ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[1] Инфекции, вызываемые бактериальными патогенами, устойчивыми к противомикробным препаратам (AMR), представляют собой растущую угрозу для здоровья населения. Продолжающаяся эпидемия, вызванная AMR-патогенами, частично вызвана эмпирической терапией антибиотиками широкого спектра действия. Это привело к исследованию специфических способов в отношении патогенов, включая моноклональные антитела (mAb), для предотвращения или лечения серьезных бактериальных инфекций. В настоящее время разрабатываются многочисленные моноклональные антитела для предупреждения или лечения устойчивых к антибиотикам бактериальных инфекций (см., например, DiGiandomenico, A., and B.R. Sellman, Curr. Opin. Microbiol., 27: 78-85, (2015)). Такие стратегии пассивной иммунизации обеспечивают немедленный и мощный иммуноглобулиновый ответ против целевого патогена. В идеале моноклональное антитело или смесь моноклональных антител обеспечивают несколько механизмов действия для нейтрализации ключевых механизмов бактериальной вирулентности и усиления врожденного иммунного ответа хозяина, обеспечивая тем самым наибольшую возможность для клинического успеха.
[2] Staphylococcus aureus представляет собой бактериальный патоген, вызывающий широкий спектр заболеваний, включая инфекции кожи и мягких тканей, эндокардит, остеомиелит, пневмонию и бактериемию (Lowy, FD, N. Engl. J. Med., 339 (8): 520-32, 1998). Доклинические исследования показывают, что подходы на основе моноклональных антител являются перспективными для профилактики и дополнительной терапии против инфекций, вызванных S. aureus (см., например, Hazenbos et al., PLoS Pathog., 9(10):e1003653. doi: 10.1371/journal.ppat.10036532013 (2013); Rouha, H., MAbs, 7(1): 243-254 (2015); Foletti et al., J. Mol. Biol., 425(10): 1641-1654 (2013); Karauzum et al., J Biol Chem., 287(30): 25203-15 (2012); and Hua et al., Antimicrob Agents Chemother., 58(2): 1108-17, 2014). Было показано, что комбинация мультимеханических моноклональных антител, нацеленная на альфа-токсин (AT) S. aureus и фактор слипания A (ClfA), усиливает защиту и улучшает охват штаммов по сравнению с каждым индивидуальным моноклональным антителом в модели бактериемии с летальным исходом, вызванной S. aureus (Tkaczyk et al., MBio., 7(3). pii: e00528-16 (2016)); однако тестируемое моноклональное антитело против ClfA проявляет пониженную аффинность связывания и функциональную активность против последовательности-основателя ClfA ClfA002 по сравнению с двумя другими последовательностями-основателями (ClfA001 и ClfA004).
[3] Таким образом, остается потребность в композициях и способах лечения инфекций, вызываемых Staphylococcus aureus, в частности инфекций, устойчивых к доступным в настоящее время антибиотикам. Настоящее изобретение предусматривает такие композиции и способы.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[4] В данном документе предусмотрены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с белком, представляющим собой фактор слипания A (ClfA) Staphylococcus aureus (S. aureus). В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком ClfA S. aureus, содержат (VH), определяющую комплементарность область (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2, CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3, CDR1 вариабельной области легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5, и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6, и антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат константный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность CSYHLC (SEQ ID NO: 21). В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13. В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14.
[5] В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком ClfA S. aureus, содержат VH, VL и константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность CSYHLC (SEQ ID NO: 21), где VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13.
[6] В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком ClfA S. aureus, содержат VH, VL и константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность CSYHLC (SEQ ID NO: 21), где VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14.
[7] В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком ClfA S. aureus, содержат CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL SAR114. В определенных случаях CDR представляют собой CDR, определенные по Kabat, CDR, определенные по Chothia, или CDR, определенные по AbM. В определенных случаях антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат константный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность CSYHLC (SEQ ID NO: 21).
[8] В определенных случаях константный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность MHEACSYHLCQKSLSLS (SEQ ID NO: 23). В определенных случая константный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24. В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 50. В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 26.
[9] В определенных случаях IC50 антитела или его антиген-связывающего фрагмента для ClfA001, ClfA002 и ClfA004 в анализе ингибирования связывания фибриногена находятся в пределах 2 мкг/мл друг от друга. В определенных случаях все из значений IC50 антитела или его антиген-связывающего фрагмента для ClfA001, ClfA002 и ClfA004 в анализе ингибирования связывания фибриногена находятся в диапазоне от 1 мкг/мл до 5 мкг/мл. В определенных случаях все из значений аффинности связывания (KD) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента для ClfA001, ClfA002 и ClfA004 находятся в диапазоне от 200 до 350 пМ.
[10] В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеют чистоту мономера, которая снижается не более чем на 5% после воздействия на антитело или антигенсвязывающий фрагмент типичным белым светом при 2 клк/ч. при 23°C в течение 14 дней. В определенных случаях антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат мутацию, которая увеличивает время полужизни по сравнению с таким же антителом без мутации у мышей с человеческим FcRn. В определенных случаях антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат мутацию, которая увеличивает время полужизни по сравнению с таким же антителом без мутации, и где мутация не ингибирует активность OPK по сравнению с таким же антителом или антигенсвязывающим фрагментом без мутации.
[11] В данном документе также предусмотрены биспецифические антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, который специфически связывается с белком ClfA S. aureus и альфа-токсином (AT) S. aureus. В определенных случаях биспецифическое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком ClfA S. aureus и альфа-токсином (AT) S. aureus, содержат CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2, CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3, CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5, и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6. В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13. В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14. В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10, CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12. В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15. В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16.
[12] В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком ClfA S. aureus, содержат CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH, CDR1 VL, CDR2 VL и CDR3 VL SAR72, SAR80, SAR113, SAR132, SAR352, SAR372, SAR510, SAR547, SAS1, SAS19 или SAS203. В определенных случаях CDR представляют собой CDR, определенные по Kabat, CDR, определенные по Chothia, или CDR, определенные по AbM. В определенных случаях антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательности вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, содержащие аминокислотные последовательности, представленные под (а) SEQ ID NO: 17 и 18 соответственно, (b) SEQ ID NO: 30 и 31 соответственно, (c) SEQ ID NO: 32 и 33 соответственно, (d) SEQ ID NO: 34 и 35 соответственно, (e) SEQ ID NO: 36 и 37 соответственно, (f) SEQ ID NO: 38 и 39 соответственно, (g) SEQ ID NO: 40 и 41 соответственно, (h) SEQ ID NO: 42 и 43 соответственно, (i) SEQ ID NO: 44 и 45 соответственно, (j) SEQ ID NO: 46 и 47 соответственно или (k) SEQ ID NO: 48 и 49 соответственно.
[13] В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком ClfA S. aureus, содержат VH и VL, где VH содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 17, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 или 48.
[14] В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком ClfA S. aureus, содержат VH и VL, где VL содержит аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 18, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47 или 49.
[15] В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержат константную область тяжелой цепи. В определенных случаях константная область тяжелой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2. В определенных случаях константная область тяжелой цепи представляет собой константную область IgG1 человека. В определенных случаях константная область тяжелой цепи содержит мутацию N3, N3E или N3F. В определенных случаях константная область тяжелой цепи содержит мутацию YTE.
[16] В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержат константную область легкой цепи. В определенных случаях константная область легкой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей легкой цепи человеческого иммуноглобулина IgGκ и IgGλ. В определенных случаях константная область легкой цепи представляет собой константную область легкой цепи человеческого IgGκ.
[17] В определенных случаях антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляют собой моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент.
[18] В определенных случаях антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляют собой полноразмерное антитело. В определенных случаях антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляют собой антигенсвязывающий фрагмент.В определенных случаях антигенсвязывающий фрагмент включает Fab, Fab', F(ab')2, одноцепочечный Fv (scFv), связанный дисульфидной связью Fv, интратело, IgGΔCH2, минитело, F(ab')3, тетратело, триатело, диатело, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2 или scFv-Fc.
[19] В определенных случаях антитело, которое специфически связывается с белком ClfA S. aureus, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 50, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 26.
[20] В определенных случаях антитело или его антигенсвязывающий фрагмент дополнительно содержат детектируемую метку.
[21] В данном документе также предусмотрены композиции, содержащие предусмотренное в данном документе антитело. В определенных случаях композиция содержит антитело, предусмотренное в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.
[22] В определенных случаях композиция содержит антитело, предусмотренное в данном документе, и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком AT S. aureus, и необязательно фармацевтически приемлемый носитель. В определенных случаях антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком AT S. aureus, содержат CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10, CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12. В определенных случаях антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком AT S. aureus, содержат VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15. В определенных случаях антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком AT S. aureus, содержат VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16. В определенных случаях антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком AT S. aureus, содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 27. В определенных случаях антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком AT S. aureus, содержат легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28.
[23] В данном документе также предусмотрены способы применения антитела, предусмотренного в данном документе. В определенных случаях способ лечения или предотвращения инфекции, вызываемой S. aureus, у субъекта включает введение субъекту антитела или антигенсвязывающего фрагмента, предусмотренных в данном документе, или композиции, предусмотренной в данном документе.
[24] В определенных случаях способ лечения или профилактики инфекции, вызываемой S. aureus, у субъекта включает введение субъекту антитела или антигенсвязывающего фрагмента, предусмотренных в данном документе, и антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с альфа-токсином (AT) S. aureus. В определенных случаях антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком AT S. aureus, содержат CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10, CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12. В определенных случаях антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком AT S. aureus, содержат VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15. В определенных случаях антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком AT S. aureus, содержат VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16. В определенных случаях антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком AT S. aureus, содержат тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 27. В определенных случаях антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком AT S. aureus, содержат легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28. В определенных случаях антитело к ClfA S. aureus или антигенсвязывающий фрагмент, представленные в данном документе, и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком AT S. aureus, вводят одновременно. В определенных случаях антитело к ClfA S. aureus или антигенсвязывающий фрагмент, представленные в данном документе, и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком AT S. aureus, вводят последовательно.
[25] В определенных случаях лечение или предупреждение инфекции, вызываемой S. aureus, у субъекта включает подавление сепсиса, связанного со S. aureus, ингибирование агглютинации S. aureus, подавление образования тромбоэмболических поражений, нейтрализацию токсинов, индуцирование опсонофагоцитоза, ингибирование связывания фибриногена со S. aureus, ингибирование агглютинации S. aureus или любую комбинацию из вышеуказанного.
[26] В определенных случаях у субъекта имеется диабет. В определенных случаях субъектом является человек.
[27] В данном документе также предусмотрены полинуклеотиды. В определенных случаях выделенный полинуклеотид содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую VH или тяжелую цепь антитела или его антигенсвязывающий фрагмент, предусмотренные в данном документе. В определенных случаях молекула нуклеиновой кислоты кодирует VH под SEQ ID NO: 13 или тяжелую цепь под SEQ ID NO: 25, 50 или 52.
[28] В определенных случаях выделенный полинуклеотид содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую VL или легкую цепь антитела или его антигенсвязывающий фрагмент, предусмотренные в данном документе. В определенных случаях молекула нуклеиновой кислоты кодирует VL под SEQ ID NO: 14 или легкую цепь под SEQ ID NO: 26.
[29] В определенных случаях выделенный полинуклеотид содержит молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую VH или тяжелую цепь антитела или его антигенсвязывающий фрагмент, предусмотренные в данном документе, и VH или легкую цепь антитела или его антигенсвязывающий фрагмент.
[30] В данном документе также предусмотрены векторы. В определенных случаях изолированный вектор содержит полинуклеотид, предусмотренный в данном документе.
[31] В данном документе также предусмотрены клетки-хозяева. В определенных случаях клетка-хозяин содержит полинуклеотид, предусмотренный в данном документе, вектор, предусмотренный в данном документе, или первый вектор, полинуклеотид, предусмотренные в данном документе, и второй вектор, содержащий полинуклеотид, предусмотренный в данном документе. В определенных случаях клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из клеток CHO, NS0, PER-C6, HEK-293 и HeLa. В определенных случаях клетка-хозяин является изолированной.
[32] В данном документе также предусмотрены способы получения антител или антигенсвязывающих фрагментов. В определенных случаях способ получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента включает культивирование клетки-хозяина, предусмотренной в данном документе, с обеспечением продуцирования антитела или его антигенсвязывающего фрагмента.
[33] В данном документе также предусмотрены способы обнаружения S. aureus или ClfA S. aureus. В определенных случаях способ обнаружения S. aureus или ClfA S. aureus в образце включает приведение образца в контакт с антителом или его антигенсвязывающим фрагментом, предусмотренными в данном документе.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НЕСКОЛЬКИХ ИЗОБРАЖЕНИЙ ГРАФИЧЕСКОГО (ГРАФИЧЕСКИХ) МАТЕРИАЛА(МАТЕРИАЛОВ)
[34] На фигуре 1 показана серия графиков, иллюстрирующих ингибирование связывания фибриногена с тремя основными генотипами ClfA, как измерено в присутствии серийно разведенного (от 666 мкМ до 2,55 мкМ) mAb к ClfA 11H10 (фигура 1А) или SAR114 (фигура 1B). Данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов.
[35] На фигуре 2 показан график, который иллюстрирует агглютинацию клинических изолятов S. aureus в присутствии человеческой плазмы крови и mAbs к ClfA. На фигуре 2 показана минимальная концентрация mAb 11H10 и SAR114, которая необходима для подавления бактериальной агглютинации. Данные являются репрезентативными для двух независимых экспериментов. с-IgG был использован в качестве отрицательного контроля и не показывал какой-либо степени ингибирования при 200 мкг/мл.
[36] На фигуре 3 показана серия графиков, которые иллюстрируют опсонофагоцитарное уничтожение (OPK) моноклонального антитела SAR114 к ClfA в отношении клинических изолятов S. aureus ARC635 (ST5) (фигура 3A), SF8300 (ST8) (фигура 3B), NRS383 (ST346) (фигура 3C), NRS382 (ST5) (фигура 3D), NRS384 (ST8) (фигура 3E) и ARC2081 (ST30) (фигура 3F). Штаммы S. aureus инкубировали с человеческими клетками HL-60, сывороткой крови человека и серийными разведениями SAR114 (квадраты) или c-IgC (кружки). На графиках представлены средние значения (стандартное отклонение (SD) для трех независимых экспериментов.
[37] На фигуре 4 показан график, иллюстрирующий ингибирование агглютинации нескольких типов S. aureus моноклональным антителом SAR114. 112 клинических изолятов S. aureus, представляющих 40 различных типов последовательностей (ST) и некоторых необнаруженных (NF) тестировали, как описано в примере 1.
[38] На фигуре 5 показаны графики, иллюстрирующие конкуренцию SAR114 и 11H10 за связывание с генотипом ClfA001. На графике на фигуре 5A показаны результаты анализа конкурентного связывания ELISA, как описано в примере 1. Данные представляют средние значения (стандартное отклонение (SD). На графике на фигуре 5B показаны результаты анализа связывания с применением OCTECT®, описанного в примере 1.
[39] На фигуре 6 представлены графики, показывающие эффект мутаций YTE и N3 в антибактериальных антителах на опсонофагоцитарное уничтожение (OPK). Cam004 (верхняя панель) представляет собой антитело к псевдомонадам, а 2F4 (нижняя панель) представляет собой антитело к S. aureus. Антитело R347 применяли в качестве отрицательного контроля. (См. пример 2.)
[40] На фигуре 7 представлены графики, показывающие, что мутация N3 не снижает способность SAR114 ингибировать связывание ClfA001, ClfA002 или ClfA1004 с фибриногеном. (См. пример 2.)
[41] На фигуре 8 представлены таблицы, отражающие эффект мутаций N3F и N3Y на SAR114 в анализах агглютинации и определения содержания фибриногена. (См. пример 3.)
[42] На фигуре 9 представлены графики, показывающие эффект мутаций N3 (N3W), N3F и N3Y на фармакокинетику (PK) у мышей, трансгенных по человеческому FcRn (верхняя панель) и OPK (нижняя панель) SAR114. (См. пример 3.)
[43] На фигурах 10A-M показана серия графиков, которые иллюстрируют, что комбинация моноклональных антител SAR114 и MEDI4893* обеспечивает охват штаммов в мышиной модели с бактериемией с летальным исходом, как описано в примере 4. Различные протестированные клинические изоляты S. aureus из различных типов последовательности (ST) и генотипов ClfA включали: NRS123 (ST1, ClfA012), NRS387 (ST5, ClfA002), ARC635 (ST5, ClfA002), 3049043 (ST5, ClfA002), 3049057 (ST8, ClfA001), SF8300 (ST8, Clf A001), 3049088 (ST30, ClfA004), 3049114 (ST30, ClfA004), ARC2784 (ST188, ClfA019), 9043, 9057, 9157 и 2784. Данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. Пунктирные линии с кружком на конце представляют мышей, которых обрабатывали контрольным антителом IgG. Линии с квадратом на конце представляют мышей, которых обрабатывали SAR114 (15 мг/кг). Линии с треугольником на конце, повернутым вверх, представляют мышей, которых обрабатывали MEDI4893* (15 мг/кг). Линии с треугольником на конце, повернутым вниз, представляют мышей, которых обрабатывали SAR114 и MEDI4893* (7,5 мг/кг каждая). (См. пример 4.)
[44] На фигуре 11 показана серия графиков, иллюстрирующих, что комбинация моноклональных антител SAR114 и MEDI4893* обеспечивает защиту от вызванной CA-MRSA SF8300 внутривенным путем бактериемии с летальным исходом у мышей BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J с диабетом (db/db). Горизонтальные полосы на двух нижних панелях представляют среднее геометрическое в отношении КОЕ. Данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. (См. пример 5.)
[45] На фигуре 12 представлены изображения, демонстрирующие влияние комбинации моноклональных антител SAR114 и MEDI4893* на повреждение печени у мышей db/db, которых подвергали бактериемии с летальным исходом, вызванной CA-MRSA SF8300 внутривенным путем, либо в результате грубой патологии (слева), либо после окрашивания секции гематоксилином и эозином (справа). (См. пример 7.)
[46] На фигуре 13 показана серия графиков, которые иллюстрируют, что комбинация моноклональных антител SAR114 и MEDI4893* обеспечивает охват штаммов для защиты в мышиной модели бактериемии с летальным исходом db/db с диабетом. (См. пример 8.)
[47] На фигуре 14 представлены схематические изображения биспецифических конструкций, использующих mAb к ClfA в качестве каркаса (фигура 14A) или scFv mAb к AT MEDI4893*, связанных через 10-аминокислотный линкер (GGGGx2) с N-концом тяжелой цепи моноклонального антитела ClfA (фигура 14B) или С-концом тяжелой цепи (фигура 14C). (См. пример 9.)
[48] На фигуре 15 показана серия графиков, иллюстрирующих in vitro характеристику SAR114 к ClfA или 11H10/MEDI4893* BiSAb, как описано в примере 9. На фигурах 15A и 15D проиллюстрированы значения активности BiS2 и BiS3 по сравнению с MEDI4893* в АТ-опосредованном гемолитическом анализе RBC кролика. Серийные разведения BiSAb и MEDI4893* инкубировали с AT отдельно (фигура 15A) или 10 М избытком ClfA001 (фигура 15D) и RBC. Процент ингибирования гемолиза рассчитывали следующим образом: 100*(100-(ODAT+mAb) / (ODAT отдельно)). Данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. На фигурах 15B и 15C проиллюстрированы результаты анализа связывания иммобилизованного фибриногена, описанного в примере 9. Серийные разведения BiSAb, SAR114 или 11H10 инкубировали только с ClfA (фигура 15B) или с 10 М избытком AT (фигура 15C). Данные представляют собой средние значения стандартного отклонения для трех отдельных экспериментов. Процент ингибирования связывания рассчитывали как 100*(100-(ODClfA+mAb) / (ODClfA отдельно)).
[49] На фигуре 16 показана серия графиков, иллюстрирующих ингибирование связывания фибриногена с тремя основными генотипами ClfA, как описано в примере 9. Ингибирование связывания фибриногена измеряли в присутствии серийных разведений моноклональных антител 11H10 (фигура 16A), SAR114 (фигура 16B) или соответствующих биспецифических антител (фигура 16C). Аналогичный анализ проводили путем насыщения AT scFv в присутствии 10 М избытка AT (6,6 мМ) (фигуры 16D-F).
[50] На фигуре 17 показана серия графиков, иллюстрирующих активность опсонофагоцитарного уничтожения (OPK) биспецифических антител к ClfA/AT (BiS). Изолят S. aureus Newman инкубировали с человеческими клетками HL-60, сывороткой крови человека и серийными разведениями исходных моноклональных антител 11H10 или молекул 11H10-BiS (фигура 17A), или серийными разведениями исходных моноклональных антител SAR114 или молекул SAR114-BiS (фигура 17B). На графиках представлены средние значения ((SD) двух независимых экспериментов. (См. пример 9.)
[51] На фигуре 18 показана серия графиков, иллюстрирующих эффективность биспецифических антител mAb/MEDI4893* к ClfA на мышиной модели с бактериемией. Мышей Balb/c (n=10) пассивно иммунизировали IP с помощью SAR114/MEDI4893 * BiS2, BiS3 или комбинации SAR114+MEDI4893* в указанных концентрациях, и через 24 часа внутривенным путем инфицировали LD90 изолятами S. aureus SF8300 (6e7 КОЕ) (фигура 18A) или 3049057 (5e7 КОЕ) (фигура 18B). Эффективность защиты для mAb 11H10/MEDI4893* BiS2, BiS3 или 11H10+MEDI4893* оценивали в отношении заражения SF8300 (фигура 18C) или 30419057 (фигура 18D). Выживаемость отслеживали в течение 2 недель. Результаты анализировали с помощью логарифмического рангового критерия (Mantel Cox). Статистический анализ по сравнению с c-IgG считался статистически различным, если p<0,05, и отмечался звездочкой (*). Данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. (См. пример 10.)
[52] На фигуре 19 показана серия графиков, иллюстрирующих, что ClfA связывает SAR114/MEDI4893* BiSAb в мышиной модели пневмонии с летальным исходом. Мышей C57/B6 (n=10) пассивно иммунизировали IP с помощью BiS2, BiS3, MEDI4893* или комбинации mAb SAR114+MEDI4893* в указанных концентрациях и интраназально (IN) инфицировали через 24 часа 1,5e6 КОЕ изолятов S. aureus. SF8300 (фигура 19A) или изогенным мутантом SF8300 ΔclfA (фигура 19B). Выживаемость отслеживали в течение 6 дней. Результаты анализировали с помощью логарифмического рангового критерия (Mantel Cox). Статистический анализ по сравнению с c-IgG считался статистически различным, если p<0,05. Данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов. (См. пример 11.)
[53] На фигуре 20 показаны уровни SAR114, SAR114 N3F и SAR114 N3Y у макак-крабоедов в течение периода, составляющего 60 дней, после введения 5 мг/кг антител.
[54] На фигуре 21 показан график, иллюстрирующий иммуногенность дикого типа и Fc-областей N3Y с использованием анализа стимуляции PBMC ex vivo.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[55] Настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты (например, моноклональные антитела и их антигенсвязывающие фрагменты), которые связываются с белком, представляющим собой фактор слипания A (ClfA) Staphylococcus aureus (S. aureus) (и, необязательно, также с альфа-токсином (AT) S. aureus). Настоящее изобретение также предусматривает композиции, содержащие такие антитела или их фрагменты, а также способы применения таких антител, их фрагментов или композиций.
[56] Термин "антитело" обозначает молекулу иммуноглобулина, которая распознает мишень, такую как белок, полипептид, пептид, углевод, полинуклеотид, липид или комбинации вышеуказанного, и специфично связывается с ней посредством по меньшей мере одного антигенраспознающего центра в пределах вариабельного участка молекулы иммуноглобулина. Термин "антитело", используемый в данном документе, охватывает интактные поликлональные антитела, интактные моноклональные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, человеческие антитела, слитые белки, содержащие антитело, а также любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина при условии, что антитела проявляют требуемую биологическую активность. Антитело может относиться к любому из пяти основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM или их подклассов (изотипов) (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) на основании особенностей их константных доменов тяжелой цепи, обозначаемых соответственно как альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю. Разные классы иммуноглобулинов имеют различные и хорошо известные структуры субъединиц и трехмерные пространственные конфигурации. Антитела могут быть "голыми" или конъюгированными с другими молекулами, такими как токсины, радиоактивные изотопы и т.д.
[57] Термин "моноклональные антитела", применяемый в данном документе, относится к антителам, которые продуцируются одним клоном B-клеток и связываются с одним и тем же эпитопом. Напротив, термин "поликлональные антитела" относится к популяции антител, которые продуцируются различными B-клетками и связываются с различными эпитопами одного и того же антигена.
[58] Термин "фрагмент антитела" относится к части интактного антитела. "Антигенсвязывающий фрагмент", "антигенсвязывающий домен" или "антигенсвязывающая область" относится к части интактного антитела, которая связывается с антигеном. Антигенсвязывающий фрагмент может содержать области интактного антитела, распознающие антиген (например, определяющие комплементарность области (CDR)). Примеры антигенсвязывающих фрагментов антител включают без ограничения Fab-, Fab'-, F(ab')2- и Fv-фрагменты, линейные антитела и одноцепочечные антитела. Антигенсвязывающий фрагмент антитела может быть получен у любого вида животных, таких как грызуны (например, мышь, крыса или хомяк) и у людей, или может быть получен искусственно.
[59] Целое антитело, как правило, состоит из четырех полипептидов: двух идентичных копий полипептида тяжелой (H) цепи и двух идентичных копий полипептида легкой (L) цепи. Каждая из тяжелых цепей содержит одну N-концевую вариабельную (VH) область и три C-концевых константных (CH1, CH2 и CH3) области, и каждая легкая цепь содержит одну N-концевую вариабельную (VL) область и одну C-концевую константную (CL) область. Вариабельные области каждой пары легкой и тяжелой цепей образуют антигенсвязывающий сайт антитела. Области VH и VL характеризуются одинаковой общей структурой, при этом каждая область содержит четыре каркасные области, последовательности которых являются относительно консервативными. Используемый в данном документе термин "каркасная область" относится к относительно консервативным аминокислотным последовательностям в вариабельной области, которые расположены между гипервариабельными или определяющими комплементарность областями (CDR). В каждом вариабельном домене присутствуют четыре каркасных области, которые обозначены FR1, FR2, FR3 и FR4. Каркасные области образуют β-складки, которые обеспечивают структурный каркас вариабельной области (см., например C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2001)). Три CDR, известные как CDR1, CDR2 и CDR3, образуют "гипервариабельную область" антитела, которая отвечает за связывание антигена.
[60] Термин "нумерация по Kabat" и подобные термины известны в данной области техники и относятся к системе нумерации аминокислотных остатков в вариабельных областях тяжелой и легкой цепей антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. В определенных случаях CDR могут быть определены в соответствии с системой нумерации по Kabat (см., например Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 and Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Используя систему нумерации по Kabat, CDR в молекуле тяжелой цепи антитела, как правило, присутствуют в положениях аминокислот с 31 по 35, которые необязательно могут включать одну или две дополнительные аминокислоты, следующие за 35 (обозначенные в схеме нумерации по Kabat как 35A и 35B) (CDR1), положениях аминокислот с 50 по 65 (CDR2) и положениях аминокислот с 95 по 102 (CDR3). Используя систему нумерации по Kabat, CDR в молекуле легкой цепи антитела, как правило, присутствуют в положениях аминокислот с 24 по 34 (CDR1), в положениях аминокислот с 50 по 56 (CDR2) и в положениях аминокислот с 89 по 97 (CDR3). В конкретном варианте осуществления CDR антител, описанных в данном документе, были определены в соответствии со схемой нумерации по Kabat.
[61] В отличие от этого, Chothia ссылается на расположение структурных петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Конец петли CDR-H1 по Chothia при нумерации с использованием правил нумерации по Kabat варьирует от H32 до H34 в зависимости от длины петли (это обусловлено тем, что в соответствии со схемой нумерации по Kabat вставки расположены в H35A и H35B; при этом если не присутствуют ни 35A, ни 35B, то петля заканчивается на 32; если присутствует только 35A, то петля заканчивается на 33; если присутствуют как 35A, так и 35B, то петля заканчивается на 34). Определение гипервариабельных участков по AbM представляет собой компромисс между определением CDR по Kabat и структурных петель по Chothia и применяется в программном обеспечении для моделирования антител AbM от Oxford Molecular.
[62] В одном варианте осуществления композиция содержит первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, моноклональное антитело или фрагмент), которое специфически связывается с белком, представляющим собой фактор слипания А (ClfA) Staphylococcus aureus, и второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, моноклональное антитело или фрагмент), которое специфически связывается с белком альфа-токсина (AT) S. aureus. Было продемонстрировано, что среди многих поверхностных адгезинов S. aureus фактор слипания A (ClfA) играет важную роль в серьезных инфекциях кровотока (Foster et al., Nat. Rev. Microbiol., 12: 49-62 (2014); and Murphy et al., Hum. Vaccin., 7(Suppl): 51-59, 2011). ClfA связывает фибриноген и способствует как прикреплению бактерий к фибриногену, так и слипанию бактерий, оба признака являются ключевыми в развитии инфекции кровотока, вызванной S. aureus (Vaudaux et al., Infect. Immun., 63: 585-590 (1995); McDevitt et al., Mol. Microbiol., 11: 237-248 (1994); and McDevitt et al., Eur. J. Biochem., 247: 416-424, 1997). ClfA, связанный с фибрином или фибриногеном в месте повреждения, или нанесенный на постоянное устройство, может способствовать слипанию бактерий (Foster et al., выше) и скоплению бактерий, что, как считается, увеличивает бактериальную инвазивность (McDevitt et al., Eur. J. Biochem., 247: 416-424 (1997); McAdow et al., PLoS Pathog., 7:e1002307 (2011); Flick et al., Blood, 121: 1783-1794 (2013); and Rothfork et al., J. Immunol., 171: 5389-5395, 2003). Сообщалось также, что ClfA нарушает отложение комплемента, необходимое для опсонофагоцитарного уничтожения бактерий (OPK) (Hair et al., Infect. Immun., 78: 1717-1727, 2010). В соответствии с этими наблюдениями, изогенные мутанты ΔclfA проявляли пониженную вирулентность в моделях инфекции (McAdow et al., выше; Josefsson et al., PLoS One, 3: e2206 (2008); и Josefsson et al., J Infect. Dis., 184: 1572-1580, 2001). Кроме того, пассивная иммунизация человеческим обогащенным внутривенным (i.v.) иммуноглобулином (Ig) (INH-A21 или Veronate) или моноклональным антителом (тефибазумаб или аурексис) к ClfA улучшала исходы заболевания у пациентов с инфекциями кровотока, вызванными S. aureus (Vernachio et al., Antimcirob. Agents Chemother., 47: 3400-3406 (2003); and Vernachio et al., Antimicrob. Agents Chemother., 50: 511-518, 2006). Однако эти препараты на основе антител не улучшили результаты клинических исследований профилактики или вспомагательной терапии ванкомицином для предотвращения или лечения бактериемии, вызванной S. aureus, у детей с очень низкой массой тела при рождении (DeJonge et al., J. Pediatr., 151: 260-265 (2007); Capparelli et al., Antimicrob. Agents Chemother., 49: 4121-4127 (2005); and Bloom et al., Pediatr. Infect. Dis., 24: 858-866, 2005). Структура и функция ClfA подробно описаны, например, в McDevitt et al., Mol. Microbiol., 11: 237-248, 1994).
[63] Альфа-токсин (AT) является ключевым фактором вирулентности при некоторых заболеваниях, вызванных S. aureus, включая пневмонию, инфекции кожи и мягких тканей (SSTI) и бактериемию (Bubeck Wardenburg, J. and O. Schneewind, J. Exp.Med., 205: 287-294 (2008); Inoshima et al., J. Invest. Dermatol., 132: 1513-1516 (2012); and Foletti et al., выше). Пассивная иммунизация моноклональными антителами к AT снижала тяжесть заболевания на моделях пневмонии и дермонекроза (Hua et al., Antimicrob. Agents Chemother., 58: 1108-1117 (2014); Tkaczyk et al., Clin. Vaccine Immunol., 19: 377-385 (2012); and Ragle, B.E. and J. Wardenburg Bubeck, Infect. Immun., 77: 2712-2718 (2009)), и вакцинация анатоксином AT, содержащим мутацию H35L (ATH35L), обеспечивала защиту от смерти в мышиных моделях бактериемии с летальным исходом и пневмонии (Bubeck Wardenburg, выше, Foletti et al., выше, Hua et al., выше, Ragle, выше, Menzies, B.E. and D.S Kernodle, Infect. Immun., 77: 2712-2718 (2009); and Adhikari et al., PLoS One, 7: e38567 (2012)). AT способствует множеству аспектов патогенеза, обусловленного S. aureus, во время бактериемии и сепсиса, включая стимуляцию гипервоспалительного ответа, характерного для сепсиса, и активацию ADAM10-опосредованного расщепления эндотелиальных плотных контактов, что приводит к потере целостности сосудов (Powers et al., J. Infect. Dis., 206: 352-356 (2012); Wilke, G.A. and J. Bubeck Wardenburg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 107: 13473-13478 (2010); and Becker et al., J Innate Immun., 6: 619-631, 2014). Также было продемонстрировано, что AT нацеливается на тромбоциты, что предотвращает восстановление поврежденного эндотелиального барьера и способствует дисфункции органов за счет образования агрегатов тромбоцитов и нейтрофилов (Powers et al., Cell Host Microbe, 17: 775-787, 2015). Структура и функция альфа-токсина подробно описаны, например, в Bhakdi, S. and J. Tranum-Jensen, Microbiol. Mol. Biol. Rev., 55(4): 733-751 (1991).
[64] Моноклональные и поликлональные антитела, которые связывают ClfA, известны в данной области техники (см., например патент США 7364738; Hall et al., Infect. Immun., 71(12): 6864-6870 (2003); and Vernachio et al., Antimicrob. Agents Chemother., 47(11): 3400-3406 (2003)) и коммерчески доступны из таких источников, как, например, Creative Biolabs (Ширли, Нью-Йорк). Как обсуждается выше, в то время как некоторые моноклональные антитела к ClfA (например, моноклональное антитело 11H10, описанное в Tkaczyk et al., MBio., 7 (3). Pii: e00528-16 (2016)) показали эффективность против инфекций, вызванных S. aureus, на моделях бактериемии, было обнаружено, что такие антитела проявляют пониженную аффинность к ClfA и нарушение ингибирования связывания фибриногена с последовательностью-основателем ClfA (ClfA002), экспрессируемой некоторыми штаммами Staphylococcus aureus, устойчивыми к метициллину (MRSA). Таким образом, настоящее изобретение предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, моноклональное антитело или фрагмент), которое специфически связывается с ClfA с более чем 100-кратным повышением аффинности к трем значимым вариантам ClfA, включая ClfA002, и сильным ингибированием бактериальной агглютинация 112 различными клиническими изолятами. В этом отношении, в одном варианте осуществления первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, моноклональное антитело или фрагмент) композиции, описанной в данном документе, специфически связывается с ClfA и состоит по сути из или состоит из (i) полипептида тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность определяющей комплементарность области 1 (CDR) под SEQ ID NO: 1, аминокислотную последовательность CDR2 под SEQ ID NO: 2 и аминокислотную последовательность CDR3 под SEQ ID NO: 3, и (ii) полипептида легкой цепи, содержащего аминокислотную последовательность CDR1 под SEQ ID NO: 4, аминокислотную последовательность CDR2 под SEQ ID NO: 5 и аминокислотную последовательность CDR3 под SEQ ID NO: 6 или содержит их. В другом варианте осуществления полипептид тяжелой цепи первого антитела или антигенсвязывающего фрагмента (например, моноклональное антитело или фрагмент), состоит по сути из или состоит из аминокислотной последовательности вариабельной области под SEQ ID NO: 13 или содержит ее, и полипептид легкой цепи первого антитела или антигенсвязывающего фрагмента состоит по сути из или состоит из аминокислотной последовательности вариабельной области под SEQ ID NO: 14 или содержит ее. В определенных случаях антитело или антигенсвязывающий фрагмент (например, моноклональное антитело или фрагмент) содержат константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность CSYHLC (SEQ ID NO: 21), MHEACSYHLCQKSLSLS (SEQ ID NO: 23) или SEQ ID NO:24.
[65] Моноклональные и поликлональные антитела, которые связывают AT, также известны в данной области техники (см., например Hua et al., Antimicrob. Agents Chemother., 58(2): 1108-1117 (2014); and Oganesyan et al., J. Biol. Chem., 289: 29874-29880 (2014)) и коммерчески доступны из таких источников, как, например, Sigma Aldrich (Сент-Луис, Миссури) и AbCam (Кембридж, Массачусетс). В одном варианте осуществления второе антитело или антигенсвязывающий фрагмент (например, моноклональное антитело или фрагмент) композиции, описанной в данном документе, специфически связывается с белком альфа-токсина (AT) S. aureus и состоит по сути из или состоит из (i) полипептида тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность CDR1 под SEQ ID NO: 7, аминокислотную последовательность CDR2 под SEQ ID NO: 8 и аминокислотную последовательность CDR3 под SEQ ID NO: 9, и (ii) полипептида легкой цепи, содержащего аминокислотную последовательность CDR1 под SEQ ID NO: 10, аминокислотную последовательность CDR2 под SEQ ID NO: 11 и аминокислотную последовательность CDR3 под SEQ ID NO: 12 или содержит их. В другом варианте осуществления полипептид тяжелой цепи второго антитела или антигенсвязывающего фрагмента (например, моноклонального антитела или фрагмента), состоит по сути из или состоит из аминокислотной последовательности вариабельной области под SEQ ID NO: 15 или содержит ее, и/или полипептид легкой цепи второго моноклонального антитела состоит по сути из или состоит из аминокислотной последовательности вариабельной области под SEQ ID NO: 16 или содержит ее.
[66] Последовательности типичных антител к ClfA и к AT предусмотрены ниже. В определенных случаях описанное в данном документе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с ClfA и/или AT и содержит шесть CDR антитела, перечисленных в двух таблицах ниже (т.е. три CDR VH антитела, перечисленных в первой таблице, и три CDR VL одного и того же антитела, перечисленных во второй таблице). Антитело к AT MEDI4893 представляет собой версию "LC10" с увеличенным временем полужизни (YTE), описанную ранее в публикациях международных патентных заявок WO 2012/109285 и WO 2014/074540 (оба из которых включены в данный документ посредством ссылки во всей своей полноте). MEDI4893* не содержит мутацию YTE.
Аминокислотные последовательности CDR VH
(SEQ ID NO:)
(SEQ ID NO:)
(SEQ ID NO:)
(SEQ ID NO: 1).
(SEQ ID NO: 2).
(SEQ ID NO: 7)
(SEQ ID NO: 8)
(SEQ ID NO: 9)
Аминокислотные последовательности CDR VL
(SEQ ID NO:)
(SEQ ID NO:)
(SEQ ID NO:)
(SEQ ID NO: 4)
(SEQ ID NO: 10)
(SEQ ID NO: 11)
(SEQ ID NO: 12)
[67] В определенных случаях описанное в данном документе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с ClfA и/или AT и содержит VH антитела, перечисленного в следующей таблице, например, в комбинации с VL.
Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH)
[68] В определенных случаях описанное в данном документе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с ClfA и/или AT и содержит VL антитела, перечисленного в следующей таблице, например, в комбинации с VH, необязательно VH того же указанного антитела, перечисленного в предыдущей таблице.
Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VL)
[69] В определенных случаях описанное в данном документе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с ClfA и/или AT и содержит тяжелую цепь антитела, перечисленного в следующей таблице, например, в комбинации с легкой цепью.
Аминокислотные последовательности полноразмерной тяжелой цепи
[70] В определенных случаях описанное в данном документе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с ClfA и/или AT и содержит легкую цепь антитела, перечисленного в следующей таблице, например, в комбинации с тяжелой цепью, необязательно с тяжелой цепью того же антитела, указанного в предыдущей таблице.
Аминокислотные последовательности полноразмерной легкой цепи
[71] В определенных аспектах CDR антитела или его антигенсвязывающего фрагмента могут быть определены в соответствии со схемой нумерации по Chothia, которая относится к местоположению структурных петель иммуноглобулина (см., например, Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; Al-Lazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al., (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82; и патент США №7709226). Как правило, при использовании соглашения нумерации по Kabat петля по Chothia CDR-H1 присутствует на аминокислотах тяжелой цепи в положениях с 26 по 32, 33 или 34, петля по Chothia CDR-H2 присутствует на аминокислотах тяжелой цепи в положениях с 52 по 56, и петля по Chothia CDR-H3 присутствует на аминокислотах тяжелой цепи в положениях с 95 по 102, тогда как петля по Chothia CDR-L1 присутствует на аминокислотах легкой цепи в положениях с 24 по 34, петля по Chothia CDR-L2 присутствует на аминокислотах легкой цепи в положениях с 50 по 56 и петля по Chothia CDR-L3 присутствует на аминокислотах легкой цепи в положениях с 89 по 97. Конец петли CDR-H1 по Chothia при нумерации с использованием правил нумерации по Kabat варьирует от H32 до H34 в зависимости от длины петли (это обусловлено тем, что в соответствии со схемой нумерации по Kabat вставки расположены в H35A и H35B; при этом если не присутствуют ни 35A, ни 35B, то петля заканчивается на 32; если присутствует только 35A, то петля заканчивается на 33; если присутствуют как 35A, так и 35B, то петля заканчивается на 34).
[72] В определенных аспектах в данном документе предусмотрены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат CDR VH и VL по Chothia антител SAR114 и/или MEDI4893*. В определенных вариантах осуществления антитела или их антигенсвязывающие фрагменты содержат одну или несколько CDR, в которых CDR по Chothia и Kabat имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В определенных вариантах осуществления, в данном документе предусмотрены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат комбинации CDR по Kabat и CDR по Chothia.
[73] В определенных случаях CDR антитела или его антигенсвязывающего фрагмента могут быть определены в соответствии с системой нумерации IMGT, как описано в Lefranc MP, (1999) The Immunologist 7: 132-136 and Lefranc M-P et al., (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212. В соответствии со схемой нумерации IMGT VH-CDR1 находится в положениях 26-35, VH-CDR2 находится в положениях 51-57, VH-CDR3 находится в положениях 93-102, VL-CDR1 находится в положениях 27-32, VL-CDR2 находится в положениях 50-52 и VL-CDR3 находится в положениях 89-97. В конкретном варианте осуществления, в данном документе предусмотрены антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат CDR VH и VL согласно IMGT антител SAR114 и/или MEDI4893*, например, как описано в Lefranc M-P (1999) выше and Lefranc M-P et al., (1999) выше).
[74] В определенных случаях CDR антитела или его антигенсвязывающего фрагмента могут быть определены согласно с MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol 262: 732-745. См. также, например, Martin A. "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," in Antibody Engineering, Kontermann and Dübel, eds., Chapter 31, pp.422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001). В конкретном варианте осуществления в данном документе предусмотрены антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, содержащие CDR VH и VL антител SAR114 и/или MEDI4893*, определенные способом, описанным в MacCallum RM et al.
[75] В определенных случаях CDR антитела или его антигенсвязывающего фрагмента могут быть определены в соответствии со схемой нумерации AbM, которая относится к гипервариабельным областям AbM, которые представляют собой компромисс между CDR по Kabat и структурными петлями по Chothia, и используются в программном обеспечении для моделирования антител AbM от Oxford Molecular (Oxford Molecular Group, Inc.). В конкретном варианте осуществления в данном документе предусмотрены антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые содержат CDR VH и VL антител SAR114 и/или MEDI4893*, как определено в соответствии со схемой нумерации AbM.
[76] В другом варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, моноклональное антитело или фрагмент), описанные в данном документе, могут содержать константную область (Fc) любого подходящего класса (IgG, IgA, IgD, IgM и IgE), которая была модифицирована для улучшения эффекторных функций (например, опсонофагоцитарного уничтожения бактерий (OPK)) или времени полужизни первого и/или второго антитела или антигенсвязывающего фрагмента, (например, моноклонального антитела или фрагмента), присутствующих в композиции. Например, описанное в данном документе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, моноклональное антитело или фрагмент) может содержать Fc, которая содержит мутацию, которая продлевает время полужизни по сравнению с таким же антителом без мутации, и где мутация не ингибирует активность OPK по сравнению с таким же антителом или антигенсвязывающим фрагментом без мутации. Конструирование области Fc широко используется в данной области техники для увеличения времени полужизни терапевтических антител и защиты от разрушения in vivo. В некоторых вариантах осуществления Fc-область антитела IgG или антигенсвязывающего фрагмента может быть модифицирована для увеличения аффинности молекулы IgG к неонатальному Fc-рецептору (FcRn), который опосредует катаболизм IgG и защищает молекулы IgG от разрушения. Fc-область любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов (например, моноклональных антител или фрагментов), описанных в данном документе, может содержать одну или несколько аминокислотных замен или модификаций, которые улучшают или продлевают время полужизни антитела или эффекторную функцию, например, путем увеличения аффинности молекулы IgG к FcRn. Подходящие аминокислотные замены или модификации Fc-области известны в данной области техники и включают, например, тройную замену M252Y/S254T/T256E (обозначаемую как "YTE") (см., например патент США 7658921; публикацию заявки на патент США 2014/0302058; и Yu et al., Antimicrob. Agents Chemother., 61(1): e01020-16 (2017)). В другом варианте осуществления Fc-область может быть получена из высокоаффинного FcRn-связывающего Fc-варианта N3E-YTE (см., например Borrok et al., J. Biol. Chem., 290(7): 4282-4290 (2015)), который содержит мутацию YTE в CH2 и остатки цистеина в положениях 432 и 437. Например, вариант N3E-YTE может не содержать мутации YTE (обозначаемую как "N3E") или может быть замещен в Fc-остатке 432 (с использованием нумерации по Kabat), например, последовательностью CSWHLC (обозначаемую как "N3"; SEQ ID NO: 19), CSFHLC (обозначаемую как "N3F"; SEQ ID NO: 20) или CSYHLC (обозначаемую как "N3Y"; SEQ ID NO: 21). Fc-варианты N3, N3F и N3Y, в частности, проявляют улучшенные фармакокинетические (PK) свойства (например, персистентность в сыворотке крови) и эффекторные функции (например, опсонофагоцитарное уничтожение бактерий (OPK)) по сравнению с вариантами YTE.
[77] Последовательности примерных Fc-вариантов представлены ниже.
(также называемая как N3W)
[78] Настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с ClfA (например, антитела и антигенсвязывающие фрагменты, содержащие последовательности CDR, VH и/или VL, тяжелой и/или легкой цепей, или Fc-вариантов, перечисленных в таблицах выше) и имеют IC50 для ClfA001, ClfA002 и ClfA004 в анализе ингибирования связывания с фибриногеном, которые находятся в пределах 2 мкг/мл друг от друга. Например, IC50 антитела или его антигенсвязывающего фрагмента для ClfA001, ClfA002 и ClfA004 все могут находиться в диапазоне от 1 мкг/мл до 5 мкг/мл. Значения фффинности связывания (KD) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента для ClfA001, ClfA002 и ClfA004 все могут находиться в диапазоне от 200 до 350 пМ.
[79] Настоящее изобретение предусматривает антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с ClfA (например, антитела и антигенсвязывающие фрагменты, содержащие последовательности CDR, VH и/или VL, тяжелой и/или легкой цепей, либо Fc-вариантов, перечисленных в таблицах выше) и имеют чистоту мономера, которая снижается не более чем на 5% после воздействия типичным белым светом при 2 клк/ч. при 23°C в течение 14 дней.
[80] Настоящее изобретение не ограничивается композицией, содержащей как ClfA-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, так и АТ-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше. Действительно, настоящее изобретение также отдельно предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, моноклональное антитело или фрагмент), содержащие: (а) полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность CDR1 под SEQ ID NO: 1, аминокислотную последовательность CDR2 под SEQ ID NO: 2 и аминокислотную последовательность CDR3 под SEQ ID NO: 3, и (b) полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность CDR1 под SEQ ID NO: 4, аминокислотную последовательность CDR2 под SEQ ID NO: 5 и аминокислотную последовательность CDR3 под SEQ ID NO: 6.
[81] Избретение также предусматривает биспецифическое антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который связывает (например, одновременно) как ClfA, так и AT. Термин "биспецифическое моноклональное антитело" (также называемое моноклональным антителом с "двойной специфичностью") относится к моноклональному антителу, которое содержит два разных домена распознавания антигена и, следовательно, может одновременно связывать два разных эпитопа. Моноклональные антитела, которые распознают и связывают более чем два различных эпитопа, в данной области называют "мультиспецифическими моноклональными антителами". Первые биспецифические антитела были получены путем соматической гибридизации двух секретирующих антитела клеток, но дали низкий выход из-за случайной сборки исходных тяжелых и легких цепей (Milstein, C. и AC. Cuello, Immunol. Today, 5: 299-304, 1984). Открытие одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv) и достижения в области инженерии антител привели к новым методологиям разработки биспецифических антител (Orcutt et al., Protein Eng. Des. Sel., 23: 221-228 (2010); and Coloma, M.J. and S.L. Morrison, Nat. Biotechnol., 15: 159-163 (1997)). В настоящее время существует по меньшей мере 50 различных форматов биспецифических антител, основанных на количестве scFv и положениях слияния на каркасе IgG (Kontermann, R.E., MAbs, 4: 182-197 (2012)). Биспецифические и мультиспецифические антитела могут быть изготовлены в нескольких различных структурных форматах, включая без ограничения, тандемные scFv, диатела, тандемные диатела, антитела с двумя вариабельными доменами и гетеродимеризацию с использованием такого мотива, как домен CH1/Ck или мотива "замок на причале" (см., например Chames, P. and D. Baty, Curr. Opin. Drug. Discov. Devel., 12: 276-283 (2009)). В одном варианте осуществления, изобретение предусматривает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (например, моноклональное антитело или фрагмент), которое специфически связывается с белком ClfA Staphylococcus aureus и белком альфа-токсина (AT) Staphylococcus aureus (т.е. биспецифическим антителом), которое содержит: (а) первый полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность CDR1 под SEQ ID NO: 1, аминокислотную последовательность CDR2 под SEQ ID NO: 2 и аминокислотную последовательность CDR3 под SEQ ID NO: 3, и (b) первый полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность CDR1 под SEQ ID NO: 4, аминокислотную последовательность CDR2 под SEQ ID NO: 5 и аминокислотную последовательность CDR3 под SEQ ID NO: 6, (c) второй полипептид тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность CDR1 под SEQ ID NO: 7, аминокислотную последовательность CDR2 под SEQ ID NO: 8 и аминокислотную последовательность CDR3 под SEQ ID NO: 9, и (d) второй полипептид легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность CDR1 под SEQ ID NO: 10, аминокислотную последовательность CDR2 под SEQ ID NO: 11 и аминокислотную последовательность CDR3 под SEQ ID NO: 12. В другом варианте осуществления первый полипептид тяжелой цепи и первый полипептид легкой цепи вышеупомянутого биспецифического антитела или его антигенсвязывающего фрагмента (например, моноклонального антитела или фрагмента) содержат аминокислотные последовательности вариабельной области под SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14 соответственно, и полипептид второй тяжелой цепи и полипептид второй легкой цепи вышеупомянутого биспецифического антитела или его антигенсвязывающего фрагмента (например, моноклонального антитела или фрагмента) содержат аминокислотные последовательности вариабельной области под SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 соответственно. Такие биспецифические (необязательно моноклональные) антитела (антитела, содержащие последовательности SAR114 и MEDI4893 или MEDI4893*) могут иметь пониженную активность нейтрализации AT по сравнению с активностью нейтрализации AT MEDI4893 или MEDI4893*, например, в результате сильного связывания SAR114 с ClfA. Это отличается от других биспецифических (необязательно моноклональных) антител, которые связываются с белками ClfA и AT Staphylococcus aureus (например, антителами, содержащими последовательности 11H10 и MEDI4893 или MEDI4893*), которые не обладают значительно сниженной активностью нейтрализации AT по сравнению с активностью нейтрализации AT MEDI4893 или MEDI4893*. Способы получения биспецифических или мультиспецифических (необязательно моноклональных) антител известны в данной области техники и описаны, например, Holliger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90(14): 6444-6448 (1993); Brinkmann, U. and R.E. Kontermann, MAbs, 9(2): 182-212 (2017); and Segal, D. M. and Bast, B. J. 2001. Production of Bispecific Antibodies. Current Protocols in Immunology. 14:IV:2.13:2.13.1-2.13.16)
[82] Антитело или антигенсвязывающий фрагмент (например, моноклональное антитело или фрагмент), описанные в данном документе, могут представлять собой человеческое антитело, гуманизированное антитело, антитело, отличное от человеческого или химерное антитело или могут быть получены из них. "Химерное" антитело относится к антителу или его фрагменту, содержащему как человеческие области, так и области, отличные от человеческих. "Гуманизированное" антитело представляет собой антитело, содержащее каркас человеческого антитела и по меньшей мере одну CDR, полученную из антитела, отличного от человеческого, или произошедшую из него. Антитела, отличные от человеческих включают антитела, выделенные у любого животного, не являющегося человеком, такого как, например, грызун (например, мышь или крыса). Гуманизированное антитело может содержать одну, две или три CDR, полученных из антитела, отличного от человеческого, или произошедших из него. Полностью человеческое антитело не содержит аминокислотных остатков, полученных от животного, не являющегося человеком, или произошедших из него. Следует принимать во внимание, что полностью человеческие и гуманизированное антитела несут меньший риск индуцирования иммунных ответов у людей, чем мышиные или химерные антитела (см., например Harding et al., mAbs, 2(3): 256-26, 2010). В одном варианте осуществления, описанное в данном документе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент являются полностью человеческим антителом.
[83] Человеческое антитело, антитело, отличное от человеческого, химерное антитело или гуманизированное антитело можно получить любыми способами, в том числе через источники in vitro (например, гибридому или клеточную линию, продуцирующую антитело рекомбинантно) и источники in vivo (например, грызуны, миндалины человека). Способы получения антител известны в данной области техники и описаны, например, в Köhler and Milstein, Eur. J. Immunol., 5: 511-519 (1976); Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988); and Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 5th Ed., Garland Publishing, New York, N.Y. (2001)). В определенных вариантах осуществления человеческое антитело или химерное антитело можно получить с использованием трансгенного животного (например, мыши), в котором один или несколько генов эндогенного иммуноглобулина заменены одним или несколькими генами человеческого иммуноглобулина. Примеры трансгенных мышей, у которых гены эндогенных антител эффективно заменены генами человеческих антител, включают без ограничения, Medarex HUMAB-MOUSE™, Kirin TC MOUSE(и Kyowa Kirin KM-MOUSE((см., например Lonberg, Nat. Biotechnol., 23(9): 1117-25 (2005), and Lonberg, Handb. Exp.Pharmacol., 181: 69-97, 2008). Гуманизированное антитело может быть получено с использованием любого подходящего метода, известного в данной области техники (см., например An, Z. (ed.), Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, N.J. (2009)), включая, например, пересадку CDR, отличных от человеческих, на каркас человеческого антитела (см., например Kashmiri et al., Methods, 36(1): 25-34 (2005); and Hou et al., J. Biochem., 144(1): 115-120 (2008)). В одном варианте осуществления гуманизированное антитело можно получить с использованием способов, описанных, например, в публикации заявки на патент США 2011/0287485 A1.
[84] Настоящее изобретение также предусматриваетодну или несколько выделенных последовательностей нуклеиновых кислот, которые кодируют ClfA-связывающее антитело, AT-связывающее антитело или антитело, которое связывает как ClfA, так и AT, как описано в данном документе, или их антигенсвязывающий фрагмент (необязательно, где антитело или фрагмент являются моноклональными). Термин "последовательность нуклеиновой кислоты" предназначен для охвата полимера ДНК или РНК, т.е. полинуклеотида, который может быть одноцепочным или двухцепочным, и который может содержать неприродные или измененные нуклеотиды. Термины "нуклеиновая кислота" и "полинуклеотид", которые описаны в данном документе, относятся к полимерной форме нуклеотидов любой длины, будь то рибонуклеотиды (РНК) или дезоксирибонуклеотиды (ДНК). Эти термины относятся к первичной структуре молекулы и, таким образом, включают двух- и одноцепочную ДНК, а также двух- и одноцепочную РНК. В качестве эквивалентов термины включают аналоги РНК или ДНК, полученные из аналогов нуклеотидов и модифицированных полинуклеотидов, таких как без ограничения метилированные и/или кэпированные полинуклеотиды. Нуклеиновые кислоты, как правило, связаны через фосфатные связи с образованием последовательностей нуклеиновых кислот или полинуклеотидов, хотя известны многие другие связи в данной области техники (например, фосфоротиоаты, боранофосфаты и т.п.).
[85] Настоящее изобретение дополнительно предусматриваетодин или несколько векторов, содержащих одну или несколько последовательностей нуклеиновых кислот, кодирующих ClfA-связывающее антитело, AT-связывающее антитело или антитело, которое связывает как ClfA, так и с AT, как описано в данном документе, или их антигенсвязывающий фрагмент (необязательно где антитело или фрагмент являются моноклональными). Вектор может быть, например, плазмидой, эписомой, космидой, вирусным вектором (например, ретровирусным или аденовирусным) или фагом. Подходящие векторы и способы получения векторов хорошо известны в данной области техники (см., например Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001), and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994)).
[86] В дополнение к последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей ClfA-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, AT-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, или антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который связывает как ClfA, так и с AT, как описано в данном документе (необязательно, где антитело или фрагмент являются моноклональными), вектор желательно содержит последовательности контроля экспрессии, такие как промоторы, энхансеры, сигналы полиаденилирования, терминаторы транскрипции, внутренние участки посадки рибосомы (IRES) и т.п., которые обеспечивают экспрессию кодирующей последовательности в клетке-хозяине. Примеры последовательностей контроля экспрессии известны в данной области техники и описаны, например, в Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol.185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990).
[87] Вектор(-ы), содержащий(-е) нуклеиновую кислоту(-ы), кодирующую(-ие) аминокислотную(-ые) последовательность(-и) антител или антигенсвязывающих фрагментов, описанных в данном документе, (например, аминокислотную последовательность, кодирующую тяжелую цепь и/или легкую цепь ClfA-связывающего антитела) (необязательно моноклональное антитело или фрагмент) можно ввести в клетку-хозяина, которая способна экспрессировать кодируемые им полипептиды, включая любую подходящую прокариотическую или эукариотическую клетку. Таким образом, настоящее изобретение предусматривает изолированную клетку, содержащую вектор. Клетки-хозяева, которые можно использовать, включают клетки, которые можно легко и надежно выращивать, имеют достаточно высокие темпы роста, хорошо охарактеризованные системы экспрессии и могут быть легко и эффективно трансформированы или трансфицированы. Примеры подходящих прокариотических клеток включают без ограничения клетки из родов Bacillus (таких как Bacillus subtilis и Bacillus brevis), Escherichia (таких как E.coli), Pseudomonas, Streptomyces, Salmonella и Erwinia. Особенно полезные прокариотические клетки включают различные штаммы Escherichia coli (например, K12, HB101 (ATCC №33694), DH5a, DH10, MC1061 (ATCC №53338) и CC102). Подходящие эукариотические клетки известны в данной области техники и включают, например, дрожжевые клетки, клетки насекомых и клетки млекопитающих. В одном варианте осуществления вектор экспрессируется в клетках млекопитающих. Ряд подходящих клеток-хозяев млекопитающих известен в данной области техники, и многие из них доступны в Американской коллекции типовых культур (ATCC, Манассас, Виргиния). Примеры подходящих клеток млекопитающих включают без ограничения клетки яичника китайского хомячка (СНО) (АТСС №CCL61), СНО DHFR-клетки (Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97: 4216-4220 (1980)), эмбриональные клетки почки человека (HEK) 293 или 293T (ATCC №CRL1573) и клетки 3T3 (ATCC №CCL92). Другими подходящими клеточными линиями млекопитающих являются клеточные линии COS-1 обезьяны (ATCC №CRL1650) и COS-7 (ATCC №CRL1651), а также линия клеток CV-1 (ATCC №CCL70). Желательно, чтобы клетка млекопитающего была клеткой человека. Например, клетка млекопитающего может быть лимфоидной клеткой человека или лимфоидной клеткой, полученной из клеточной линии, такой как линия клеток пре-В-лимфоцитов, линия клеток PER.C6((Crucell Holland BV, Нидерланды) или эмбриональные клетки почки человека (HEK) 293 или 293T (ATCC №CRL1573).
[88] Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая аминокислоты любого из антител или антигенсвязывающих фрагментов (необязательно моноклональных антител или фрагментов), описанных в данном документе, может быть введена в клетку посредством "трансфекции", "трансформации" или "трансдукции". Термины "трансфекция", "трансформация" или "трансдукция", используемые в данном документе, относятся к введению одного или нескольких экзогенных полинуклеотидов в клетку-хозяина с использованием физических или химических методов. Многие методы трансфекции известны в данной области техники и включают, например, совместное осаждение ДНК фосфатом кальция (см., например Murray E.J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol.7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)); DEAE-декстраном; электропорацию; катионную трансфекцию, опосредованную липосомами; бомбардировку микрочастицами с помощью частиц вольфрама (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); и совместное осаждение ДНК фосфатом стронция (Brash et al, Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)). Фаговые или вирусные векторы могут быть введены в клетки-хозяева после роста инфекционных частиц в подходящих упаковывающих клетках, многие из которых являются коммерчески доступными.
[89] В настоящем избретении предусмотрена композиция, содержащая эффективное количество любого из антител или их антигенсвязывающих фрагментов или их комбинации, описанных в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В одном варианте осуществления, например, композиция может содержать первое антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (необязательно моноклональный), который специфически связывается с белком ClfA S. aureus, как описано выше, и второе антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (необязательно моноклональный), который специфически связывается с белком AT S. aureus, как описано выше, и фармацевтически приемлемый носитель. В качестве альтернативы, композиция может содержать либо антитело, либо его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с белком ClfA S. aureus, либо антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком S. aureus AT, и фармацевтически приемлемый носитель. В еще одном варианте осуществления композиция может содержать последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие ClfA-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, AT-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, и/или биспецифическое антитело к ClfA/AT или антигенсвязывающий фрагмент, или один или несколько векторов, содержащих такие последовательности нуклеиновой кислоты. В одном варианте осуществления композиция представляет собой фармацевтически приемлемую (например, физиологически приемлемую) композицию, которая содержит носитель, такой как фармацевтически приемлемый (например, физиологически приемлемый) носитель, и ClfA-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, AT-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, биспецифическое антитело к ClfA/AT или антигенсвязывающий фрагмент, последовательность(-и) нуклеиновой кислоты или вектор(-ы). В контексте изобретения можно использовать любой подходящий носитель, и такие носители хорошо известны в данной области техники. Выбор носителя будет частично определен конкретным местом, куда можно вводить композицию, и конкретным способом, применяемым для введения композиции. Композиция необязательно может быть стерильной. Композиция может быть заморожена или лиофилизована для хранения и восстановленав подходящем стерильном носителе перед использованием. Композиции могут быть получены в соответствии с традиционными методиками, описанными, например, в Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA (2001).
[90] Желательно, чтобы композиция содержала ClfA-связывающее антитело и/или AT-связывающее антитело, и/или биспецифическое антитело к ClfA/AT, или его антигенсвязывающие фрагменты (например, моноклональное антитело или фрагмент) в количестве, которое эффективно для лечения или предотвращения инфекции, вызываемой S. aureus. Таким образом, изобретение предусматривает способ лечения или предупреждения инфекции, вызываемой Staphylococcus aureus (S. aureus), у субъекта (например, человека), который включает введение композиции, содержащей любое из антител или их антигенсвязывающих фрагментов (например, моноклональные антитела или фрагменты), описанных в данном документе, или их комбинацию, субъекту, нуждающемуся в этом, после чего осуществляется лечение или предупреждение инфекции, вызываемой S. aureus, у субъекта. Настоящее изобретение также предусматривает использование ClfA-связывающего антитела или антигенсвязывающего фрагмента, AT-связывающего антитела или антигенсвязывающего фрагмента, и/или биспецифического антитела к ClfA/AT или антигенсвязывающего фрагмента, описанных в данном документе, или композиции, содержащей любое из антител или их фрагментов, описанных в данном документе, или их комбинацию, при производстве лекарственного средства для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой S. aureus. Как описано в данном документе, Staphylococcus aureus является основным патогеном человека, вызывающим широкий спектр клинических инфекций. S. aureus является основной причиной бактериемии и инфекционного эндокардита, а также костно-суставных, кожных инфекций и инфекций мягких тканей, плевропульмональных инфекций и инфекций, вызванных медицинским изделием в организме. Примерно 30% человеческой популяции колонизированы S. aureus (Wertheim et al., Lancet Infect. Dis., 5: 751-762 (2005)). Симптомы кожных инфекций, вызванных S. aureus, включают, например, фурункулы, воспаление тканей и импетиго. S. aureus также может вызывать пищевое отравление, заражение крови (также известное как бактериемия), синдром токсического шока и септический артрит. Эпидемиология, патофизиология и клинические проявления инфекций, вызываемых S. aureus, подробно описаны, например, в Tong et al., Clin. Microbiol. Rev., 28(3): 603-661 (2015), и были секвенированы геномы нескольких различных штаммов S. aureus (см., например GenBank/EMBL Accession №№BX571856, BX571857, BX571858, FN433596, FN433597, FN433598, HE681097, FR821777, FR821778, FR821779 и FR821780). Как обсуждается в данном документе, субъект (например, человек) может иметь диабет.
[91] Применяемые в данном документе термины "лечение", "осуществление лечения" и т.п. относятся к получению необходимого фармакологического и/или физиологического эффекта. В одном варианте осуществления эффект является терапевтическим, т.е. эффект обеспечивает частичное или полное излечение заболевания и/или неблагоприятного симптома, относящегося к заболеванию. С этой целью раскрытый способ включает введение "терапевтически эффективного количества" ClfA-связывающего антитела, AT-связывающего антитела и/или биспецифического антитела к ClfA/AT или их антигенсвязывающих фрагментов, или композиции, включающей любое из вышеуказанных антител или фрагментов (включая моноклональные антитела или фрагменты) или их комбинацию. "Терапевтически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения необходимого терапевтического результата. Терапевтически эффективное количество может варьироваться в соответствии с такими факторами, как состояние заболевания, возраст, пол и вес индивидуума и способность антитела или антигенсвязывающего фрагмента вызывать необходимый ответ у индивидуума. Например, терапевтически эффективное количество ClfA-связывающего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, AT-связывающего антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, или биспецифического антитела к ClfA/AT или его антигенсвязывающего фрагмента представляет собой количество, которого достаточно для ингибирования сепсиса, связанного со S. aureus, ингибирования агглютинации S. aureus, ингибирования образования тромбоэмболических поражений, нейтрализации альфа-токсина, индуцирования опсонофагоцитоза, ингибирования связывания фибриногена со S. aureus, ингибирования агглютинации S. aureus или любой комбинации вышеперечисленного у человека.
[92] В качестве альтернативы, фармакологический и/или физиологический эффект может быть профилактическим, т.е. эффект обеспечивает полное или частичное предотвращение заболевания или его симптома. В данном отношении раскрытый способ включает введение "профилактически эффективного количества" ClfA-связывающего антитела, AT-связывающего антитела и/или биспецифического антитела к ClfA/AT или их антигенсвязывающих фрагментов (включая моноклональные антитела или фрагменты). "Профилактически эффективное количество" относится к количеству, эффективному в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения необходимого профилактического результата (например, предотвращения инфекции, вызываемой S. aureus, или начала заболевания).
[93] Терапевтическую или профилактическую эффективность можно контролировать путем периодической оценки пациентов, получающих лечение. При повторных введениях в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение можно повторять до тех пор, пока не произойдет желаемое подавление симптомов заболевания. Однако могут быть полезны и другие режимы дозирования, которые входят в объем настоящего изобретения. Необходимая доза может быть доставлена посредствомоднократного болюсного введения композиции, многократного болюсного введения композиции или непрерывного инфузионного введения композиции.
[94] Способ лечения или предупреждения инфекции, вызываемой S. aureus, может включать введение ClfA-связывающего антитела, описанного в данном документе, связывания AT, описанного в данном документе, как ClfA-связывающих, так и AT-связывающих антител, описанных в данном документе, или описанного в данном документе биспецифического антитела к ClfA-AT, или его антигенсвязывающих фрагментов. В вариантах осуществления, где субъекту вводят как ClfA-связывающие, так и AT-связывающие антитела или фрагменты (например, моноклональные антитела или фрагменты), каждое антитело или фрагмент могут присутствовать в той же композиции или в отдельных композициях. Когда субъекту вводят отдельные композиции, каждую из композиций можно вводить одновременно или последовательно в любом порядке.
[95] Композиция(-и), содержащая(-ие) эффективное количество любого из антител, описанных в данном документе, или их комбинации, или их антигенсвязывающих фрагментов, последовательность(-и) нуклеиновой кислоты, кодирующей любое из вышеперечисленных, или вектор, содержащий последовательность нуклеиновой кислоты, может(-гут) быть введена(-ны) субъекту, такому как человек, с использованием стандартных методик введения, включая внутривенный, внутрибрюшинный, подкожный и внутримышечный пути введения. Композиция может подходить для парентерального введения. Используемый в данном документе термин "парентеральный" включает внутривенное, внутримышечное, подкожное и внутрибрюшинное введение. В некоторых вариантах осуществления композицию вводят субъекту с использованием периферической системной доставки путем внутривенной, внутрибрюшинной или подкожной инъекции.
[96] ClfA-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, AT-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, и/или биспецифическое антитело к ClfA/AT или антигенсвязывающий фрагмент, или композиция(ии), содержащая(-ие) их, может(-гут) быть введена(-ны) отдельно или в комбинации с другими лекарственными средствами (например, в качестве адъюванта), обычно используемыми для лечения инфекций, вызванных S. aureus. Композиция(ии), содержащая(-ие) ClfA-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, AT-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, или биспецифическое антитело к ClfA-AT или антигенсвязывающий фрагмент, может(-гут) использоваться в комбинации, например, с одним или несколькими антибиотиками, такими как устойчивый к пенициллиназе β-лактамный антибиотик (например, оксациллин или флуклоксациллин). Гентамицин можно использовать для лечения серьезных инфекций, таких как эндокардит.Однако большинство штаммов S. aureus в настоящее время устойчивы к пенициллину, и двое из 100 человек являются носителями устойчивых к метициллину штаммов S. aureus (MRSA). Инфекции, вызываемые MRSA, как правило, лечат ванкомицином, а незначительные кожные инфекции можно лечить мазью с тройным антибиотиком.
[97] В дополнение к терапевтическим применениям, любое из антител, описанных в данном документе, или их комбинацию можно использовать в диагностических или исследовательских целях. В данном отношении ClfA-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, AT-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, или биспецифическое антитело к ClfA-AT или антигенсвязывающий фрагмент можно использовать в анализе для отслеживания инфекции, вызываемой S. aureus, у субъекта. Приложения для исследований включают, например, способы, в которых используется ClfA-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, AT-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, или биспецифическое антитело к ClfA-AT или антигенсвязывающий фрагмент и метку для обнаружения S. aureus в образце, например, в жидкости человеческого тела или в клеточном или тканевом экстракте. ClfA-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, AT-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, или биспецифическое антитело к ClfA-AT или антигенсвязывающий фрагмент можно использовать с модификацией или без нее, такой как ковалентное или нековалентное мечение с детектируемым фрагментом. Например, определяемый фрагмент может быть радиоизотопом (например, 3H, 14C, 32P, 35S, или 125I), флуоресцентным или хемилюминесцентным соединением (например, флуоресцеинизотиоцианат, родамин или люциферин), ферментом (например, щелочной фосфатазой, бета-галактозидазой или пероксидазой хрена) или простетическими группами. Любой метод, известный в данной области техники для раздельного конъюгирования антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с детектируемым фрагментом, может использоваться в контексте настоящего изобретения (см., например Hunter et al., Nature, 194: 495-496 (1962); David et al., Biochemistry, 13: 1014-1021 (1974); Pain et al., J. Immunol. Meth., 40: 219-230 (1981); and Nygren, J., Histochem. And Cytochem., 30: 407-412 (1982)).
[98] Любое из антител, описанных в данном документе, или их комбинация, или их антигенсвязывающих фрагментов (например, моноклональных антител или фрагментов), последовательность(-и) нуклеиновой кислоты, кодирующей любое из вышеперечисленных, вектор(-ы), содержащий(-ие) последовательность(-и) нуклеиновой кислоты, или композиция(ии), содержащая(-ие) любое из вышеперечисленных, может(-гут) быть предоставлен(-о) в виде набора, то есть упакованной комбинации реагентов в заранее определенных количествах с инструкциями по выполнению диагностического анализа. Если ClfA-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, AT-связывающее антитело или антигенсвязывающий фрагмент, или биспецифическое антитело к ClfA-AT или антигенсвязывающий фрагмент мечены ферментом, желательно, чтобы набор содержал субстраты и кофакторы, необходимые для фермента (например, предшественник субстрата, который обеспечивает детектируемый хромофор или флуорофор). В дополнение, в набор могут быть включены другие добавки, такие как стабилизаторы, буферы (например, блокирующий буфер или буфер для лизиса) и т.п.Относительные количества различных реагентов могут варьироваться для обеспечения концентраций реагентов в растворе, которые существенно оптимизируют чувствительность анализа. Реагенты могут быть представлены в виде сухих порошков (как правило лиофилизированных), включая вспомогательные вещества, которые при растворении будут предоставлять раствор реагента соответствующей концентрации.
[99] Следующие примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение, но, разумеется, их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие его объем.
ПРИМЕР 1
[100] В данном примере демонстрируется отбор и определение характеристик моноклонального антитела, которое специфически связывается с белком ClfA S. aureus.
[101] Ранее сообщали о повышенной протективной способности и расширенном охвате изолятов, достигнутых в модели бактериемии S. aureus с летальным исходом за счет профилактического применения моноклонального антитела (mAb) к альфа-токсину (AT) S. aureus (обозначаемого как "MEDI4893*", описанного в публикациях международных патентных заявок WO 2012/109285 и WO 2014/074540 под обозначением "LC10") в комбинации с mAb к ClfA (называемым как "11H10"), по сравнению с применением отдельных mAb (Tkaczyk et al., MBio., 7(3). pii: e00528-16 (2016)). (обратите внимание, что MEDI4893, который содержит мутацию YTE, отсутствующую в MEDI4893*, не использовался на мышах, поскольку хотя мутация YTE и увеличивает период полужизни IgG у людей, она снижает концентрацию антитела в плазме крови у мышей.) Хотя 11H10 продемонстрировало высокую активность по отношению к ClfA, оно проявляло более чем 1000-кратное снижение аффинности (Kon была ниже предела обнаружения, ND в таблице 1) и примерно 40-кратное увеличение IC50 по отношению к последовательности-фаундеру ClfA002 ClfA в анализе ингибирования связывания фибриногена относительно других последовательностей-основателей ClfA ClfA001 и ClfA004, что показано на фигуре 1A и в таблице 1. ClfA002 экспрессируется клинически значимым внутрибольничным метициллин-устойчивым S. aureus (HA-MRSA; USA100 или последовательность типа 5 (ST5)) (Sharma-Kuinkel et al., J. Clin. Microbiol., 53: 227-236 (2015) и Mendes et al., J. Clin. Microbiol., 50: 3694-3702 (2012)).
Таблица 1. MAb к ClfA: корреляция между аффинностью и активностью in vitro
(M-1 с-1)
Koff (с-1)
IC50 (мкг/мл)
[102] Для увеличения потенциального охвата клинических изолятов библиотеку В-клеток из миндалин человека скринировали для поиска реактивных mAb к ClfA с более широким спектром активности. В частности, В-клетки памяти выделяли из криоконсервированных лимфоцитов, выделенных из миндалин, с использованием микрогранул CD19, меченных фикоэритрином (РЕ)-Cy7 (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния), с последующим окрашиванием связывающимися с PE гранулами (Miltenyi Biotec, Inc., Сан-Хосе, Калифорния) и истощением клеток, несущих IgM, IgD и IgA, посредством FACSAria-сортировки клеток (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния). Клетки иммортализировали в клональных условиях вирусом Эпштейна-Барра (EBV) так, как это описано в Traggiai et al., Nat. Med., 10: 871-875 (2004). Через две недели культуральные супернатанты проверяли на присутствие ClfA001-специфических моноклональных антител с использованием 384-луночного анализа ELISA. Если вкратце, то серийные разведения (1:2 или 1:600) mAb к ClfA добавляли в планшеты, покрытые ClfA, с последующим добавлением биотинилированного 11H10 (1:600). Процент конкуренции рассчитывали как 100*(ODmAb+11H10biot) / (OD11H10biot)). Положительные культуры выращивали в полной среде RPMI и отбирали по их способности связываться с генотипами ClfA 001, 002 и 004 с высокой аффинностью. Последовательности VH и VL получили посредством RT-PCR.
[103] В результате идентифицировали моноклональное антитело (обозначенное как «SAR114»), которое проявляло высокую аффинность к ClfA001, 002 и 004 (KD=1,15-44,7 пМ, таблица 1) и сильное ингибирование связывания фибриногена тремя значимыми генотипами-фаундерами ClfA (IC50 ~ 20 мкс), что показано на фигуре 1B. SAR114 также проявлял опсонофагоцитарное уничтожение (OPK) нескольких клинических изолятов S. aureus, что показано на фигурах 3A - 3F (см., например, Tkaczyk et al. выше, где описаны способы измерения OPK) и улучшенное ингибирование бактериальной агглютинации в плазме крови человека по сравнению с 11H10, что показано на фигуре 2, фигуре 4 и в таблице 2 ниже). Ингибирование агглютинации в плазме крови человека измеряли путем культивирования 112 клинических изолятов S. aureus в течение ночи в триптическом соевом бульоне (TSB), промывания в PBS и суспендирования до одной десятой от исходного объема в ледяном PBS. Моноклональные антитела к ClfA серийно разводили (в два раза) в 30 мкл PBS, начиная с 200 мкг/мл, и смешивали с 30 мкл цитратной плазмы крови человека в 96-луночном планшете с U-образным дном (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). Добавляли бактерии (30 мкл) и инкубировали в течение 5 минут при 37°C. Каждую лунку оценивали визуально и регистрировали наиболее низкую концентрацию моноклональных антител, при которой происходила агглютинация бактерий. R347, человеческое моноклональное антитело к gp120, использовали в качестве изотипического контрольного человеческого IgG1 (c-IgG). Человеческое моноклональное антитело отрицательного контроля (c-IgG) не проявляло какого-либо ингибирующего эффекта до концентрации 200 мкг/мл.
Таблица 2. Минимальная концентрация SAR114, требующаяся для подавления бактериальной агглютинации
Данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов с одним и тем же донором, таким как источник плазмы крови.
[104] Определили, что полипептид тяжелой цепи антитела SAR114 содержит аминокислотную последовательность вариабельной области под SEQ ID NO: 13 с аминокислотной последовательностью CDR1 под SEQ ID NO: 1, аминокислотной последовательностью CDR2 под SEQ ID NO: 2 и аминокислотной последовательностью CDR3 под SEQ ID NO: 3. Определили, что полипептид легкой цепи антитела SAR114 содержит аминокислотную последовательность вариабельной области под SEQ ID NO: 14 с аминокислотной последовательностью CDR1 под SEQ ID NO: 4, аминокислотной последовательностью CDR2 под SEQ ID NO: 5, и аминокислотной последовательностью CDR3 под SEQ ID NO: 6. Посредством ELISA и конкурентного анализа на основе Octet обнаружили, что 11H10 и SAR114 конкурируют за связывание с ClfA001, что показано на фигурах 5A и 5B. Если вкратце, то mAb, разведенные до 5 мкг/мл в PBS, захватывались аминопропилсилановыми (APS) биосенсорами в течение 7 мин. Покрытые биосенсоры переносили на 6 минут в лунки, содержащие блокирующий буфер (PBS, 1 мг/мл BSA (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури)), чтобы заблокировать свободные сайты связывания сенсора, инкубировали в течение 7 минут с 2,5 мкг/мл ClfA001, разведенным в блокирующем буфере, а в завершении переносили в лунки, содержащие конкурирующие mAb, разведенные до 5 мкг/мл в блокирующем буфере. Данные анализировали с использованием программного обеспечения для сбора и анализа данных OCTET® (Pall ForteBio LLC, Фремонт, Калифорния). Отсутствие ассоциации конкурирующего mAb приводило к конкуренции и, таким образом, к распознаванию одного и того же антигенного сайта, в то время как отсутствие конкуренции наблюдалась при обнаружении ассоциации второго mAb.
[105] Результаты этого примера показывают, что моноклональные антитела к ClfA, 11H10 и SAR114, связывают перекрывающийся эпитоп на ClfA001, что свидетельствует о том, что их отличие в активности против ClfA002 может быть результатом разной аффинности связывания.
ПРИМЕР 2
[106] В этом примере описано поколение SAR114-N3 с периодом полужизни, увеличенным по сравнению с SAR114.
[107] Хорошо известно, что Fc-области антител играют роль в их периоде полужизни, и Fc-конструирование использовали для манипуляций с периодом полужизни терапевтических биопрепаратов. Например, тройная аминокислотная замена M252Y/S254T/T256E (называемая заменой «YTE») была проведена в Fc-областях антител, в том числе антитела MEDI4893 к S. aureus, и это может повышать период полужизни в 3-4 раза. Однако также было показано, что мутация YTE приводит к снижению связывания с C1q и FcγR и к снижению эффекторных функций, таких как ADCC- и CDC-активность. (Monnet C., et al., Front Immunol. 6: 39 (2015).) Мутация YTE также снижает свойство опсонофагоцитарного уничтожения (OPK) у антибактериальных антител (см. фигуру 6, показывающую, что замена YTE снижает OPK антитела к псевдомонадам, Cam004.). Таким образом, хотя увеличение периода полужизни было желательным для антитела к ClfA, мутация YTE не являлась подходящей для SAR114.
[108] Borrok et al., (J. Biol. Chem., 290(7): 4282-4290 (2015).) изучали влияния других изменений Fc, включая вариант «N3». Вариант «N3» содержит последовательность CSWHLC (SEQ ID NO:19) в домене CH3 вместо последовательности дикого типа (LHNHYT; SEQ ID NO:22) в тех же положениях. Этот Fc-вариант также увеличивает период полужизни (см. фигуру 9, верхняя панель), но, как показано на фигуре 6, не снижает OPK-способность антибактериальных антител Cam004 (верхняя панель) или 2F4 (нижняя панель).
[109] Поэтому оценивали влияние мутации N3 на связывание с SAR114. В данных экспериментах платформу Biacore использовали для определения кинетической константы скорости/константы аффинности (KD) для связывания исходных и Fc-вариантов антител, SAR-114 и SAR114-N3 соответственно, направленных против белков CLFA001, CLFA002 и CLFA004. Результаты показаны в таблице 3 ниже.
Таблица 3. Аффинность связывания SAR-114 и SAR114-N3 для трех основных генотипов ClfA
[110] Кинетическое соответствие модели связывания 1:1 было достоверным. И SAR114, и SAR114-N3 связываются с CLFA001, CLFA002 и CLFA004 с аналогичными показателями аффинностями. Однако связывание (KD) SAR114 со всеми белками CLFA было в приблизительно 10 раз сильнее, чем у SAR114-N3. Более слабое связывание SAR114-N3 обусловлено более быстрыми скоростями диссоциации.
[111] Также оценивали способность SAR114-N3 ингибировать связывание фибриногена. В этих анализах связывание ClfA с фибриногеном измеряли в присутствии серийно разведенных (от 200 до 0,5 мкг/мл) SAR114, SAR114-N3 или контрольного антитела IgG. Результаты показаны на фигуре 7 и в таблице 4 ниже.
Таблица 4. Ингибирование посредством SAR-114 и SAR114-N3 связывания фибриногена
[112] Эти данные демонстрируют, что SAR114-N3 ингибирует связывание трех основных генотипов ClfA с фибриногеном.
ПРИМЕР 3
[113] В данном примере описано поколение SAR114-N3Y с улучшенной стабильностью по сравнению с SAR114-N3.
[114] Однако вариант «N3» содержит триптофан (W434), который способствует усилению аффинности FcRn и также вносит вклад в чувствительность к свету, в результате чего при нормальных условиях освещения происходит потеря приблизительно 20% мономера в течение одной недели, а в условиях интенсивного освещения происходит потеря более 60% мономера за тот же период времени. Неокисляемые гидрофобные остатки (F, Y, L, I, V, A и S) заменяли триптофаном (W434), и оценивали их влияние на период полужизни SAR114, OPK и светочувствительность. Замены F и Y были наиболее подобны заменам у варианта SAR114 N3 в плане связывания, и обе проявляли аналогичное влияние в виде продления периода полужизни, как и альтерация N3 (см. фигуру 9, верхняя панель). Оценку светоустойчивости проводили с антителами SAR114 с альтерациями F («N3F»; SEQ ID NO:20) и Y («N3Y; SEQ ID NO:21). В ходе данной оценки mAb подвергали воздействию CWL (стандартного белого света) при 2 клк/ч. (показатель интенсивности) при 230°C в течение 14 дней, и наблюдаемая чистота мономеров обобщена в таблице 5 ниже.
Таблица 5. Стабильность SAR114-N3F и SAR114-N3Y
[115] Результаты показывают, что N3Y обладает превосходной устойчивостью к свету. Анализы агглютинации и определение содержания фибриногена также показали, что N3Y обладает лучшей активностью, чем N3F, что показано на фигуре 8. Измерения уровней антител у мышей продемонстрировали, что и N3Y, и N3F характеризовались значениями pK, аналогичными мутантному N3 (фигура 9, верхняя панель), а OPK-активность у варианта N3Y не изменилась (фигура 9, нижняя панель).
ПРИМЕР 4
[116] В данном примере описаны эффекты моноклонального антитела к ClfA, SAR114 или SAR114 N3Y в модели бактериемии на мышах, отдельно или в комбинации с моноклональным антителом к альфа-токсину (AT).
[117] Группы из десяти самок мышей BALB/c в возрасте 6-8 недель (Envigo, Хантингдон, Кембриджшир, Великобритания) пассивно иммунизировали посредством интраперитонеального (и/п) введения изотипического контрольного IgG (c-IgG), моноклонального антитела к ClfA, SAR114, и/или моноклонального антитела к AT, MEDI4893*. Через 24 часа мышей заражали посредством внутривенного (в/в) введения клинических изолятов S. aureus в дозе LD90. Выживаемость отслеживали в течение двух недель. Статистический анализ специфического антистафилококкового антигена против c-IgG проводили посредством логарифмического рангового критерия (Мантела-Кокса). Данные считались статистически отличающимися, если р<0,05.
[118] Профилактическое введение SAR114 (15 мг/кг (mpk)) повышало выживаемость по сравнению с группой введения контрольного изотипа IgG (c-IgG) после заражения изолятами S. aureus, представляющими типы последовательностей (ST) ST8, ST5 или ST30, которые, как было подтверждено, кодируют генотипы ClfA - ClfA001, 002 и 004 соответственно, что показано на фигуре 10. Подобно комбинации антител 11H10 и MEDI4893*, профилактическое введение комбинации SAR114 и MEDI4893* (7,5 мг/кг (mpk) каждого антитела) значительно повышало выживаемость по сравнению с c-IgG после контрольного заражения всеми тестовыми штаммами и обеспечивала преимущество над соответствующими отдельными моноклональными антителами к некоторым штаммам (Tkaczyk et al. выше).
[119] Результаты данного эксперимента демонстрируют, что моноклональное антитело к ClfA, SAR114, является функциональным in vivo, и они свидетельствуют о том, что комбинация SAR114 и моноклонального антитела к AT обеспечивает более широкий охват штаммов для профилактики инфекции S. aureus.
ПРИМЕР 5
[120] В данном примере описаны эффекты моноклонального антитела к ClfA, SAR114, отдельно или в комбинации с моноклональным антителом к альфа-токсину (AT) на модели бактериемии с летальным исходом у мышей с диабетом.
[121] Группы самцов мышей BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J с диабетом в возрасте 6 недель иммунизировали путем интраперитонеального (и/п) введения изотипического контрольного IgG (c-IgG), моноклонального антитела к ClfA, SAR114, и/или моноклонального антитела к AT, MEDI4893*. Через 24 часа мышей заражали посредством внутривенного (в/в) введения клинических изолятов S. aureus SF8300 в дозе LD90 (5e7 КОЕ). Выживаемость отслеживали в течение двух недель. Фигура 11, верхняя панель. Десять животных подвергали эвтаназии через 48 часов для подсчета бактерий в почках (фигура 11, средняя панель) и печени (фигура 11, нижняя панель). Статистический анализ специфического антистафилококкового антигена против c-IgG проводили посредством логарифмического рангового критерия (Мантела-Кокса). Данные считались статистически отличающимися, если р<0,05.
[122] Профилактическое введение SAR114 (15 мг/кг (mpk)) повышало выживаемость по сравнению с введением контрольного изотипа IgG (c-IgG) после заражения, а профилактическое введение комбинации SAR114 и MEDI4893* (по 7,5 мг/кг (mpk) каждого антитела) значимо повышало выживаемость по сравнению с введением c-IgG после заражения. Фигура 11, верхняя панель. Комбинация SAR114 и MEDI4893* (7,5 мг/кг (mpk) каждого антитела) также обеспечивала значительное снижение количества бактерий в почках (фигура 11, средняя панель) и печени (фигура 11, нижняя панель).
[123] Результаты данного эксперимента демонстрируют, что моноклональное антитело к ClfA, SAR114, является функциональным in vivo, и они свидетельствуют о том, что комбинация SAR114 и моноклонального антитела к AT обеспечивает защиту от бактериемии с летальным исходом, вызванной CA-MRSA SF8300, у мышей db/db с диабетом.
ПРИМЕР 6
[124] В данном примере описаны эффекты моноклонального антитела к ClfA, SAR114, отдельно или в комбинации с моноклональным антителом к альфа-токсину (AT), на уровне провоспалительных цитокинов в моделях бактериемии на мышах.
[125] Группы 6-недельных (db) мышей-самцов BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J c диабетом (n=20) и мышей-самцов C57/B6 (B6) без диабета (n=20) иммунизировали путем интраперитонеального (и/п) введения изотипического контрольного IgG (c-IgG), моноклонального антителом к ClfA, SAR114, и/или моноклонального антитела к AT, MEDI4893*. Через 24 часа мышей заражали посредством внутривенного (в/в) введения клинических изолятов S. aureus SF8300 в дозе LD90. Десять животных в группе подвергали эвтаназии через 8 часов или 24 часа, и кровь отбирали из сердца посредством пункции. Уровни провоспалительных цитокины измеряли в плазме крови с использованием набора для определения провоспалительных цитокинов Mesoscale Multiplex. Статистические отличия между группами анализировали посредством U-критерия Манна-Уитни, и данные считали статистически отличающимися, если р<0,05.
[126] Комбинация SAR114 и MEDI4893* значительно снижала уровни IL-6, TNF-α и KC через 24 часа у мышей db/db с диабетом, что показано в таблице 6.
Таблица 6. SAR114 и MEDI4893* снижают уровни провоспалительных цитокинов
Данные являются репрезентативными для трех независимых экспериментов.
[127] Комбинация также значительно снизила уровни IL-6, TNF-α и KC через 24 часа у мышей C57/B6, не имеющих диабета.
ПРИМЕР 7
[128] В данном примере описаны эффекты моноклонального антитела к ClfA, SAR114, отдельно или в комбинации с моноклональным антителом к альфа-токсину (AT), в отношении повреждения печения в модели бактериемии с летальным исходом у мышей с диабетом.
[129] Группы самцов мышей BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J с диабетом в возрасте 6 недель (n=10) иммунизировали путем интраперитонеального (и/п) введения изотипического контрольного IgG (c-IgG), моноклонального антитела к ClfA, SAR114 (15 мг/кг (mpk)), и/или моноклонального антитела к AT, MEDI4893* (15 мг/кг), или комбинации SAR114+MEDI4893* (15 мг/кг каждого антитела). Через 24 часа мышей заражали посредством внутривенного (в/в) введения клинических изолятов S. aureus SF8300 в дозе LD90. Мышей подвергали эвтаназии через 48 ч. после заражения и отбирали печень. Макроскопические патологические изменения регистрировали посредством фотографирования (фигура 12, левая панель), и срез печени окрашивали гематоксилином/эозином после фиксации 10% формалином (фигура 12, правая панель). Антитело SAR114, антитело MEDI4893* и комбинация SAR114+MEDI4893* предотвращали повреждение печени у мышей с диабетом, подвергнутых заражению S. aureus.
ПРИМЕР 8
[130] В данном примере описаны эффекты моноклонального антитела к ClfA, SAR114, отдельно или в комбинации с моноклональным антителом к альфа-токсину (AT), на модели бактериемии у мышей с диабетом.
[131] Группы самцов мышей BKS.Cg-Dock7m+/+Leprdb/J с диабетом в возрасте 6 недель (n=10) иммунизировали путем интраперитонеального (и/п) введения изотипического контрольного IgG (c-IgG), моноклонального антитела к ClfA, SAR114, и/или моноклонального антитела к AT, MEDI4893*. Через 24 часа мышей заражали посредством внутривенного (в/в) введения клинических изолятов S. aureus в дозе LD90. Выживаемость отслеживали в течение двух недель. Фигура 13.
[132] Комбинация SAR114 и MEDI4893* (7,5 мг/кг (mpk) каждого антитела) повышала выживаемость по сравнению с c-IgG после заражения большинством тестовых штаммов, а также обеспечивала преимущество по сравнению с соответствующими отдельными моноклональными антителами в отношении большинства штаммов.
[133] Результаты данного эксперимента демонстрируют, что моноклональное антитело к ClfA, SAR114, является функциональным in vivo, и они свидетельствуют о том, что комбинация SAR114 и моноклонального антитела к AT обеспечивает более широкий охват штаммов для профилактики инфекции S. aureus у мышей с диабетом.
ПРИМЕР 9
[134] В этом примере описано получение биспецифического моноклонального антитела, которое специфически связывается как с ClfA, так и с AT, и его эффективность in vitro.
[135] Поскольку пассивная иммунизация комбинацией моноклонального антитела к ClfA и моноклонального антитела к AT обеспечивает преимущество в охвате штаммов при бактериемии с летальным исходом и сохраняет протективную способность против AT на моделях дермонекроза и пневмонии у мышей (Tkaczyk et al. выше), сконструировали биспецифическое антитело (BiSAb), направленное против ClfA и AT, чтобы определить, обеспечивает ли такое биспецифическое антитело преимущество по сравнению с комбинацией соответствующих отдельных антител. С этой целью BiSAb сконструированы так, как это описано ранее (см., например, Dimasi et al., J. Mol. Biol., 393: 672-692 (2009) and Coloma, M.J. and S.L. Morrison, Nat. Biotechnol., 15: 159-163 (1997)). Если вкратце, то mAb к ClfA, 11H10 или SAR114, использовали в качестве IgG-каркаса, а MEDI4893* прививали в формате scFv. scFv MEDI4893* синтезировали в формате VL-VH с 20-аминокислотным линкером (GGGGSx4) между вариабельными доменами легкой и тяжелой цепей (GeneArt, ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). Антитела «BiS2» сконструировали путем слияния последовательностей scFv MEDI893* с N-концом тяжелых цепей IgG1 11H10 или SAR114 к ClfA. Конструкции «BiS3» получили путем присоединения конструкции линкер-scFv MEDI4893* к С-концу тяжелой цепи 11H10 или SAR114. Конструкции BiS2 и BiS3 схематично изображены на фигуре 14. Молекулы BiS2 и BiS3 экспрессировали посредством временной трансфекции в клетках 293, очищали посредством аффинной хроматографии на основе связывания с белком A, и конечную очистку проводили посредством эксклюзионной хроматографии. Целостность каждой молекулы оценивали посредством масс-спектрофотометрии и по интактной массе, а пептидное картирование проводили для проверки правильного образования сконструированных и эндогенных дисульфидных связей. Форматы BiS2 и BiS3 выбрали потому, что scFv расположен в разных местах на IgG, и единственным способом, чтобы определить, обладает ли один формат преимуществом над другим, является их эмпирическая проверка антител в отношении специфичностей, представляющих интерес.
[136] Чтобы понять, сохраняют ли BiSAb функциональные активности соответствующих отдельных моноклональных антител, оценивали способность каждого BiSAb ингибировать AT-зависимый лизис эритроцитов кролика (RBC) и ингибировать связывание фибриногена с ClfA001, ClfA002 и ClfA004. Тест на гемолиз RBC кролика выполняли путем смешивания серийных разведений BiS Ab и MEDI4893* (от 500 до 1,7 нМ) с AT (0,1 мкг/мл=3 нМ) и инкубирования с 50 мкл промытых RBC кролика (Peel Freeze) в течение 1 часа при 37°С. В некоторых тестах scFv BisAb к AT насыщали 10 М избытком ClfA (5 мкМ). Затем планшеты центрифугировали при 1200 об./мин. в течение 3 минут, и 50 мкл супернатанта переносили в новые планшеты. Неспецифический человеческий IgG1, R347, использовали в качестве отрицательного контроля (c-IgG) (см., например Tkaczyk et al., Clin. Vaccine Immunol., 19: 377-385 (2012)). Поглощение при OD 450 нм измеряли посредством спектрофотометра (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния). Ингибирование гемолиза рассчитывали с использованием следующего уравнения:
100-(100*[ODAT+mAb]/[ODAT]).
[137] Для анализа связывания фибриногена планшеты NUNC MAXISORP((ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс) покрывали в течение ночи при 4°C с использованием 2 мкг/мл человеческого фибриногена (Sigma Aldrich, Сент-Луис, Миссури), промывали 3 раза PBS, содержащим 0,1% Tween 20 (промывочный буфер) и блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре (RT) с использованием казеина 200 мкл/лунка (ThermoFisher Scientific, Уолтем, Массачусетс). После 3 промывок планшеты инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре со смесью 50 мкл Avi-tag ClfA221-559 (2 мкг/мл) и серийными разведениями моноклонального антитела к ClfA или антитела BiS в 100 мкл конечного объема PBS. В некоторых анализах IgG1 к ClfA в BiSAb был насыщен избытком 10 М AT (6,6 мМ). После промывок связанный ClfA детектировали с использованием стрептавидина, конъюгированного с пероксидазой хрена (HRP) (1:20000, GE Healthcare, Чикаго, Иллинойс), и 100 мкл субстрата (KPL) 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB). Реакцию останавливали через 10 минут с использованием 100 мкл 0,2 М H2SО4. Планшеты считывали на спектрофотометре при OD 450 нм. Процент ингибирования связывания ClfA с фибриногеном рассчитывали по следующей формуле: 100-(100*[ODClfA+mAb]/[ODClfA, без mAb]).
[138] Антитела 11H10-BiS2 и BiS3 и антитело SAR114-BiS2 показали значения IC50, аналогичные MEDI4893*, в гемолитическом тесте с AT, тогда как SAR114-BiS3 продемонстрировал пониженную активность нейтрализации AT, что показано на фигуре 15A. Как 11H10 BiSAb, так и SAR114 BiS3Ab показали значения IC50, аналогичные соответствующим исходным IgG к ClfA в анализе ингибирования связывания фибриногена, тогда как SAR114 BiS2Ab утратил некоторую активность против ClfA002, но все еще превосходил 11H10, что показано на фигуре 15B, фигуре 16, и таблице 7. BiSAb также опосредуют аналогичное опсонофагоцитарное уничтожение бактерий (OPK), как и исходный IgG к ClfA, что показано на фигуре 17. Важно отметить, что насыщение scFv к AT в присутствии избытка 10 М AT изменяло активности к ClfA в анализе связывания фибриногена, что показано на фигуре 15C. Аналогично насыщение связывания ClfA избытком 10 M ClfA не уменьшало АТ-нейтрализующую активность BiSAb в гемолитическом тесте, что показано на фигуре 15D.
Таблица 7. IC50 для молекул SAR114 и 11H10-BiS2 и BiS3 в анализе связывания с фибриногеном
[139] Результаты данного примера демонстрируют, что молекулы BiS к ClfA/AT сохраняют функциональную активность in vitro, которая в большинстве случаев была аналогична исходному IgG, и эта активность не уменьшалась в присутствии 10-кратного молярного избытка другого антигена, распознаваемого BiSAb.
ПРИМЕР 10
[140] В этом примере описаны протективные эффекты биспецифического антитела к ClfA/AT в модели бактериемии S. aureus. с летальным исходом.
[141] Мышей пассивно иммунизировали комбинацией из антитела к ClfA, SAR114, и моноклонального антитела MEDI4893* (7,5 мг/кг или 1 мг/кг каждого антитела) или эквимолярными дозами BiSAb (9 или 1,2 мг/кг соответственно) за 24 часа до внутривенного заражения штаммом S. aureus SF8300, как описано в примере 4, и выживаемость отслеживали в течение 14 дней. Оба SAR114-BiSAb при 9 мг/кг проявляли пониженную, но незначительно отличающуюся протективную активность (p=0,234 для BiS2 и p=0,412 для BiS3) по сравнению с комбинацией моноклональных антител при 7,5 мг/кг каждого, что показано на фигуре 18A. Комбинация моноклональных антител при 1 мг/кг (p=0,0051 против c-IgG) и SAR114-BiS2 при 1,2 мг/кг (p=0,0336 против c-IgG) значительно повышала выживаемость по сравнению с c-IgG. В соответствии с наблюдаемой потерей активности нейтрализации AT in vitro (см. фигуру 15A) SAR114-BiS3 значимо не повышал выживаемость при введении дозы 1,2 мг/кг (p=0,657, фигура 18A). При тестировании со штаммом 3049057 S. aureus (MRSA, ST8), штаммом, против которого ни один существующий моноклональный препарат не проявляет достаточной защиты в режиме монотерапии (см. фигуру 10), молекулы SAR114-BiS при 1,2 мг/кг значительно не повышали выживаемость по сравнению с c-IgG (p=0,4310), тогда как эквимолярная концентрация (1 мг/кг) комбинации моноклональных антител действительно повышала выживаемость, что показано на фигуре 18B (p=0,0348 по сравнению с c-IgG). Этот результат свидетельствует о дефекте в антителе SAR114-BiS2 in vivo. Интересно отметить, что пассивная иммунизация 11H10-BiSAb давала защиту, аналогичную комбинации моноклональных антител в обоих тестируемых дозах (9 мг/кг и 1,2 мг/кг), и обеспечила значительное повышение выживаемости по сравнению с c-IgG против обоих штаммов, экспрессирующих ClfA001, SF8300 и 3049057, что показано на фигурах 18C и 18D.
[142] Результаты этого примера демонстрируют, что BiSAb к ClfA/AT не обеспечивают преимущества по сравнению с комбинацией соответствующих отдельных антител. А наоборот, биспецифическое антитело SAR114/MEDI4893* проявляло потерю защиты при более низких дозах против штамма, когда соответствующих отдельных моноклональных антител было недостаточно для обеспечения защиты.
ПРИМЕР 11
[143] В этом примере описаны эксперименты по изучению эффективности биспецифического антитела SAR114/MEDI4893* на модели летальной пневмонии.
[144] Поскольку SAR114 связывает ClfA001 с аффинностью, которая в примерно 1000 раз больше, чем 11H10 (таблица 1), была выдвинута гипотеза, что связывание SAR114 с ClfA секвестрирует SAR114/MEDI4893* BiSAb на поверхности бактерий, что приводит к худшему захвату и нейтрализации AT, когда он секретируется. AT является ключевым фактором вирулентности при пневмонии, вызванной S. aureus (Bubeck Wardenburg, J. and O. Schneewind, J. Exp.Med., 205: 287-294 (2008)), а пассивная иммунизация одним моноклональным антителом к AT защищает мышей от летальной пневмонии, вызванной S. aureus(Foletti et al., J. Mol. Biol., 425(10): 1641-1654 (2013); Hua et al., Antimicrob. Agents Chemother., 58:1108-1117 (2014); and Ragle, B.E. и J. Bubeck Wardenburg, Infect. Immun., 77: 2712-2718 (2009)). Более того, моноклональное антитела к ClfA не влияет на выживаемость в модели пневмонии, а комбинация моноклональных антител к ClfA и к AT обеспечивает защиту, аналогичную защите, обеспечиваемой моноклональными антителами к AT (Tkaczyk et al. выше). Следовательно, чтобы определить, может ли снижение защиты, наблюдаемое с SAR114-BiS2Ab в модели бактериемии с летальным исходом, быть результатом недостаточной нейтрализации AT, самкам мышей C57/B6 (Jackson Laboratory, Бар Харбор, Мериленд) вводили и/п MEDI4893*, отдельно или в комбинации с SAR114 или с молекулами SAR114 BiS2 или BiS3. Пневмонию индуцировали посредством интраназальной инфекции SF8300 (1e8 КОЕ), как описано в Hua et al., выше. Выживаемость животных отслеживали в течение 6 дней. Статистический анализ против с c-IgG проводили посредством логарифмического рангового критерия (Мантела-Кокса). Данные считались статистически отличающимися, если р<0,05.
[145] Пассивная иммунизация посредством MEDI4893* (15 мг/мл), по отдельности или в комбинации с SAR114, приводила к 100% защите после заражения SF8300. Однако пассивная иммунизация SAR114-BiS2 или BiS3 приводила к 30% и 0% выживаемости соответственно, что показано на фигуре 19A. Интересно отметить, что пассивная иммунизация 11H10BiS2, которое характеризуется в примерно 1000 раз сниженной аффинностью к ClfA (таблица 1), обеспечивала 100% выживаемость. Данные результаты подтверждают заключение о том, что связывание с ClfA на поверхности бактерий секвестрирует SAR114-BiSAbs, нарушая тем самым нейтрализацию AT. Для дальнейшей проверки этой гипотезы мышей пассивно иммунизировали молекулами BiS2 перед интраназальным (IN) заражением ClfA-изогенным мутантом SF8300Δclfa. Профилактика с использованием SAR114-BiSAb обеспечивала защиту от SF8300Δclfa, аналогичную MEDI4893*, что показано на фигуре 19B.
[146] Результаты данного примера предоставляют дополнительные доказательства того, что связывание SAR114-BiSAb с локализованным на поверхности ClfA препятствует эффективной нейтрализации растворимого AT.
ПРИМЕР 12
[147] В данном примере описаны эксперименты по исследованию фармакокинетики (pK) антител SAR114 у макаков-крабоедов. Обезьянам вводили внутривенно (в/в) 5 мг/кг SAR114, SAR114 N3F или SAR114 N3Y, и уровни антител измеряли в крови в течение 60 дней. Результаты показаны на фигуре 20 и представлены в таблице 8 ниже.
Таблица 8. PK-параметры у макака-крабоеда
[148] Приведенные выше данные демонстрируют, что модифицированные варианты SAR114, в частности SAR114 N3Y, демонстрируют увеличенный период полужизни у приматов. Приведенные выше данные согласуются с тем, что может быть спрогнозировано в исследованиях по увеличению периода полужизни на мышах, трансгенных по человеческому FcRn. Эффективное увеличение периода полужизни у приматов указывает на то, что период полужизни SAR114 N3Y будет соответственно удлиняться и он важен для правильного введения, лечения и профилактики у людей заболеваний, связанных с S. aureus.
ПРИМЕР 13
[149] В этом примере описаны эксперименты по оценке иммуногенности N3Y Fc.
[150] Иммуногенность терапевтических белков может вызывать проблемы, включающие нейтрализацию, ускоренный клиренс терапевтического средства и/или побочные эффекты. В то время как человеческие белки, такие как каркасные области антител, в основном не являются иммуногенными, мутации в Fc-областях антител представляют потенциальный риск инициации иммунного ответа. Анализы функциональной активации с использованием человеческих CD4 Т-клеток в настоящее время считаются важнейшими исследованиями прогнозирования иммуногенности в силу ведущей роли хелперных Т-клеток в иммуногенных ответах. Поэтому проанализировали влияние N3Y в Fc-области IgG1 на активацию Т-клеток.
[151] В данных экспериментах PMBC выделили из 39 коллекций образцов цельной крови человека с использованием градиентов фиколла. Затем клетки CD8 экстрагировали с использованием положительного отбора и обогащали их путем стимуляции 5 различными пулами пептидов и 10-дневного размножения in vitro с использованием IL-2 для стимуляции. Затем клетки подвергали повторной стимуляции отдельной библиотекой пептидов в планшетах ELIspot для CD4. Результаты, показанные на фигуре 21, демонстрируют, что доза мутации NY3 значительно не повышает иммуногенность по сравнению с Fc-областью дикого типа.
[152] Все ссылки, включая публикации, заявки на патенты и патенты, цитируемые в данном документе, включены в данный документ посредством ссылки в той же степени, как если бы каждый документ был конкретно и отдельно указан как включенный посредством ссылки и был представлен во всей своей полноте в данном документе.
[153] Использование выражений и терминов в единственном числе и выражения "по меньшей мере один" и подобных определений в контексте описания настоящего изобретения (особенно в контексте нижеследующей формулы изобретения) должны толковаться как охватывающие как единственное число, так и множественное число, если в данном документе не указано иное или иное явно не противоречит контексту. Использование выражения "по меньшей мере один", после которого следует перечень из одного или нескольких элементов (например, "по меньшей мере один из A и B") подразумевает один элемент, выбранный из списка элементов (A или B), или любую комбинацию из двух или более из перечисленных элементов (A и B), если в данном документе не указано иное или иное явно не противоречит контексту. Выражения "состоящий", "имеющий", "включающий" и "содержащий" следует понимать, как открытые термины (т.е. означающие "включающий без ограничения"), если не указано иное. Предусматривается, что приведение диапазонов значений в данном документе служит исключительно в качестве способа сокращения индивидуального указания каждого отдельного значения, входящего в данный диапазон, если в данном документе не указано иное, и каждое отдельное значение включено в настоящее описание, как если бы оно было индивидуально упомянуто в данном документе. Все способы, описанные в данном документе, могут выполняться в любом подходящем порядке, если в данном документе не указано иное или иное явно не противоречит контексту. Применение всех возможных примеров или иллюстративных фраз (например, "такой как"), предусмотренных в данном документе, предназначено исключительно для лучшего освещения настоящего изобретения, а не для формулирования ограничения объема настоящего изобретения, если не заявлено иное. Никакая фраза в настоящем описании не должна толковаться как указание, что какой-либо незаявленный элемент является существенным для осуществления настоящего изобретения на практике.
[154] Предпочтительные варианты осуществления данного изобретения описаны в данном документе, включая лучший вариант, известный авторам настоящего изобретения, для осуществления настоящего изобретения. Варианты этих предпочтительных вариантов осуществления могут стать очевидными для специалистов в данной области техники после ознакомления с вышеуказанным описанием. Авторы настоящего изобретения ожидают, что специалисты в данной области техники используют такие варианты как подходящие, и авторы настоящего изобретения предполагают, что настоящее изобретение будет реализовано на практике иначе, чем конкретно описано в данном документе. Соответственно, настоящее изобретение включает все модификации и эквиваленты объекта, упомянутого в прилагаемой формуле изобретения, как это разрешено действующим законодательством. Более того, любая комбинация вышеописанных элементов во всех возможных их вариантах охватывается настоящим изобретением, если в данном документе не указано иное или иное явно не противоречит контексту.
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110>MEDIMMUNE LLC
HUMABS BIOMED SA
<120>АНТИТЕЛО, НАПРАВЛЕННОЕ ПРОТИВ ФАКТОРА СЛИПАНИЯ А (ClfA) S. AUREUS
<130>2943.100PC01/EKS/CLD/MKK
<150>US 62/702,762
<151>2018-07-24
<160>52
<170>PatentIn версия 3.5
<210>1
<211>5
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>SAR114 VH CDR1
<400>1
Asn Ser Tyr Trp Ser
1 5
<210>2
<211>16
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>SAR114 VH CDR2
<400>2
Tyr Leu Tyr Ser Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys Ser
1 5 10 15
<210>3
<211>16
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>SAR114 VH CDR3
<400>3
Thr His Leu Gly Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Phe Trp Phe Asp Pro
1 5 10 15
<210>4
<211>11
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>CDR1 VL SAR114
<400>4
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210>5
<211>7
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>CDR2 VL SAR114
<400>5
Ala Ser Ser Ser Leu Gln Ser
1 5
<210>6
<211>9
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>SAR114 VL CDR3
<400>6
Gln Glu Ser Tyr Ser Thr Pro Pro Thr
1 5
<210>7
<211>5
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>CDR1 VH MEDI4893 и MEDI4893*
<400>7
Ser His Asp Met His
1 5
<210>8
<211>16
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>CDR2 VH MEDI4893 и MEDI4893*
<400>8
Gly Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys Gly
1 5 10 15
<210>9
<211>14
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>CDR3 VH MEDI4893 и MEDI4893*
<400>9
Asp Arg Tyr Ser Pro Thr Gly His Tyr Tyr Gly Met Asp Val
1 5 10
<210>10
<211>11
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>CDR1 VL MEDI4893 и MEDI4893*
<400>10
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1 5 10
<210>11
<211>7
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>CDR2 VL MEDI4893 и MEDI4893*
<400>11
Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1 5
<210>12
<211>8
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>CDR3 VL MEDI4893 и MEDI4893*
<400>12
Lys Gln Tyr Ala Asp Tyr Trp Thr
1 5
<210>13
<211>124
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область тяжелой цепи SAR114
<400>13
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Gln Asn Ser
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Leu Tyr Ser Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr His Leu Gly Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Phe Trp Phe Asp
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>14
<211>107
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область легкой цепи SAR114
<400>14
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ser Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>15
<211>122
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область тяжелой цепи MEDI4893 и MEDI4893*
<400>15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Arg Tyr Ser Pro Thr Gly His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>16
<211>106
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область легкой цепи MEDI4893 и MEDI4893*
<400>16
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln Tyr Ala Asp Tyr Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>17
<211>126
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область тяжелой цепи SAR72
<400>17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Val Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Arg Asn Ala
20 25 30
Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ser Lys Thr Asp Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala Pro Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Thr Gly Pro Gly Gly Gly Pro Pro Gly Asp Tyr Tyr Tyr Asp Gly
100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>18
<211>106
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область легкой цепи SAR72
<400>18
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Val Pro Lys Lys Tyr Ala
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Glu Asp Lys Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Glu Gly Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210>19
<211>6
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Fc-вариант N3
<400>19
Cys Ser Trp His Leu Cys
1 5
<210>20
<211>6
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Fc-вариант N3F
<400>20
Cys Ser Phe His Leu Cys
1 5
<210>21
<211>6
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Fc-вариант N3Y
<400>21
Cys Ser Tyr His Leu Cys
1 5
<210>22
<211>6
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>CH3 Fc дикого типа
<400>22
Leu His Asn His Tyr Thr
1 5
<210>23
<211>17
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>константный домен тяжелой цепи
<400>23
Met His Glu Ala Cys Ser Tyr His Leu Cys Gln Lys Ser Leu Ser Leu
1 5 10 15
Ser
<210>24
<211>222
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>N3Y Fc начиная с шарнирной области
<400>24
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Cys Ser
195 200 205
Tyr His Leu Cys Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210>25
<211>454
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Полноразмерная тяжелая цепь SAR114
<400>25
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Gln Asn Ser
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Leu Tyr Ser Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr His Leu Gly Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Phe Trp Phe Asp
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210>26
<211>214
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Полноразмерная легкая цепь SAR114
<400>26
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Thr Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ser Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Ser Tyr Ser Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210>27
<211>452
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Полноразмерная тяжелая цепь MEDI4893
<400>27
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Arg Tyr Ser Pro Thr Gly His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Tyr Ile Thr Arg Glu Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210>28
<211>212
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Полноразмерная легкая цепь MEDI4893 и MEDI4893*
<400>28
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln Tyr Ala Asp Tyr Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro
100 105 110
Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr
115 120 125
Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys
130 135 140
Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu
145 150 155 160
Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser
165 170 175
Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala
180 185 190
Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe
195 200 205
Asn Arg Gly Glu
210
<210>29
<211>222
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>N3 Fc начиная с шарнирной области
<400>29
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
1 5 10 15
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
20 25 30
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
35 40 45
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
50 55 60
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
65 70 75 80
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
85 90 95
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
100 105 110
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
115 120 125
Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
130 135 140
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
145 150 155 160
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
165 170 175
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
180 185 190
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Cys Ser
195 200 205
Trp His Leu Cys Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
210 215 220
<210>30
<211>127
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область тяжелой цепи SAR80
<400>30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala
20 25 30
Trp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Arg Ser Lys Thr Ala Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Gln Met Thr Ser Leu Lys Ile Glu Asp Thr Ala Leu Tyr
85 90 95
Tyr Cys Met Thr Asp Gly Leu Gly Leu Leu Asn Phe Gly Asp Ser Asp
100 105 110
Pro His His Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Arg Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>31
<211>106
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область легкой цепи SAR80
<400>31
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile His
35 40 45
Glu Asp Thr Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr His Cys Tyr Ser Thr Asp Ser Ser Gly Val Val
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210>32
<211>122
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область тяжелой цепи SAR113
<220>
<221>другой_признак
<222> (25)..(25)
<223>Xaa может представлять собой любую втречающуюся в природе аминокислоту
<220>
<221>другой_признак
<222> (28)..(28)
<223>Xaa может представлять собой любую втречающуюся в природе аминокислоту
<400>32
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Xaa Gly Tyr Xaa Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg His Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg His Gln Ser Gly Ser His Gly Phe Asp Ala Phe Glu Ile Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>33
<211>113
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область легкой цепи SAR113
<400>33
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Gly Val Leu Ser Arg
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asn Asn Leu Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Arg
<210>34
<211>119
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область тяжелой цепи SAR132
<400>34
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Asn Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Ser Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Leu Gly Gln Val Ser Ile Ser Val Asp Lys Ser Phe Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Arg Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Pro Gly Gly Gln Lys Pro Tyr Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>35
<211>106
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область легкой цепи SAR132
<400>35
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Arg Ile Ser Asn Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Lys Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Thr Leu Glu Ser Glu Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Ile Ser Tyr Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>36
<211>136
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область тяжелой цепи SAR352
<400>36
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asn Ala
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Arg Ile Lys Ser Glu Thr Ala Gly Gly Thr Thr Asp Tyr Ala Ala
50 55 60
Pro Val Lys Gly Arg Phe Ser Ile Ser Arg Asp Asp Ser Arg Asn Thr
65 70 75 80
Leu Tyr Leu Glu Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Thr Thr Asp Ser Tyr Thr Pro Leu Glu Glu Pro Cys Pro Asn
100 105 110
Gly Val Cys Tyr Thr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln
115 120 125
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210>37
<211>111
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область легкой цепи SAR352
<400>37
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Ala Ala Pro Gly Glu
1 5 10 15
Lys Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asn
20 25 30
Ser Val Ser Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asp Asn Asp Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
50 55 60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Thr Leu Gly Ile Thr Gly Leu Gln
65 70 75 80
Thr Gly Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Val Gly Ile Leu
85 90 95
Ser Ala Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210>38
<211>119
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область тяжелой цепи SAR372
<400>38
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Asn Arg Tyr
20 25 30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Pro Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Arg Val Thr Leu Gly Leu Glu Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210>39
<211>107
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область легкой цепи SAR372
<400>39
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Lys Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Leu Arg Ser Asn Trp Ala Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210>40
<211>120
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область тяжелой цепи SAR510
<400>40
Gln Val Thr Leu Arg Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys Pro Thr Gln
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser
20 25 30
Gly Met Cys Val Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Ala Leu Ile Glu Trp Asp Asp Asp Lys Tyr Tyr Asn Thr Ser
50 55 60
Leu Lys Thr Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val
65 70 75 80
Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Gly Thr Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg His Ser Ser Ser Ser Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Ala Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>41
<211>107
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область легкой цепи SAR510
<400>41
Ser Tyr Gly Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Ala Lys Gln Tyr Val
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Asp
35 40 45
Lys Asp Arg Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Ser Ser Gly Thr Thr Val Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Ala Glu
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Ala Asp Ser Ser Arg Thr Tyr
85 90 95
Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
100 105
<210>42
<211>121
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область тяжелой цепи SAR547
<400>42
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Ala Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Ile Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Asp Thr Arg Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Thr Ala Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Asn Ala Ser Asp Ser Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Gly Gly Ser His Gly Tyr Asp Ala Phe His Met Trp Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210>43
<211>112
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область легкой цепи SAR547
<400>43
Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly
1 5 10 15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Arg Arg Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Asp Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Gly
85 90 95
Thr His Leu Thr Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210>44
<211>112
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область тяжелой цепи SAS1
<400>44
Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Ala Leu Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Gly Ile Asn Gly Thr Gly Tyr Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Val Thr
65 70 75 80
Leu Glu Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
His Lys Val Pro Trp Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Ser Val Ser Ser
100 105 110
<210>45
<211>113
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область легкой цепи SAS1
<400>45
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Glu Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Phe Phe Lys
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Val Ile Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys His Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Gln Tyr Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210>46
<211>128
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область тяжелой цепи SAS19
<400>46
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Phe Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Asn Ser
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Phe Val Phe Ser Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Leu Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Thr Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gln Val His Tyr Asp Phe Trp Ser Gly Tyr Ser Leu Thr Lys Thr
100 105 110
Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>47
<211>107
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область легкой цепи SAS19
<400>47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Val Asn Gly
50 55 60
Ser Thr Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Leu Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>48
<211>128
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область тяжелой цепи SAS203
<400>48
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Val Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Asn Ser
20 25 30
Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Phe Val Tyr Ser Ser Gly Arg Thr Tyr Tyr Ser Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Phe Phe Ser Leu
65 70 75 80
Arg Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys Ala
85 90 95
Arg Gln Val His Tyr Asp Leu Trp Ser Gly Tyr Ser Leu Thr Lys Thr
100 105 110
Asn Trp Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120 125
<210>49
<211>107
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Вариабельная область легкой цепи SAS203
<400>49
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Gln Ser Ile Ser Asn Phe
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Asn Gly
50 55 60
Ser Thr Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Leu Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210>50
<211>454
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Полноразмерная тяжелая цепь SAR114 N3Y
<400>50
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Gln Asn Ser
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Leu Tyr Ser Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr His Leu Gly Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Phe Trp Phe Asp
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Cys Ser Tyr His Leu Cys Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<210>51
<211>452
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Полноразмерная тяжелая цепь MEDI4893*
<400>51
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser His
20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Thr Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ser Gly Ile Gly Thr Ala Gly Asp Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys
50 55 60
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Glu Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu
65 70 75 80
Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Gly Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asp Arg Tyr Ser Pro Thr Gly His Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro
115 120 125
Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr
130 135 140
Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr
145 150 155 160
Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro
165 170 175
Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr
180 185 190
Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn
195 200 205
His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Pro Gly Lys
450
<210>52
<211>454
<212>БЕЛОК
<213>Искусственная последовательность
<220>
<223>Полноразмерная тяжелая цепь SAR114 N3
<400>52
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Gln Asn Ser
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Leu Tyr Ser Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Thr Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr His Leu Gly Gly Phe His Tyr Gly Gly Gly Phe Trp Phe Asp
100 105 110
Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly
130 135 140
Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro
145 150 155 160
Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr
165 170 175
Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val
180 185 190
Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn
195 200 205
Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro
210 215 220
Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu
225 230 235 240
Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp
245 250 255
Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp
260 265 270
Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly
275 280 285
Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn
290 295 300
Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp
305 310 315 320
Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro
325 330 335
Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu
340 345 350
Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn
355 360 365
Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile
370 375 380
Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr
385 390 395 400
Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys
405 410 415
Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys
420 425 430
Ser Val Met His Glu Ala Cys Ser Trp His Leu Cys Gln Lys Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Ser Pro Gly Lys
450
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| КОМБИНАЦИИ АНТИТЕЛ К STAPHYLOCOCCUS AUREUS | 2019 |
|
RU2804815C2 |
| АНТИТЕЛА К ПОВЕРХНОСТНЫМ ДЕТЕРМИНАНТАМ S. AUREUS | 2013 |
|
RU2698131C2 |
| АНТИТЕЛА К ПОВЕРХНОСТНЫМ ДЕТЕРМИНАНТАМ S. AUREUS | 2013 |
|
RU2808018C2 |
| АНТИТЕЛА, НАПРАВЛЕННЫЕ ПРОТИВ ЛЕЙКОТОКСИНОВ STAPHYLOCOCCUS AUREUS | 2019 |
|
RU2805969C2 |
| Композиции и способы лечения и предупреждения инфекций, вызванных Staphylococcus aureus | 2015 |
|
RU2764981C1 |
| ЧЕЛОВЕЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С ROR2 | 2018 |
|
RU2784586C2 |
| ПРОКОАГУЛЯНТНЫЕ АНТИТЕЛА | 2018 |
|
RU2810094C2 |
| ИММУНОЦИТОКИНЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2021 |
|
RU2818371C1 |
| АНТИТЕЛО К B7-H4, ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ И ЕГО ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ | 2019 |
|
RU2792748C2 |
| ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА ПРОТИВ ЛИГАНДА CD40 | 2018 |
|
RU2770209C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии, а именно к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые специфически связываются с белком, представляющим собой фактор слипания A (ClfA) Staphylococcus aureus (S. aureus), а также к содержащей его композиции. Также раскрыты выделенные полинуклеотиды, кодирующие VH, VH, также легкую и тяжелую цепь вышеуказанного антитела, а также вектор, содержащий вышеуказанный полинуклеотид. Изобретение эффективно для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой Staphylococcus aureus (S. aureus), у субъекта. 13 н. и 38 з.п. ф-лы, 21 ил., 8 табл., 13 пр.
1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком, представляющим собой фактор слипания A (ClfA) Staphylococcus aureus (S. aureus), где указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит определяющую комплементарность область (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 1, CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 2, CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 3, CDR1 вариабельной области легкой цепи (VL), содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 4, CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 5, и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 6, и где указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит константный домен тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность CSYHLC (SEQ ID NO: 21).
2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13.
3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14.
4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком ClfA S. aureus, где указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит (1) VH, (2) VL и (3) константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность CSYHLC (SEQ ID NO: 21), где VH содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 13, и, где VL содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 14.
5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком ClfA S. aureus, где указанные антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит определяющую комплементарность область (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3, CDR1 вариабельной области легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4, CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5, и VL CDR3, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.
6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 5, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и содержит VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.
7. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-4, где указанный константный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность MHEACSYHLCQKSLSLS (SEQ ID NO: 23).
8. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-4, где указанный константный домен тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 24.
9. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 50, и/или содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 26.
10. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9, где значения IC50 для ClfA001, ClfA002 и ClfA004 в анализе ингибирования связывания с фибриногеном находятся в пределах 2 мкг/мл друг от друга.
11. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-10, где все из значений IC50 для ClfA001, ClfA002 и ClfA004 в анализе ингибирования связывания с фибриногеном находятся в диапазоне от 1 мкг/мл до 5 мкг/мл.
12. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-11, где все из значений аффинности связывания (KD) для ClfA001, ClfA002 и ClfA004 находятся в диапазоне от 200 до 350 пМ.
13. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-12, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент имеют чистоту мономера, которая снижается не более чем на 5% после воздействия на антитело или антигенсвязывающий фрагмент типичным белым светом при 2 клк/ч. при 23°C в течение 14 дней.
14. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-13, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит мутацию, которая увеличивает время полужизни по сравнению с таким же антителом без мутации у мышей с человеческим FcRn.
15. Антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-13, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент содержит мутацию, которая увеличивает время полужизни по сравнению с таким же антителом без мутации, и где мутация не ингибирует активность опсонофагоцитарного уничтожения (OPK) по сравнению с таким же антителом или антигенсвязывающим фрагментом без мутации.
16. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 5, 6 и 10-15, где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи.
17. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 16, где константная область тяжелой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2.
18. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 17, где константная область тяжелой цепи представляет собой константную область человеческого IgG1.
19. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 16, где константная область тяжелой цепи содержит мутацию N3, N3E или N3F.
20. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-4, 6, 7 и 16, где константная область тяжелой цепи содержит мутацию YTE.
21. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-8 и пп. 10-20, где указанные антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой цепи.
22. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 21, где константная область легкой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей легкой цепи человеческого иммуноглобулина IgGκ и IgGλ.
23. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 22, где константная область легкой цепи представляет собой константную область легкой цепи человеческого IgGκ.
24. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-23, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент представляют собой моноклональное антитело или антигенсвязывающий фрагмент.
25. Антитело по любому из пп. 1-24, где антитело представляют собой полноразмерное антитело.
26. Антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-24, где антигенсвязывающий фрагмент включает Fab, Fab', F(ab')2, одноцепочечный Fv (scFv), связанный дисульфидной связью Fv, интратело, IgGΔCH2, минитело, F(ab')3, тетратело, триатело, диатело, DVD-Ig, Fcab, mAb2, (scFv)2 или scFv-Fc.
27. Антитело, которое специфически связывается с белком ClfA S. aureus, содержащее тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 50, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную под SEQ ID NO: 26.
28. Способ лечения или предупреждения инфекции, вызываемой Staphylococcus aureus (S. aureus), у субъекта, включающий введение субъекту антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-28.
29. Способ лечения или предупреждения инфекции, вызываемой Staphylococcus aureus (S. aureus), у субъекта, включающий введение субъекту антитела или антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-27 и антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с белком альфа-токсина (AT) S. aureus.
30. Способ по п. 29, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связываются с белком AT S. aureus, содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10, CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12.
31. Способ по п. 29 или 30, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связываются с белком AT S. aureus, содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15.
32. Способ по любому из пп. 29-31, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связываются с белком AT S. aureus, содержит VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16.
33. Способ по любому из пп. 29-32, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связываются с белком AT S. aureus, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 27.
34. Способ по любому из пп. 29-33, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связываются с белком AT S. aureus, содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28.
35. Способ по любому из пп. 29-34, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-27 и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком AT S. aureus, вводят одновременно.
36. Способ по любому из пп. 29-34, где антитело или антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-27 и антитело или антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с белком AT S. aureus, вводят последовательно.
37. Способ по любому из пп. 29-36, где лечение или предупреждение инфекции, вызываемой S. aureus, у субъекта включает подавление сепсиса, связанного со S. aureus, ингибирование агглютинации S. aureus, подавление образования тромбоэмболических поражений, нейтрализацию токсинов, индуцирование опсонофагоцитоза, ингибирование связывания фибриногена со S. aureus, ингибирование агглютинации S. aureus или любую комбинацию из вышеуказанного.
38. Способ по любому из пп. 28-37, где у субъекта имеется диабет.
39. Способ по любому из пп. 28-38, где субъектом является человек.
40. Выделенный полинуклеотид, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую VH с SEQ ID NO: 13, для экспрессии VH.
41. Выделенный полинуклеотид, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую тяжелую цепь c SEQ ID NO: 50, для экспрессии тяжелой цепи.
42. Выделенный полинуклеотид, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую VL с SEQ ID NO: 14, для экспрессии VL.
43. Выделенный полинуклеотид, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую легкую цепь с SEQ ID NO: 26, для экспрессии легкой цепи.
44. Выделенный полинуклеотид, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую (i) VH с SEQ ID NO: 13 или тяжелую цепь с SEQ ID NO: 50, и (ii) VL с SEQ ID NO: 14 или легкую цепь с SEQ ID NO: 26, для экспрессии антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-27.
45. Выделенный вектор для экспрессии кодирующей последовательности, содержащий полинуклеотид по любому из пп. 40-44.
46. Композиция для лечения или предупреждения инфекции, вызываемой Staphylococcus aureus (S. aureus), у субъекта, включающая (i) эффективное количество антитела или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-27, (ii) эффективное количество антитела или антигенсвязывающего фрагмента, которые специфически связываются с белком альфа-токсина (AT) S. aureus и (iii) фармацевтически приемлемый носитель.
47. Композиция по п. 46, в которой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с белком AT S. aureus, содержит CDR1 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 7, CDR2 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 8, CDR3 VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 9, CDR1 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 10, CDR2 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 11, и CDR3 VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 12.
48. Композиция по п. 46 или 47, в которой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с белком AT S. aureus, содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 15.
49. Композиция по любому из пп. 46-48, в которой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с белком AT S. aureus, содержит VL, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 16.
50. Композиция по любому из пп. 46-49, в которой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с белком AT S. aureus, содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 27.
51. Композиция по любому из пп. 46-50, в которой антитело или антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с белком AT S. aureus, содержит легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность под SEQ ID NO: 28.
| WO2014074540 A2, 15.05.2014 | |||
| СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОНТАКТНОГО СОЕДИНЕНИЯ МЕДНЫХ ЖИЛ КАБЕЛЕЙ С АНТИКОРРОЗИОННОЙ ЗАЩИТОЙ | 1993 |
|
RU2072600C1 |
| C | |||
| TKACZYK et al., Multimechanistic Monoclonal Antibodies (MAbs) Targeting Staphylococcus aureus Alpha-Toxin and Clumping Factor A: Activity and Efficacy Comparisons of a MAb Combination and an Engineered Bispecific Antibody Approach, EXPERIMENTAL THERAPEUTICS, 2017, Volume 61 Issue 8 | |||
