбутанол, фенол и сорбиновая кислота. Агент, регулирующий осмотическое давление, включает, без ограничения, сахар, NaCl и их аналоги. Агент, замедляющий всасывание, включает, не ограничиваясь этим, моностеарат и желатин.

В рамках настоящего изобретения, термин «профилактика/ предупреждение» относится к способу, который проводится для подавления или замедления развития заболевания, расстройства или симптома (такого как HBV инфекция или заболевание, ассоциированное с HBV инфекцией) у субъекта. В рамках настоящего изобретения, термин «лечение/проводить лечение» относится к способу, который проводится для получения положительного или желаемого клинического результата. Для целей изобретения положительный или желаемый клинический результат включает, помимо прочего, ослабление симптома, сужение объема распространения заболевания, стабилизацию (т.е. не обострение) тяжести заболевания, отсрочку или замедление прогрессирования заболевания и облегчение симптомов (частично или полностью), независимо от того, поддаются они обнаружению или не обнаруживаются. Кроме того, «лечение» также относится к более пролонгированной выживаемости по сравнению с ожидаемой выживаемости (если лечение не проводится). В настоящей заявке антитело по изобретению обладает способностью нейтрализовать HBV и, следовательно, может использоваться для предупреждения/защиты здорового субъекта или его клеток от инфицирования HBV. Кроме того, антитело по изобретению обладает способностью «очищать» от HBV (т.е. способно «очищать» от HBV ДНК и/или HBsAg in vivo, «очищать» от HBV и клеток, инфицированных HBV in vivo) и, следовательно, может использоваться для лечения HBV инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV инфекцией у инфицированного субъекта.

В рамках настоящего изобретения, термин «субъект» относится к млекопитающему, такому как млекопитающее-примат, например человек.

В рамках настоящего изобретения, термин «эффективное количество» относится к количеству, которое достаточно для достижения или, по меньшей мере, частичного достижения ожидаемого эффекта. Например, количество, эффективное для профилактики заболевания (такого как HBV инфекция или заболевание, ассоциированное с HBV инфекцией), относится к количеству, эффективному для предупреждения, подавления или замедления развития заболевания (такого как HBV инфекция или заболевание, ассоциированное с HBV инфекцией). Эффективное количество для лечения заболевания относится к количеству, эффективному для лечения или, по меньшей мере, частичного блокирования заболевания и его осложнений у пациента, страдающего этим заболеванием. Определение такого эффективного количества находится в компетенции специалиста в данной области. Например, количество, эффективное для терапевтического применения, зависит от тяжести заболевания, которое требуется лечить, общего состояния иммунной системы пациента, общих показателей пациента, таких как возраст, масса тела и пол, способов введения лекарственных средств, дополнительных методов лечения, применяемых одновременно, и тому подобное.

Преимущественные эффекты настоящего изобретения

Антитело по настоящему изобретению не только может специфически распознавать/связывать HBsAg, но может нейтрализовать вирулентность HBV, может снижать сывороточный уровень HBV ДНК и/или HBsAg у субъекта, и может эффективно элиминировать HBV и HBV-инфицированные клетки из организма, но также имеет значительно повышенный эффект выведения антигена и время подавления антигена. Особенно удивительно то, что в данной области известно, что у пациентов с хроническим гепатитом B имеется тенденция к истощению иммунной системы (толерантности) к HBV за счет высоких уровней HBsAg в организме, тем самым пролонгируя течение инфекции, но антитело по настоящему изобретению может обеспечивать активацию у субъекта (например, у пациентов с хронической HBV инфекцией или пациентов с хроническим гепатитом B) с восстановлением гуморального иммунного ответа против HBV, тем самым увеличивая уровень клинического излечения. Следовательно, антитело по настоящему изобретению особенно подходит для профилактики и лечения HBV инфекции и заболеваний, ассоциированных с HBV инфекцией (например, гепатита B). Кроме того, антитело по настоящему изобретению обладает pH-зависимыми антигенсвязывающими свойствами, и одна молекула антитела может связываться с многочисленными молекулами антигенов, и в результате этого она также может снижать частоту и дозировку введения, и имеет большое клиническое значение.

Варианты осуществления настоящего изобретения будут подробно описаны ниже в сочетании с прилагаемыми фигурами и примерами. Однако специалистам в данной области техники должно быть понятно, что следующие фигуры и примеры используются только для иллюстрации настоящего изобретения, а не для ограничения объема настоящего изобретения. Согласно прилагаемым фигурам и последующему подробному описанию предпочтительных вариантов осуществления, различные цели и преимущественные аспекты настоящего изобретения станут очевидными для специалистов в данной области техники.

Краткое описание фигур

На фиг. 1 приведено схематическое представление принципа функционирования антитела с pH-зависимой антигенсвязывающей активностью. Плазма крови человека является нейтральной с pH примерно 7,4, в то время как внутриклеточная среда является кислой с pH примерно 6,0. Антитело с pH-зависимой антигенсвязывающей активностью может связываться с антигеном в плазме, после чего комплекс антиген-антитело интернализуется в клетку. pH-зависимое антитело будет диссоциировать от антигена в кислой среде эндосомы. Антитело, диссоциированное от антигена, будет захватываться FcRn и циркулировать за пределы клетки. Во внеклеточной нейтральной среде FcRn высвобождает антитело, и антитело, вернувшись в плазму, может снова связываться с другим антигеном, тем самым реализуя цикл использования антитела.

На фиг. 2 приведены результаты стыковки кристаллической структуры Fab по данным структурного анализа антитела 162 с коротким пептидом, имитирующим антиген, где синяя структура представляет собой короткий пептид-антиген, и красная структура является частью связывающей области антитела 162.

На фиг. 3 приведено схематическое представление рекомбинантного вектора (pCGMT-scFv), кодирующего scFv-антитело, где scFv-антитело имеет структуру: NH₂-VH-линкер-VL-COOH.

На фиг. 4A-4D приведены результаты ELISA фаговой библиотеки, отображающей pH-зависимое scFv-антитело, полученное из антитела 162, и антиген HBsAg. На фиг. 4A: результаты детектирования связывания с HBsAg при pH 7,4 и pH 6,0 для фаговой библиотеки, полученной из антитела 162 после третьего раунда скрининга, на оси абсцисс представлено число фаговых антител, и на оси ординат представлено значение OD. Результаты показывают, что все эти единичные клоны обладают высокой антигенсвязывающей активностью и имеют достоверное снижение связывающей активности при pH 6,0. На фиг. 4B: результаты детектирования pH-зависимого связывания с HBsAg для 13 отдельных клонов с высоким значением OD_(450/630) при pH 7,4 в третьем раунде и демонстрируют наибольшую разницу между значениями OD_(450/630) при pH 7,4 и pH 6,0, с 8 градиентами и 3-кратным разведением, где на оси абсцисс представлен коэффициент разведения, и на оси ординат представлено значение OD. Результаты показывают, что pH-зависимый эффект связывания антигена лучше проявляется после градиентного разведения, при котором C32, C27, C26 и C19 проявляют более высокую эффективность, и молекула C27 дает наилучший эффект (остальные 9 молекул не показаны). На фиг. 4C: результаты детектирования связывания с HBsAg при pH 7,4 и pH 6,0 для фаговой библиотеки, полученной из антитела 162 после четвертого раунда скрининга, на оси абсцисс представлено число фаговых антител, и на оси ординат представлено значение OD. На фиг. 4D: результаты детектирования pH-зависимого связывания с HBsAg для 8 отдельных клонов с высоким значением OD_(450/630) при pH 7,4 в четвертом раунде и демонстрируют наибольшую разницу между значениями OD_(450/630) при pH 7,4 и pH 6,0, с 8 градиентами и 3-кратным разведением, где на оси абсцисс представлен коэффициент разведения, и на оси ординат представлено значение OD. Результаты показывают, что pH-зависимый антигенсвязывающий эффект лучше проявляется после градиентного разведения, при котором D3, D4 и D5 проявляют более высокую эффективность, и молекула D5 дает наилучший эффект (остальные 5 молекул не показаны).

На фиг. 5 представлено обобщенные данные по сайтам мутации C26, C27, C32, D3, D4 и D5.

На фиг. 6A приведены результаты детектирования связывания с HBsAg при pH 7,4 и pH 6,0 для количественно определенного клеточного супернатанта, полученного в результате мелкомасштабной эукариотической трансфекции C32, C27 и C26, описанной в примере 3. На фиг. 6B приведены результаты детектирования связывания с HBsAg при pH 7,4 и pH 6,0 для количественно определенного клеточного супернатанта, полученного в результате мелкомасштабной эукариотической трансфекции D3, D4 и D5, описанной в примере 3. На оси абсцисс представлена концентрация антител (Log₁₀ нг/мл) и на оси ординат представлено значение OD. Результаты показывают, что все C32, C27, C26, D3, D4 и D5 могут сохранять антигенсвязывающую активность, эквивалентную активности родительского антитела 162 при нейтральном значении pH, и все они имеют значительное снижение активности связывания с антигеном при pH 6,0.

На фиг. 7 показан принцип функционирования антитела-«мусорщика». В клетках играет роль pH-зависимая антигенсвязывающая активность. Таким образом, если этот первый ограничивающий фактор вхождения в клетку не нарушается, то pH-зависимые антигенсвязывающие свойства не будут применяться впоследствии, и польза от модификации будет значительно снижена. Антитело-«мусорщик», полученное посредством дополнительной мутации аминокислот в Fc-области, может усиливать связывание с рецептором hFcRn при нейтральном значении pH или усиливать связывание с рецептором FcγRs. Антитело-«мусорщик» располагается вне клетки и функционирует в качестве «транспортного помощника» соответственно для транспорта антигенов в клетку, следовательно, период полураспада антитела может быть рчень пролонгироваться, и антитело может снова связываться с антигеном, тем самым приводя к повышению эффективности проникновения антигенов в клетку, и значительно улучшая эффективность клиренса.

На фиг. 8A-8B приведены результаты разделения белков в гель-электрофорезе для pH-зависимых антител и антител с модификацией DY. На фиг. 8A: изображение белков в гель-электрофорезе pH-зависимых антител, где антитело 162 является положительным контролем, и результаты показывают, что экспрессированные антитела C26, D3, D4 и D5 являются однокомпонентными. На фиг. 8B: изображение белков в гель-электрофорезе антител с модификацией DY, где антитело 162 является положительным контролем, и результаты показывают, что экспрессированные антитела C26 DY, D3 DY, D4 DY и D5 DY являются однокомпонентными.

На фиг. 9A-9D приведены результаты детектирования связывания pH-зависимых антител и антител с модификацией DY с HBsAg при pH 7,4 и pH 6,0 в примере 4, где на абсциссе представлена концентрация антитела (Log₁₀ нг/мл), и на ординате представлено значение OD. Результаты показывают, что D26, D3, D4 и D5 сохраняют антигенсвязывающую активность, эквивалентную активности родительского антитела (162) при нейтральном pH, и имеют достоверное снижение антигенсвязывающей активности в условиях pH 6,0, и соответствующие антитела с модификацией DY также сохраняют антигенсвязывающую активность при нейтральном pH и pH-зависимую антигенсвязывающую активность, сравнимую с таковой у родительского антитела.

На фиг. 10А приведены результаты эксперимента с иммунофлуоресцентным анализом первичных мышиных макрофагов для pH-зависимых антител и антител с модификацией DY в примере 4, где зеленая флуоресценция представляет hFcRn, синяя флуоресценция представляет ядро, и красная флуоресценция представляет HBsAg. Результаты показывают, что модификация DY усиливает фагоцитарную активность мышиных макрофагов за счет комплексов антиген-антитело. На фиг. 10В приведены результаты эксперимента по оценке фагоцитоза на фагоцитарных человеческих клетках THP-1 для pH-зависимых антител и антител с модификацией DY в примере 4. Результаты показывают, что модификация DY усиливает фагоцитарную активность фагоцитарных человеческих клеток THP-1 за счет комплексов антиген-антитело.

На фиг. 11А-11В показаны терапевтические эффекты антитела-«мусорщика» DY C26 и антитела 162 у трансгенных по HBV мышей после однократной инъекции в хвостовую вену в дозе 5 мг/кг в примере 4. На фиг. 11C показаны терапевтические эффекты D3 DY, D3 DY, D4 DY и D5 DY у трансгенных мышей HBV после однократной инъекции в хвостовую вену в дозе 5 мг/кг в примере 4. На фиг. 11A: на абсциссе представлено количество суток (d) после инъекции антитела, и на ординате представлен уровень HBsAg в сыворотке мыши после клиренса (log₁₀ МЕ/мл). На фиг. 11B показано: изменения концентрации антитела в сыворотке мыши, где на абсциссе представлено количество суток (d) после инъекции антитела, и на ординате представлена концентрация антитела (нг/мл). На фиг. 11C: на абсциссе представлено количество суток (d) после инъекции антитела, и на ординате представлен уровень HBsAg в сыворотке мыши после клиренса (log₁₀ МЕ/мл). Результаты показывают, что антитела-«мусорщики» с модификацией DY C26 DY, D3 DY, D4 DY и D5 DY обладают более высокой способностью к клиренсу антигена более чем на один порядок величины, чем у антитела 162. Это указывает на то, что антитела-«мусорщики» с модификацией DY C26 DY, D3 DY, D4 DY и D5 DY могут выполнять функцию циклического связывания антигенов и усиливать эффект клиренса антигена при инъекционном введении в низкой дозе 5 мг/кг.

Информация о последовательностях

Информация о частичных последовательностях, включенных в настоящее изобретение, представлена в таблице 1 ниже.

Таблица 1
Описание последовательностей SEQ ID NO Описание Информация о последовательности 1 162 VH EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSITYGYHWNWIRQFPGNKLEWIGYISYDGSVLYNPSLENRVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCASGFDHWGQGTTLTVSS 2 C27 VK DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYCSQNTHVPYTFGGGTKLEIK 3 C26 D4 D5 VH EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSITHGYHWNWIRQFPGNKLEWIGYIHYDGSVLYNPSLENRVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCASGFDHWGQGTTLTVSS 4 C26 VK DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYCSQNTHHPYTFGGGTKLEIK 5 C27 VH EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSITHGYHWNWIRQFPGNKLEWIGYINHDGSVLYNPSLENRVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCASGFDHWGQGTTLTVSS 6 C32 VH EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSITYRYHWNWIRQFPGNKLEWIGYINYDGSVHYNPSLENRVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCASGFDHWGQGTTLTVSS 7 C32 VK DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYCSQNTHLPYTFGGGTKLEIK 8 D3 VH EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSITHGYHYNWIRQFPGNKLEWIGYIHYDGSVLYNPSLENRVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCASGFDHWGQGTTLTVSS 9 D3 D5 VK DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDNYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYCSQNTHVPYTFGGGTKLEIK 10 D4 VK DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDNYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYCSQNTHLPYTFGGGTKLEIK 11 162
HCDR1 YGYHWN 12 162 D3 D4 D5
HCDR2 YISYDGSVLYNPSLEN 13 162 C26 C27 C32 D3 D4 D5
HCDR3 GFDH 14 162 C26 C27 C32
LCDR1 RSSQSLVHSYGDTYLH 15 162 C26 C27 C32 D3 D4 D5
LCDR2 KVSNRFS 16 162 C27 D3 D5
LCDR3 SQNTHVPYT 17 C26 C27 D4 D5
HCDR1 HGYHWN 18 C26
HCDR2 YIHYDGSVLYNPSLEN 19 C26
LCDR3 SQNTHHPYT 20 C27
HCDR2 YINHDGSVQYNPSLEN 21 C32
HCDR1 YRYHWN 22 C32
HCDR2 YINYDGSVHYNPSLEN 23 C32 D4
LCDR3 SQNTHLPYT 24 D3
HCDR1 HGYHYN 25 D3 D4 D5
LCDR1 RSSQSLVHSYGDNYLH 26 Общая формула HCDR1 X₁X₂YHX₃N 27 Общая формула HCDR2 YIX₄X₅DGSVX₆YNPSLEN 28 Общая формула LCDR1 RSSQSLVHSYGDX₇YLH 29 Общая формула LCDR3 SQNTHX₈PYT 30 C26 C27 C32 D3 D4 D5
HFR1 EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSIT 31 C26 C27 C32 D3 D4 D5
HFR2 WIRQFPGNKLEWIG 32 C26 C27 C32 D3 D4 D5
HFR3 RVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCAS 33 C26 C27 C32 D3 D4 D5
HFR4 WGQGTTLTVSS 34 C26 C27 C32 D3 D4 D5
LFR1 DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISC 35 C26 C27 C32 D3 D4 D5
LFR2 WYLQKPGQSPKLLIY 36 C26 C27 C32 D3 D4 D5
LFR3 GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYC 37 C26 C27 C32 D3 D4 D5
LFR4 FGGGTKLEIK 38 4-28-02 QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGYSISSSNWWGWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSIYYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKLSSVTAVDTAVYYCAR 39 2D-28-01 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC 40 Константная область тяжелой цепи IgG1 человека ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 41 Константная область легкой цепи κ человека RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDSALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 42 Константная область тяжелой цепи IgG1 человека с мутацией V4 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLYISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHEAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK 43 Константная область тяжелой цепи IgG1 человека с мутацией DY ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNDAYPAPIEKTI
SKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK 44 Праймер 5'>GTTATTACTCGTGGCCCAGCCGGCCATGGCAGAGGTGCAGCTGCAGGAGTC <3' 45 Праймер 5'>CTCCAGCTTGTTCCCTGGGAACTGCCGGATCCAGTTSYRGTGGTRGYSGTRGGTGATGGAGCTACCAGA <3' 46 Праймер 5'>GTTCCCAGGGAACAAGCTGGAGTGGATTGGGYACMWCMRCYACSACGGCAGCSWYCWSYACAATCCATCTCTCG <3' 47 Праймер 5'>GACTGTGAGAGTTGTGCCTTGGCCCCAGTGGTSGWRACCACTCGCACAGTA <3' 48 Праймер 5'>CCAGATCCGCCACCTCCACTCCCGCCTCCACCTGAGGAGACTGTGAGAGTTGTGCCTT <3' 49 Праймер 5'>GTGGAGGTGGCGGATCTGGAGGGGGTGGTAGCGATGTTGTGATGACCCAATC <3' 50 Праймер 5'>CTTTGGAGACTGGCCTGGCTTCTGCAGGTACCAATGSWGGTRGKKGTCTCCATAGYKGTGRWS <3' 51 Праймер 5'>AGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCTCCTGATCTACAAAGTTTCCAACCGATTTTCTG <3' 52 Праймер 5'>TTTCCAGCTTGGTCCCCCCTCCGAAGKKGTRGKGRWSATGGKKGTKSTGAGAGCAGTAATAAAC <3' 53 Праймер 5'>TAGTCGACCAGGCCCCCGAGGCCTTTTATTTCCAGCTTGGTCCCCCCT <3' 54 Сигнальный пептид MGWSCIILFLVATATGVHS 55 Праймер 5’-
AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC 56 Праймер 5’-
GATGGGCCCTTGGTCGACGCTGAAGAGACGGTGACGGTGG 57 Праймер 5’-
AGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCTGACATACAGATGACGCAGTCTC 58 Праймер 5’-
ATGGTGCAGCCACCGTACG TTTGATTTCCACCTTGGTCC

Примеры

Настоящее изобретение теперь будет описано со ссылкой на следующие примеры, которые предназначены для иллюстрации настоящего изобретения, а не для ограничения настоящего изобретения.

Если не указано иное, то экспериментальные методы молекулярной биологии и методы иммуноанализа, использованные в настоящем изобретении, в основном относятся к описанным в монографиях J. Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, и FM Ausubel et al., Compiled Molecular Biology Experiment Guide, 3rd edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995; рестрикционные ферменты использовали в соответствии с условиями, рекомендованными производителем продукта. Специалистам в данной области должно быть понятно, что примеры описывают настоящее изобретение в качестве примера и не предназначены для ограничения объема защиты, которая должна быть защищена настоящим изобретением.

Пример 1: скрининг библиотеки фагового дисплея pH-зависимых анти-HBsAg антител

1.1 Определение сайтов мутации для pH-зависимой модификации антител

Гуманизированное антитело 162 против HBV (подробно описано в заявке на патент Китая 201610879693.5), разработанное в лаборатории, использовали в качестве родительского антитела, и его вариабельную область модифицировали для pH-зависимого связывания антигена. Как показано на фиг. 1, модифицированное антитело 162 сохраняло антигенсвязывающую активность в нейтральных условиях, но его антигенсвязывающая активность в кислых условиях была достоверно снижена. Диссоциированное модифицированное 162 могло связываться с внутриклеточным FcRn и таким образом вернуться в плазму и снова связываться с антигеном, так что одна молекула модифицированного антитела 162 с pH-зависимой способностью связывания антигена могла многократно связываться и нейтрализовать множество молекул антигена. Гистидин протонировался в кислых условиях, и он был ключевой аминокислотой, обеспечивающей pH-зависимые антигенсвязывающие свойства. Fab 162 имеет установленную кристаллическую структуру, установленную кристаллическую структуру стыковали посредством моделирования с коротким пептидом-антигеном, и часть результатов приведена на фиг. 2, где синяя структура представляет собой короткий пептид-антиген, и красная структура представляет часть области связывания антитела 162. Согласно результатам стыковки, в целом было установлено 14 ключевых аминокислот, важных для связывания антигена и антитела. Принимая во внимание, что результаты моделирования стыковки имели более высокое референсное значение, для мутации были выбраны аминокислоты на границе раздела и аминокислоты на обеих сторонах, и было определено 26 сайтов.

1.2 Конструирование фаговой библиотеки pH-зависимых scFv-антител, полученных из антитела 162

Используя вариабельные области легкой и тяжелой цепей антитела 162 в качестве матрицы, установленные сайты в CDR вариабельной области антитела были мутированы для обеспечения pH-зависимой модификации, и целевые фрагменты амплифицировали с использованием праймеров, приведенных в таблице 2, с получением фрагментов гена, кодирующих pH-зависимые scFv-антитела, полученные из антитела 162. Условия ПЦР были следующими: 95°C, 5 мин; 95°C, 30 с; 57°C, 30 с; 72°C, 30 с; 72°C, 10 мин; 25 циклов амплификации; условия реакции SOE-ПЦР: 95°C, 5 мин; 95°C, 30 с; 57°C, 30 с; 72°C, 30 с; 72°C, 10 мин; 5 циклов амплификации. Амплифицированные продукты анализировали электрофорезом в агарозном геле, и продукты амплификации выделяли/очищали с использованием набора для очистки и выделения ДНК (TianGen, DP214-03), с получением тем самым фрагментов гена H-K, кодирующих гуманизированные scFv-антитела, полученные из антитела 162. Структура scFv-антител была следующей: NH₂-VH-линкер-VL-COOH, и линкерная последовательность могла представлять собой (G₄S)₃. Каждый из фрагментов гена H-K подвергали расщеплению с использованием SfiI, и затем лигировали с вектором pCGMT (Исследовательский институт Скриппса, делая химию селектируемой посредством ее связывания с инфекционностью) в молярном соотношении 10:1 (фрагмент гена:вектор). Продукты лигирования трансформировали в компетентные Escherichia coli ER2738 с использованием электропорации (условия электропорации: 25 мкФ, 2,5 кВ, 200 Ом). Трансформированные Escherichia coli выделяли в среде SOC в течение 45 мин, и затем 200 мкл бактериального раствора высевали на чашки LB (содержащие 100 г/л ампициллина+тетрациклина+2 г/мл глюкозы) и инкубировали при 37°C в течение ночи. Все колонии на чашках представляли собой библиотеки, где сайты мутации, определенные в вариабельных областях, были случайным образом мутированы в гистидин, которые использовали для последующего скрининга. Моноклональные колонии отбирали с чашек и секвенировали, чтобы гарантировать правильность последовательностей рекомбинантных векторов, кодирующих scFv-антитела. Схематическое представление рекомбинантного вектора (pCGMT-scFv), кодирующего scFv-антитело, приведено на фиг. 3.

Таблица 2
Праймеры для мутации pH-зависимых scFv-антител, полученных из антитела 162 Название праймера Последовательность праймера VH-F SEQ ID NO: 44 HCDR1-R SEQ ID NO: 45 HCDR2-F SEQ ID NO: 46 HCDR3-R SEQ ID NO: 47 VH-R SEQ ID NO: 48 VK-F SEQ ID NO: 49 KCDR1-R SEQ ID NO: 50 KCDR2-F SEQ ID NO: 51 KCDR3-R SEQ ID NO: 52 VK-R SEQ ID NO: 53

1.3 Детектирование гуманизированных scFv-антител

Библиотеку, полученную на предшествующей стадии, подвергали скринингу в нескольких раундов, и положительные моноклональные колонии, полученные в результате скрининга, культивировали в среде 2×YT, содержащей ампициллин (100 г/л) и глюкозу (2 г/мл), для достижения значения OD, равного 0,6, и затем добавляли фаг-помощник M13KO7 для суперинфицирования. Через 2 ч добавляли 100 г/л канамицина и проводили суперинфицирование при 37°C. Через 2 ч культуру центрифугировали при 4000 об/мин в течение 10 мин, супернатант отбрасывали и собирали клеточный осадок. Клеточный осадок ресуспендировали в среде, содержащей ампициллин и канамицин (100 г/л), и культивировали при встряхивании при 30°C в течение ночи. Затем культуру центрифугировали при 12000 об/мин в течение 10 мин, клетки и супернатант собирали и хранили при 4°C для тестирования.

Использовали планшет для постановки ELISA, покрытый антигеном HBsAg (200 нг/мл), и 100 мкл тестируемого супернатанта добавляли в каждую лунку и инкубировали при 37°C в течение 1 ч (две лунки на каждый супернатант). Затем планшет для постановки ELISA промывали один раз PBST, и затем в две лунки с каждым супернатантом добавляли 120 мкл PBS с pH 7,4 и pH 6,0 соответственно и инкубировали при 37°C в течение 30 мин. После промывания лунок PBST 5 раз с соответствующим pH добавляли 100 мкл анти-M13-HRP, разведенного в соотношении 1:5000, и инкубировали при 37°C в течение 30 мин. Затем планшет для ELISA промывали 5 раз PBST и добавляли раствор субстрата TMB. Через 15 мин развития окраски цветную реакцию останавливали добавлением H₂SO₄, и показание снимали при OD450/630. Результаты детектирования третьего раунда ELISA приведены на фиг. 4А-4D. Результаты показали, что все фаги, отображающие эти scFv-антитела, обладали реактивностью при детектировании ELISA и слабо связывались с антигенами при pH 6,0; первоначально было получено шесть штаммов pH-зависимых фаговых антител с хорошими эффектами, получивших названия C-26, C-27, C-32, D3, D4 и D5 соответственно.

Пример 2: получение pH-зависимых анти-HBsAg антител

2.1 Конструирование рекомбинантного вектора для эукариотической системы экспрессии

В настоящем изобретении необходимо было провести большую рекомбинацию антител, следовательно, было необходимо сконструировать ряд векторов для легкой и тяжелой цепей, которые могут обеспечивать эффективное получение рекомбинантных антител. В настоящем изобретении существующий в лаборатории эукариотический экспрессионный вектор pTT5 был специфически модифицирован для конструирования ряда рекомбинантных векторов для легкой и тяжелой цепей для котрансфекции двойной плазмиды. Последовательность MGWSCIILFLVATATGVHS (SEQ ID NO: 54) использовали в качестве сигнального пептида для легкой и тяжелой цепей. Последовательности, кодирующие константные области легкой и тяжелой цепей человеческого антитела, по отдельности лигировали с сигнальным пептидом даунстрим, чтобы сконструировать ряд эукариотических экспрессионных векторов pTT5-CH, pTT5-Cκ и pTT5-Cλ, которые обеспечивали получение рекомбинантных антител.

Шесть scFv-антител, полученных как описано в разделе 1.3, использовали для амплификации фрагментов вариабельной области легкой и тяжелой цепей с использованием праймеров, приведенных в таблице 3. Конкретные условия реакции амплификации были следующими: 95°C, 5 мин; 95°C, 30 с; 57°C, 30 с; 72°C, 30 с; 72°C, 10 мин; 25 циклов амплификации. И продукты амплификации извлекали из геля.

Приготовленный в лаборатории раствор для реакции сборки Гибсона использовали для лигирования сконструированного эукариотического экспрессионного вектора, описанного выше, с восстановленным продуктом ПЦР гена вариабельной области антитела (праймер, несущий последовательность, гомологичную вектору) с получением рекомбинантных векторов VH+pTT5-CH (содержащий CH, показанный в SEQ ID NO: 40) и VH+pTT5-Cκ (содержащий CL, показанный в SEQ ID NO: 41). Рекомбинантный вектор трансформировали в штамм E. coli DH5α, высевали на чашку LB и культивировали в течение ночи в термостате при 37°C. Моноклональные колонии отбирали на чашке и секвенировали, и результаты секвенирования подвергали сравнению последовательностей с использованием MEGA, чтобы подтвердить правильность его генов и исключить гены с неверной информацией.

Таблица 3
Праймеры для конструирования эуокариотических экспрессионных векторов Название праймера Последовательность праймера VH-F SEQ ID NO: 55 VH-R SEQ ID NO: 56 VK-F SEQ ID NO: 57 VK-R SEQ ID NO: 58

2.2 Мелкомасштабная и крупномасштабная экспрессия генов антител

Сконструированные рекомбинантные векторы VH+pTT5-CH и VH+ pTT5-Cκ котрансфектировали в клетки HEK293, и двойные плазмиды для мелкомасштабной экспрессии котрансфектировали в 24-луночный планшет из расчета 500 мкл на лунку; если клеточный супернатант в мелкомасштабной экспрессии обладал антигенной активностью, то объем системы трансфекции увеличивали до 100 мл (определяется количеством использованного антитела) суспензионных клеток FreeStyle^TM 293F (плотность клеток составляла примерно 2×10⁶ клеток/мл). Трансфектированные клетки культивировали во встряхиваемой колбе в инкубаторе при температуре 32°C, 5% CO₂, и супернатант собирали после 7 суток экспрессии.

2.3 Очистка антител

Супернатант экспрессирующих клеток собирали и очищали на колонке с протеином А в соответствии с инструкциями производителя. Конкретные стадии были следующими: собранный супернатант клеточной культуры центрифугировали при 8000 об/мин в течение 10 мин, супернатант сохраняли, значение pH доводили до 8,4 с помощью сухого порошка Na₂HPO₄, и затем фильтровали через фильтрующую мембрану с диаметром пор 0,22 мкм. 10 мл сефарозы 4B, связанной с протеином A, загружали в колонку, которую подключали к системе AKTA Explorer100, насос A был подключен к 0,2 M раствору гидрофосфата натрия, и насос B был подключен к 0,2 M раствору лимонной кислоты. Длина волны детектирования составляла УФ 280 нм, скорость потока составляла 5 мл/мин, и соотношение инжектирования образцов из насосов A/B регулировали. Колонку сначала промывали 100% B (pH 2,3) для удаления белковых примесей, pH уравновешивали 10% B (pH 8,0), сигнал на длине волны детектирования возвращался к нулю после того, как он стабилизировался, затем загружали образец. После прохождения пика потока 10% B использовали для уравновешивания до тех пор, пока сигнал на длине волны детектирования не снижался до нуля и не стабилизировался, элюирование выполняли с использованием 70% B (pH 4,0), и пик элюирования собирали. Образец пика элюции подвергали диализу против буфера PBS и подвергали анализу концентрации и анализу SDS-PAGE и ВЭЖХ для определения чистоты IgG антитела.

Пример 3: анализ свойств и функциональная оценка pH-зависимых анти-HBsAg антител

С использованием метода, описанного в примере 1, шесть штаммов pH-зависимых фаговых антител, которые связывались с HBsAg, были получены предварительным скринингом, и получили названия C26, C27, C32, D3, D4 и D5 соответственно. Кроме того, мелкомасштабную эукариотическую экспрессию и очистку 6 штаммов фаговых антител проводили методом, описанным в примере 2. Аминокислотные последовательности VH и VL 6 антител приведены в таблице 4 ниже. Кроме того, определяли последовательности CDR 6 антител, и аминокислотные последовательности CDR вариабельных областей тяжелой цепи и вариабельных областей легкой цепи приведены в таблице 5. Сайты мутации, которые придают антителам C26, C27, C32, D3, D4 и D5 pH-зависимые свойства связывания с антигеном с HBsAg, приведены на фиг. 5.

Таблица 4
Аминокислотные последовательности вариабельных областей легкой и тяжелой цепи C26/C27/C32/D3/D4/D5 Название последовательности SEQ ID NO Аминокислотная последовательность C26 VH 3 EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSITHGYHWNWIRQFPGNKLEWIGYIHYDGSVLYNPSLENRVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCASGFDHWGQGTTLTVSS C26 VK 4 DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYCSQNTHHPYTFGGGTKLEIK C27 VH 5 EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSITHGYHWNWIRQFPGNKLEWIGYINHDGSVLYNPSLENRVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCASGFDHWGQGTTLTVSS C27 VK 2 DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYCSQNTHVPYTFGGGTKLEIK C32 VH 6 EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSITYRYHWNWIRQFPGNKLEWIGYINYDGSVHYNPSLENRVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCASGFDHWGQGTTLTVSS C32 VK 7 DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYCSQNTHLPYTFGGGTKLEIK D3 VH 8 EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSITHGYHYNWIRQFPGNKLEWIGYIHYDGSVLYNPSLENRVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCASGFDHWGQGTTLTVSS D3 VK 9 DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDNYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYCSQNTHVPYTFGGGTKLEIK D4 VH 3 EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSITHGYHWNWIRQFPGNKLEWIGYIHYDGSVLYNPSLENRVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCASGFDHWGQGTTLTVSS D4 VK 10 DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDNYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYCSQNTHLPYTFGGGTKLEIK D5 VH 3 EVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCAVSGSSITHGYHWNWIRQFPGNKLEWIGYIHYDGSVLYNPSLENRVTITRDTSKNQFFLKLSSVTAEDTAKYYCASGFDHWGQGTTLTVSS D5 VK 9 DVVMTQSPLSLPVTLGEPASISCRSSQSLVHSYGDNYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVETEDLGVYYCSQNTHVPYTFGGGTKLEIK

Таблица 5
Последовательности CDR легкой и тяжелой цепей C26/C27/C32/D3/D4/D5 C26 VH CDR1 HGYHWN SEQ ID NO: 17 VH CDR2 YIHYDGSVLYNPSLEN SEQ ID NO: 18 VH CDR3 GFDH SEQ ID NO: 13 VL CDR1 RSSQSLVHSYGDTYLH SEQ ID NO: 14 VL CDR2 KVSNRFS SEQ ID NO: 15 VL CDR3 SQNTHHPYT SEQ ID NO: 19 C27 VH CDR1 HGYHWN SEQ ID NO: 17 VH CDR2 YINHDGSVQYNPSLEN SEQ ID NO: 20 VH CDR3 GFDH SEQ ID NO: 13 VL CDR1 RSSQSLVHSYGDTYLH SEQ ID NO: 14 VL CDR2 KVSNRFS SEQ ID NO: 15 VL CDR3 SQNTHVPYT SEQ ID NO: 16 C32 VH CDR1 YRYHWN SEQ ID NO: 21 VH CDR2 YINYDGSVHYNPSLEN SEQ ID NO: 22 VH CDR3 GFDH SEQ ID NO: 13 VL CDR1 RSSQSLVHSYGDTYLH SEQ ID NO: 14 VL CDR2 KVSNRFS SEQ ID NO: 15 VL CDR3 SQNTHLPYT SEQ ID NO: 23 D3 VH CDR1 HGYHYN SEQ ID NO:24 VH CDR2 YISYDGSVLYNPSLEN SEQ ID NO:12 VH CDR3 GFDH SEQ ID NO:13 VL CDR1 RSSQSLVHSYGDNYLH SEQ ID NO:25 VL CDR2 KVSNRFS SEQ ID NO: 15 VL CDR3 SQNTHVPYT SEQ ID NO:16 D4 VH CDR1 HGYHWN SEQ ID NO:17 VH CDR2 YISYDGSVLYNPSLEN SEQ ID NO:12 VH CDR3 GFDH SEQ ID NO:13 VL CDR1 RSSQSLVHSYGDNYLH SEQ ID NO:25 VL CDR2 KVSNRFS SEQ ID NO: 15 VL CDR3 SQNTHLPYT SEQ ID NO:23 D5 VH CDR1 HGYHWN SEQ ID NO:17 VH CDR2 YISYDGSVLYNPSLEN SEQ ID NO:12 VH CDR3 GFDH SEQ ID NO:13 VL CDR1 RSSQSLVHSYGDNYLH SEQ ID NO:25 VL CDR2 KVSNRFS SEQ ID NO:15 VL CDR3 SQNTHVPYT SEQ ID NO:16

Авторы изобретения сначала проводили мелкомасштабную трансфекцию для шести моноклональных антител; после количественного определения супернатанта, полученного после трансфекции, определяли pH-зависимую антигенсвязывающую способность с HBsAg методом ELISA, и концентрацию антитела равномерно разводили до 1111,11 нг/мл. Затем использовали 20% NBS для проведения разведения антитела в 3-кратном градиенте концентрации, всего 8 градиентов концентрации. Затем разведенное антитело вносили в коммерческий планшет с HBsAg (приобретенный в компании Beijing Wantai) и инкубировали при 37°C в течение 1 ч (две лунки на каждый супернатант). Затем планшет для ELISA один раз промывали PBST и сушили в центробежной сушилке. Затем в две лунки с каждым супернатантом добавляли 120 мкл PBS с pH 7,4 и pH 6,0 соответственно и инкубировали при 37°C в течение 30 мин. Затем лунки с соответствующим pH промывали 5 раз PBST и сушили в центробежной сушилке. Затем добавляли GAH-HRP-меченное вторичное антитело, инкубировали в течение 30 мин, планшет промывали 5 раз PBST и сушили в центробежной сушилке. Добавляли раствор субстрата TMB. После 15 мин развития окрашивания цветную реакцию останавливали добавлением H₂SO₄, и показания снимали при OD450/630.

Результаты приведены на фиг. 6А-6В. Из полученных данных следует, что все молекулы-кандидаты сохраняли антигенсвязывающую активность, сравнимую с таковой родительского антитела 162 при нейтральном pH, и антигенсвязывающая активность достоверно снижалась при pH 6,0. Результаты определения EC₅₀ представлены в таблице 6.

Таблица 6
Значения EC₅₀ для детектирования pH-зависимой активности для C26, C27, C32, D3, D4 и D5 Антитело EC₅₀ при pH 6,0
(нг/мл) EC₅₀ при pH 7,4
(нг/мл) EC₅₀(pH 6,0)/EC₅₀(pH 7,4) C26 331,30 37,20 8,90 C27 949,60 491,30 1,93 C32 2255,00 1333 1,69 D3 473,10 35,43 13,35 D4 188,10 37,16 5,06 D5 60,04 21,04 2,85

Пример 4: конструирование и функциональная оценка антитела-«мусорщика»

pH-зависимому антителу требуется проникнуть в клетку для проявления своей pH-зависимой антигенсвязывающей активности. Следовательно, если первый ограничивающий фактор вхождения в клетку не нарушается, то последующие pH-зависимые антигенсвязывающие свойства не будут иметь никакого шанса «играть». Следовательно, в данном примере антитело-«мусорщик» было получено посредством дополнительной мутации аминокислот в Fc-области, которая может усилить связывание с рецептором hFcRn при нейтральном pH или усилить связывание с рецептором FcγRs. Как показано на фиг. 7, антитело-«мусорщик» располагается за пределами клетки и играет роль «транспортного помощника», который соответственно транспортирует антигены в клетку, тем самым значительно увеличивая период полураспада антитела, и оно может снова связываться с антигеном, тем самым повышая эффективность проникновение антигена в клетки и достоверно повышая эффективность клиренса.

C26, D3, D4 и D5 были выбраны в качестве антител для последующей оценки и подвергнуты мутациям Fc DY (K326D, L328Y) для повышения аффинности связывания с mFcγRII в нейтральных условиях (модификацию C26 Fc проводили в компании General Biologicals, номер заказа G122413) с получением антител-«мусорщиков» C26 DY, D3 DY, D4 DY и D5 DY, которые связывались с mFcγRII. Вышеуказанные антитела подвергали крупномасштабной эукариотической экспрессии и очистке, и конкретные стадии были такими же, как описано в примерах 1.2 и 1.3.

На фиг. 8A-8B приведены результаты разделения белков в гель-электрофорезе исходного антитела и модифицированных антител. На фиг. 8A: изображение белков в гель-электрофорезе исходного антитела, где антитело 162 было положительным контролем. Результаты показали, что экспрессированное исходное антитело является однокомпонентным. На фиг. 8B: изображение белков в гель-электрофорезе антител с модификацией DY, где антитело 162 было положительным контролем. Результаты показали, что экспрессированные антитела с модификацией DY являются однокомпонентными.

4.1 Оценка pH-зависимой антигенсвязывающей активности антител-«мусорщиков», связывающихся с mFcγRII

Для исходного антитела и антител с модификацией DY после экспрессии и очистки авторы изобретения использовали метод ELISA для определения их pH-зависимой антигенсвязывающей способности с HBsAg. Сначала использовали набор для количественного определения белка BCA для определения концентраций очищенных антител, и антитела равномерно разбавляли до концентрации 1111,11 нг/мл. Затем, 20% NBS использовали для проведения разведения в 3-кратном градиенте концентрации, всего для 8 градиентов концентрации. Затем разведенное антитело вносили в коммерческий планшет HBsAg (приобретенный в компании Beijing Wantai) и инкубировали при 37°C в течение 1 ч (две лунки на каждый супернатант). Затем планшет для ELISA один раз промывали PBST и сушили в центробежной сушилке. Затем в две лунки с каждым супернатантом добавляли 120 мкл PBS с pH 7,4 и PBS с pH 6,0, соответственно, инкубировали при 37°C в течение 30 мин, лунки с соответствующим pH промывали 5 раз PBST и сушили в центробежной сушилке. Затем добавляли GAH-HRP-меченное вторичное антитело, и инкубировали в течение 30 мин, планшет промывали 5 раз PBST и сушили в центробежной сушилке. И добавляли раствор субстрата TMB. После 15 мин развития окрашивания цветную реакцию останавливали добавлением H₂SO₄, и показание измеряли при OD450/630.

Результаты приведены на фиг. 9A-9D, где все C26, D3, D4, D5 и их DY модифицированные антитела обладают антигенсвязывающей активностью, эквивалентной таковой у антитела 162, но демонстрируют слабое связывание с антигеном при pH 6,0, тем самым демонстрируя хорошую pH-зависимую антигенсвязывающую активность.

4.2 Тестирование функции на клеточном уровне антител-«мусорщиков», связывающихся с mFcγRII

4.2.1 Мечение HBsAg флуоресцентной меткой 488

В качестве примера приводится мечение 1 мг HBsAg, весь процесс проводили в защищенном от света месте.

(1) 1 мл 1 мг/мл HBsAg диализовали против боратного буфера (pH 8,5, 500 мл), 4°C, 4 ч;

(2) молярное отношение HBsAg к метке 488 составляло 1:5, и после расчета требовалось 0,1988 мг флуоресцентной метки 488;

(3) готовили раствора флуоресцентной метки 488 с концентрацией 10 мг/мл в ДМФА и хорошо перемешивали;

(4) 19,88 мкл флуоресцентной метки 488 добавляли к 1 мл диализованного HBsAg, хорошо перемешивали и инкубировали при комнатной температуре в течение 1 ч;

(5) инкубационную смесь диализовали против PBS при 4°C в течение ночи.

4.2.2 Эксперимент с иммунофлуоресцентным анализом на первичных мышиных макрофагах

(1) за 4 суток до постановки эксперимента 1,5 мл 3% раствора тиогликолята натрия вводили в брюшную полость каждой мыши без попадания в кишечник;

(2) двух мышей подвергали эвтаназии и тушку замачивали в 75% спирте в течение 3 мин;

(3) мышь горизонтально фиксировали на пенопластовой дощечке для вскрытия брюшной полости; кожу брюшной полости разрезали ножницами для мягких тканей, брюшину дезинфицировали и рассекали, чтобы обнажить брюшную полость, кожу разреза брюшной полости растягивали хирургическими двузубчатыми зажимами, удерживаемыми в левой руке, и фиксировали, культуральную среду 1640 вносили пастеровской пипеткой, удерживаемой правой рукой для перитонеального лаважа из расчета 4 мл/раз, всего два раза. Пипетку использовали для осторожного и полного перемешивания с содержимым брюшной полости, чтобы сделать лаваж более полным и тщательным. После полного перемешивания в течение примерно 2 мин и выдерживания в течение примерно 5 мин для полного выделения макрофагов, раствор для лаважа пипетировали и переносили в центрифужную пробирку;

(4) 4°C, 1100 g, 5 мин;

(5) супернатант осторожно отбрасывали, клетки дважды промывали средой 1640, 4°C, 1100 g, 5 мин, супернатант отбрасывали и клетки ресуспендировали в среде RPM1640;

(6) после подсчета клеток плотность клеток доводили до 10⁶ клеток/мл, клетки культивировали в 24-луночном планшете со стеклянным дном для визуализации клеток, 250 мкл/лунку, среду заменяли через 2 ч и промывание проводили один раз с использованием RPM1640, после того, как неприлипшие клетки удаляли, клетки инкубировали в течение ночи в CO₂-инкубаторе при 37°C;

(7) антитело и антиген, меченные соответствующей флуоресцентной меткой, разбавляли бессывороточной средой до: 800 нг/мл для антигена и 20 мкг/мл для антитела;

(8) 125 мкл антигена и 125 мкл антитела равномерно смешивали, и затем оставляли на 1 ч в CO₂-инкубаторе при 37°C;

(9) клеточный супернатант в культуральном планшете для визуализации клеток удаляли, добавляли комплекс антиген-антитело, равномерно встряхивали и оставляли на 2 ч в термостате с CO₂ при 37°C;

(10) супернатант удаляли, и 1 мл стерильного PBS, заранее инкубированного при 37°C, использовали для «промывания» клеточной поверхности 3-5 раз, и затем полностью удаляли пипеткой;

(11) Dio, разбавленный 1:2000, добавляли в количестве, позволяющем погрузить клетки, и выдерживали при комнатной температуре в течение 20 мин;

(12) супернатант удаляли, и 1 мл стерильного PBS, заранее инкубированного при 37°C, использовали для «промывания» клеточной поверхности 3-5 раз, и затем полностью удаляли пипеткой;

(13) добавляли ядерный краситель живых клеток (2 капли добавляли к 1 мл объема), выдерживали при комнатной температуре в течение 20 мин и помещали в визуализатор с высоким разрешением для визуализации.

Результаты эксперимента приведены на фиг. 10А. Из полученных данных следует, что модификация DY усиливает фагоцитарную активность мышиных макрофагов за счет комплексов антиген-антитело, что приводит к большей деградации антигена.

4.2.3 Подтверждение хемилюминесцентным методом на основе фагоцитарных человеческих клеток THP-1

(1) Прилипающими клетками THP-1 покрывали планшет из расчета 2×10⁵ клеток/лунку, добавляли среду 1640, содержащую 10% сыворотки, помещали в CO₂-инкубатор и культивировали при 37°C в течение 24 ч;

(2) HBsAg разводили бессывороточной средой 1640 до концентрации 800 нг/ мл, и тестируемое антитело с концентрацией 20 мкг/мл в качестве начальной концентрации подвергали 2-кратному градиентному разведению, всего 11 градиентов. 300 мкл разведенного HBsAg и 300 мкл тестируемого антитела смешивали в соотношении 1:1 и оставляли на 1 ч при 37°C;

(3) супернатант клеток THP-1 удаляли, 250 мкл смеси HBsAg-антитело добавляли к клеткам THP-1, помещали в CO₂-инкубатор и культивировали при 37°C в течение 1 ч;

(4) супернатант клеток THP-1 удаляли и промывали 3 раза стерильным PBS;

(5) 120 мкл раствора для лизиса клеток DDM добавляли в каждую лунку с клетками THP-1, выдерживали и подвергали взаимодействию при 4°C в течение 1 ч;

(6) в супернатанте лизата определяли концентрацию HBsAg с использованием набора для количественного определения поверхностного антигена вируса гепатита B (Beijing Wantai).

Результаты эксперимента приведены на фиг. 10B. Из полученных данных следует, что модификация DY усиливает фагоцитарную активность человеческих фагоцитарных клеток THP-1 за счет комплексов антиген-антитело.

4.3 Определение терапевтического эффекта антител-«мусорщиков», связывающихся с mFcγRII, на животных моделях

Трансгенные по HBV мыши были выбраны в качестве животных моделей. Антитела-«мусорщики» C26 DY, D3 DY, D4 DY и D5 DY и антитело 162 вводили однократно в дозе 5 мг/кг в хвостовую вену (по 4 мыши в каждой группе) трансгенным по HBV мышам в возрасте 6-8 недель. Посредством определения концентраций HBsAg, антител и HBV ДНК в сыворотке анализировали скорости клиренса антигена и время полураспада антител-«мусорщиков» in vivo.

Количественное определение HBsAg

(1) Подготовка реакционного планшета: мышиное моноклональное антитело HBs-45E9 разбавляли 20 мМ PB-буфером (буфер Na₂HPO₄/ NaH₂PO₄, pH 7,4) до 2 мкг/мл, и в каждую лунку планшета для хемилюминесцентного анализа добавляли 100 мкл раствора для покрытия и нанесение покрытия проводили при 2-8°C в течение 16-24 ч, затем еще 2 ч при 37°C, планшет один раз промывали раствором PBST для промывания и сушили в центробежной сушилке. После промывания в каждую лунку добавляли 200 мкл блокирующего раствора, и блокирование проводили при 37°C в течение 2 ч. Затем блокирующий раствор удаляли, планшет помещали в сушильную камеру для сушки и хранили при 2-8°C для дальнейшего использования.

(2) Разведение образца: собранную сыворотку мышей разводили раствором PBS, содержащим 20% NBS (фетальная бычья сыворотка) в двух градиентах 1:30 и 1:150 для последующего количественного определения.

(3) Денатурация образца: 15 мкл образца сыворотки, разведенного как описано выше, тщательно перемешивали с 7,5 мкл буфера для денатурации (15% SDS, растворенный в 20 мМ PB7.4) и подвергали взаимодействию при 37°C в течение 1 ч. Затем добавляли 90 мкл стоп-буфера (4% CHAPS, растворенного в 20 мМ PB7.4) и хорошо перемешивали.

(4) Реакция образца: 100 мкл вышеуказанного образца денатурированной сыворотки добавляли в реакционный планшет и проводили реакцию при 37°C в течение 1 ч. Затем реакционный планшет промывали 5 раз PBST и сушили в центробежной сушилке.

(5) Реакция ферментативной метки: реакционный раствор HBs-A6A7-HRP добавляли из расчета 100 мкл/лунку в планшет для хемилюминесцентного анализа и проводили реакцию при 37°C в течение 1 ч. Затем планшет 5 раз промывали PBST и сушили в центробежной сушилке.

(6) Реакция люминесценции и измерение: раствор для люминесценции (100 мкл/лунку) добавляли в планшет для хемилюминесцентного анализа и проводили измерение интенсивности света.

(7) Расчет концентрации HBsAg в образце сыворотки мышей: проводили параллельные эксперименты с использованием стандартов, и строили стандартную кривую на основе результатов измерения стандартов. Затем значение интенсивности света для образца мышиной сыворотки подставляли в стандартную кривую и рассчитали концентрацию HBsAg в образце тестируемой сыворотки.

Результаты детектирования HBsAg в сыворотке приведены на фиг. 11A и фиг. 11C. Из данных фиг. 11A следует, что антитело-«мусорщик» C26 DY с модификацией DY обладало способностью к клиренсу более чем на один порядок величины, чем у антитела 162, что согласуется с результатами определения периода полураспада антитела в сыворотке (фиг. 11B). При сравнении концентраций антител в сыворотке время полураспада C26 DY было больше, чем у антитела 162, почти на 12 суток, что указывает на то, что антитело-«мусорщик» C26 DY выполняет функцию циркулярного и аналогичного связывания антигена, тем самым увеличивая продолжительность клиренса антигена. Результаты экспериментов, приведенные на фиг. 11C, показали, что способность к клиренсу антигена D3 DY, D4 DY и D5 DY была эквивалентна способности C26 DY, и время функционирования было больше, чем у C26 DY, что указывает на то, что при введении в низкой дозе 5 мг/кг антитела-«мусорщики» с модификацией DY D3 DY, D4 DY и D5 DY обладали лучшей функцией циркулярного и аналогичного связывания антигена, тем самым обеспечивая лучший клиренс антигена.

Пример 5: определение аффинности антител 162 и C26

HBsAg растворяли в ацетате натрия (pH 4,5) при концентрации 5 мкг/мл, и программу покрытия чипа запускали на устройстве Biacore 3000 для нанесения покрытия HBsAg на чип CM5. Объем покрытия HBsAg составил 2400RU. Готовили 2-кратные серийные разведения анализируемого вещества, начиная от 100 нМ, с приготовлением образцов с 7 концентрациями. Программу определения аффинности запускали на устройстве Biacore 3000, скорость потока устанавливали на 50 мкл/мин, время связывания было установлено на 90 с, время диссоциации устанавливали на 600 с, температура камеры для образцов была установлена на 10°С, регенерирующий раствор представлял собой 50 мМ NaOH, скорость регенерационного потока была установлена на 50 мкл/мин, и время регенерации было установлено на 60 с. Результаты приведены в таблице 7.

Несмотря на то что были подробно описаны конкретные варианты осуществления настоящего изобретения, специалистам в данной области техники должно быть понятно, что различные модификации и изменения могут быть внесены в детали в соответствии со всеми опубликованными идеями изобретения, и эти изменения находятся в пределах объема защиты настоящего изобретения. Настоящее изобретение полностью определяется прилагаемой формулой изобретения и любыми ее эквивалентами.

Изобретение относится к биотехнологии и медицине. Предложено антитело, способное специфически связываться с HBsAg, выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело, вектор экспрессии, клетка-хозяин для получения антитела. Предложен способ получения антитела, фармацевтическая композиция для лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV, и фармацевтическая композиция для профилактики инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV, у субъекта, применение антитела или фармацевтической композиции в производстве лекарственного средства для лечения HBV инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV инфекцией у субъекта, а также в производстве лекарственного средства для профилактики инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV, у субъекта. Предложен способ лечения HBV инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV инфекцией, у субъекта, способ профилактики инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV, у субъекта. Анти-HBsAg антитела обладают более высокой аффинностью связывания с HBsAg при нейтральном значении pH, чем при кислом значении pH, тем самым существенно повышая эффективность клиренса вируса и пролонгируя время ингибирования вируса. Изобретение позволяет осуществить нейтрализацию вирулентности HBV в организме субъекта, такого как человек, снизить сывороточный уровень HBV ДНК и/или HBsAg в организме субъекта или активировать гуморальный иммунный ответ субъекта, например человека, инфицированного хронической HBV инфекцией, или пациента, у которого имеет место хронический гепатит B. 11 н. и 26 з.п. ф-лы, 7 табл., 22 ил., 5 пр.

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, способное специфически связываться с HBsAg, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с HBsAg с более высокой аффинностью при нейтральном значении pH, чем при кислом значении pH, и где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(1) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1, показанный в SEQ ID NO: 21, HCDR2, показанный в SEQ ID NO: 22, HCDR3, показанный в SEQ ID NO: 13; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1, показанный в SEQ ID NO: 14, LCDR2, показанный в SEQ ID NO: 15, LCDR3, показанный в SEQ ID NO: 23;

(2) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1, показанный в SEQ ID NO: 17, HCDR2, показанный в SEQ ID NO: 18, HCDR3, показанный в SEQ ID NO: 13; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1, показанный в SEQ ID NO: 14, LCDR2, показанный в SEQ ID NO: 15, LCDR3, показанный в SEQ ID NO: 19;

(3) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1, показанный в SEQ ID NO: 17, HCDR2, показанный в SEQ ID NO: 20, HCDR3, показанный в SEQ ID NO: 13; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1, показанный в SEQ ID NO: 14, LCDR2, показанный в SEQ ID NO: 15, LCDR3, показанный в SEQ ID NO: 16;

(4) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1, показанный в SEQ ID NO: 24, HCDR2, показанный в SEQ ID NO: 12, HCDR3, показанный в SEQ ID NO: 13; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1, показанный в SEQ ID NO: 25, LCDR2, показанный в SEQ ID NO: 15, LCDR3, показанный в SEQ ID NO: 16;

(5) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1, показанный в SEQ ID NO: 17, HCDR2, показанный в SEQ ID NO: 12, HCDR3, показанный в SEQ ID NO: 13; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1, показанный в SEQ ID NO: 25, LCDR2, показанный в SEQ ID NO: 15, LCDR3, показанный в SEQ ID NO: 23; или

(6) VH, содержащую следующие 3 CDR: HCDR1, показанный в SEQ ID NO: 17, HCDR2, показанный в SEQ ID NO: 12, HCDR3, показанный в SEQ ID NO: 13; и VL, содержащую следующие 3 CDR: LCDR1, показанный в SEQ ID NO: 25, LCDR2, показанный в SEQ ID NO: 15, LCDR3, показанный в SEQ ID NO: 16.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит каркасную область иммуноглобулина человека и каркасная область необязательно содержит от 1 до 10 обратных мутаций от остатков человека на остатки мыши;

предпочтительно антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодированной геном тяжелой цепи зародышевой линии человека, и/или каркасную область легкой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодированной геном легкой цепи зародышевой линии человека.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит: каркасную область тяжелой цепи, содержащуюся в аминокислотной последовательности, кодированной геном тяжелой цепи зародышевой линии человека SEQ ID NO: 38, и каркасную область легкой цепи, содержащую в аминокислотной последовательности, кодированной геном легкой цепи зародышевой линии человека SEQ ID NO: 39, и каркасная область тяжелой цепи и/или каркасная область легкой цепи необязательно содержит от 1 до 10 обратных мутаций от остатков человека на остатки мыши.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где VH антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VH FR1, как показано в SEQ ID NO: 30, VH FR2, как показано в SEQ ID NO: 31, VH FR3, как показано в SEQ ID NO: 32, и VH FR4, показанную в SEQ ID NO: 33; и/или

VL антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит: VL FR1, как показано в SEQ ID NO: 34, VL FR2, как показано в SEQ ID NO: 35, VL FR3, как показано в SEQ ID NO: 36, и VL FR4, показанную в SEQ ID NO: 37.

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(а) вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из следующих последовательностей:

(i) последовательности, показанной в любой из SEQ ID NO: 3, 5, 6, 8;

(ii) последовательности с заменой, делецией или добавлением одной или более аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, показанной в любой из SEQ ID NO: 3, 5, 6, 8; или

(iii) последовательности с идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, показанной в любой из SEQ ID NO: 3, 5, 6, 8;

и

(b) вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из следующих последовательностей:

(iv) последовательности, показанной в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 7, 9, 10;

(v) последовательности с заменой, делецией или добавлением одной или более аминокислот (например, заменой, делецией или добавлением 1, 2, 3, 4 или 5 аминокислот) по сравнению с последовательностью, показанной в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 7, 9, 10; или

(vi) последовательности с идентичностью последовательности по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 91%, по меньшей мере 92%, по меньшей мере 93%, по меньшей мере 94%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% с последовательностью, показанной в любой из SEQ ID NO: 2, 4, 7, 9, 10;

предпочтительно замена, описанная в (ii) или (v), представляет собой консервативную замену.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-5, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(1) VH с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 3, и VL с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 4;

(2) VH с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 5, и VL с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 2;

(3) VH с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 6, и VL с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 7;

(4) VH с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 8, и VL с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 9;

(5) VH с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 3, и VL с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 10; или

(6) VH с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 3, и VL с последовательностью, показанной в SEQ ID NO: 9.

7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержит константную область, полученную из иммуноглобулина человека.

8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.7, где тяжелая цепь антитела или его антигенсвязывающего фрагмента содержит константную область тяжелой цепи, полученную из человеческого иммуноглобулина (например, IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), и легкая цепь антитела или антигенсвязывающего фрагмента содержит константную область легкой цепи, полученную из человеческого иммуноглобулина (например, κ или λ).

9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.7, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой цепи (CL), как показано в SEQ ID NO: 41.

10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариант константной области тяжелой цепи человеческого IgG1, где вариант имеет следующую замену по сравнению с последовательностью дикого типа, из которой он получен: (i) M252Y, N286E, N434Y; или (ii) K326D, L328Y; где вышеуказанные аминокислотные положения являются положениями согласно системе нумерации Kabat.

11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.7, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи (СН), как показано в SEQ ID NO: 42 или 43.

12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п.7, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи (СН), как показано в SEQ ID NO: 40.

13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, где указанное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(1) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 3, и CH, показанный в SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 4, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(2) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 3, и CH, показанный в SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 4, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(3) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 3, и CH, показанный в SEQ ID NO: 48, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 4, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(4) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 5, и CH, показанный в SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 2, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(5) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 5, и CH, показанный в SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 2, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(6) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 5, и CH, показанный в SEQ ID NO: 48, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 2, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(7) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 6, и CH, показанный в SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 7, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(8) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 6, и CH, показанный в SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 7, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(9) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 6, и CH, показанный в SEQ ID NO: 48, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 7, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(10) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 8, и CH, показанный в SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 9, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(11) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 8, и CH, показанный в SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 9, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(12) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 8, и CH, показанный в SEQ ID NO: 48, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 9, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(13) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 3, и CH, показанный в SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 10, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(14) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 3, и CH, показанный в SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 10, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(15) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 3, и CH, показанный в SEQ ID NO: 48, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 10, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(16) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 3, и CH, показанный в SEQ ID NO: 40, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 9, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41;

(17) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 3, и CH, показанный в SEQ ID NO: 47, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 9, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41; или

(18) тяжелую цепь, содержащую VH, показанную в SEQ ID NO: 3, и CH, показанный в SEQ ID NO: 48, и легкую цепь, содержащую VL, показанную в SEQ ID NO: 9, и CL, показанный в SEQ ID NO: 41.

14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из фрагмента scFv, Fab, Fab', (Fab')₂, Fv, Probody, химерного антитела или гуманизированного антитела; предпочтительно антитело представляет собой химерное антитело или гуманизированное антитело.

15. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-4, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент способно специфически связываться с HBsAg, нейтрализовать вирулентность HBV и/или снижать сывороточный уровень HBV ДНК и/или HBsAg у субъекта.

16. Выделенная молекула нуклеиновой кислоты, которая кодирует антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-15.

17. Вектор экспрессии, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.16.

18. Клетка-хозяин для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15, которая содержит молекулу нуклеиновой кислоты по п.16 или вектор по п.17.

19. Способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15, который включает культивирование клетки-хозяина по п.18 в условиях, которые обеспечивают экспрессию антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и выделение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента из культуры культивированных клеток-хозяев.

20. Фармацевтическая композиция для лечения инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV, которая содержит эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15 и фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.

21. Фармацевтическая композиция для профилактики инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV, у субъекта, которая содержит эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15 и фармацевтически приемлемый носитель и/или эксципиент.

22. Фармацевтическая композиция по п.20 или 21, где у субъекта снижается сывороточный уровень ДНК HBV и/или HBsAg.

23. Фармацевтическая композиция по п.20 или 21, где у субъекта активируется гуморальный иммунный ответ против HBV.

24. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15 или фармацевтической композиции по п.20 в производстве лекарственного средства для лечения HBV инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV инфекцией, у субъекта.

25. Применение антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15 или фармацевтической композиции по п.20 в производстве лекарственного средства для профилактики инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV, у субъекта.

26. Применение по п.24 или 25, где у субъекта снижается сывороточный уровень ДНК HBV и/или HBsAg.

27. Применение по п.24 или 25, где у субъекта активируется гуморальный иммунный ответ против HBV.

28. Применение по п.24 или 25, где субъектом является человек.

29. Применение по п.24 или 25, где заболевание, ассоциированное с инфекцией HBV, представляет собой гепатит B.

30. Применение по п.24, где субъектом является человек с хронической инфекцией HBV или пациент с хроническим гепатитом B.

31. Способ, который применяется для лечения HBV инфекции или заболевания, ассоциированного с HBV инфекцией, у субъекта, включающий введение эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15 или фармацевтической композиции по п.20 субъекту, нуждающемуся в этом.

32. Способ, который применяется для профилактики инфекции HBV или заболевания, ассоциированного с инфекцией HBV, у субъекта, включающий введение эффективного количества антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-15 или фармацевтической композиции по п. 20 субъекту, нуждающемуся в этом.

33. Способ по п.31 или 32, где у субъекта снижается сывороточный уровень ДНК HBV и/или HBsAg.

34. Способ по п.31 или 32, где у субъекта активируется гуморальный иммунный ответ против HBV.

35. Способ по п.31 или 32, где субъектом является человек.

36. Способ по п.31 или 32, где заболевание, ассоциированное с инфекцией HBV, представляет собой гепатит В.

37. Способ по п.31, где субъектом является человек с хронической инфекцией HBV или пациент с хроническим гепатитом B.