Способ определения риска злокачественной трансформации эпителиальных клеток гортани у больных предопухолевыми заболеваниями гортани Российский патент 2023 года по МПК G01N33/58 G01N33/573 G01N33/574 C12Q1/6806 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6886 G16H50/30 

Изобретение относится к области медицины, конкретно к онкологии, касается способов прогнозирования риска развития рака гортани у больных предопухолевыми заболеваниями гортани.

Рак гортани является одной из наиболее распространенных патологий среди органов головы и шеи, преимущественно обнаруживается у мужского населения [1]. Его основным гистологическим типом является плоскоклеточный рак гортани [2, 3]. За последнее десятилетие в лечении рака гортани были достигнуты большие успехи, однако, несмотря на относительную доступность и простоту обследования гортани в условиях современного развития эндоскопической техники, диагностические ошибки на догоспитальном этапе продолжают составлять большой процент. Стоит учитывать, что у 30-35% больных заболевание протекает бессимптомно, из этого можно сделать вывод о необходимости выявления пациентов, относящихся к группе повышенного онкологического риска [4-6]. Рак гортани чаще всего развивается на фоне длительно существующих предраковых заболеваний, сочетающихся с диспластическими процессами, которые могут трансформироваться в рак in situ [7, 8]. По данным ряда исследований можно выделить белки, обладающие наибольшим онкогенным потенциалом в развитии опухоли гортани, к ним относятся: EGFR, PIK3CA, CDK, VEGF. Онкомаркеры р53, Ki67 и CD138 могут служить дополнительными критериями риска злокачественной трансформации у пациентов с предопухолевыми заболеваниями гортани [9-11]. Огромное влияние на опухолевую трансформацию оказывают протеолитические системы, которые способны регулировать пролиферативную активность, апоптоз, неоангиогенез, функционирование иммунной системы и индукцию лекарственной резистентности. Наиболее значимыми системами специфического внутриклеточного протеолиза являются убиквитин-протеасомная и кальпаиновая, и обе они вовлечены в развитие и прогрессирование опухолей [12, 13]. Протеасомы - мультисубъединичные комплексы, обладающие трипсинподобной, химотрипсинподобной и каспазаподобной активностями, каталитические субъединицы которых кодируются генами PSMB [14-16]. Кальпаины, в свою очередь, являются цитоплазматическими цистеиновыми протеазами, для активности которых требуются ионы кальция. Протеолиз, осуществляемый кальпаинами, является частичным, не деградирующим белок, а лишь изменяющим его структуру [17]. Однако, объективных и надежных критериев, позволяющих оценить степень онкологического риска у пациентов с диспластическими изменениями эпителия гортани, существует крайне мало. Таким образом, необходим поиск новых молекулярных маркеров для разработки высокочувствительного способа прогнозирования развития рака гортани у больных предопухолевыми заболеваниями гортани.

Наиболее близким к заявляемому является способ прогнозирования перехода облигатного предрака в ранний рак гортани у мужчин [патент РФ №2260807], в котором у пациентов исследуют концентрацию белка, ассоциированного с беременностью, альфа-2-гликопротеина в сыворотке крови методом ракетного иммуноэлектрофореза до лечения, через 10-12 дней после лечения, а затем ежемесячно. При его концентрации 0,006-0,012 г/л прогнозируют благоприятное течение заболевания, при концентрации 0,013-0,020 г/л прогнозируют рецидив заболевания, при концентрации 0,021-0,028 г/л прогнозируют неблагоприятный исход, высокую вероятность перехода заболевания в ранний рак гортани. Недостатками данного способа являются ограниченная область применения только для пациентов мужского пола, а также увеличение времени, трудозатрат и себестоимости анализа, требуются дорогостоящие моноспецифические антитела и антигенные стандарты.

Новый технический результат - повышение точности и информативности способа за счет использования новых маркеров: экспрессии мРНК β-субъединицы протеасом (PSMB5), химотрипсинподобной (ХТП) активности внутриклеточных протеасом и активности кальпаинов.

Для достижения нового технического результата в способе прогнозирования риска развития рака гортани у больных предопухолевыми заболеваниями гортани путем исследования биологического материала пациента, исследуют гиперпластический, диспластический, опухолевый и гистологически неизмененный эпителий гортани, в котором оценивают уровень экспрессии PSMB5 X1 с помощью количественной обратно-транскриптазной ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR), также определяют химотрипсинподобную (ХТП) активность протеасом в Ед/мг белка Х2, активность кальпаинов в Ед/мг белка Х3 в осветленных гомогенатах и рассчитывают значение уравнения логистической регрессии F по формуле:

F=0,03⋅Х1+0,036⋅X2+1,75⋅Х3-7,898, где

0,03 - значение коэффициента регрессии признака X1;

X1 - экспрессия PSMB5 (УЕ);

0,036 - значение коэффициента регрессии признака Х2;

Х2 - ХТП активность протеасом в тканях (Ед/мг белка);

1,75 - значение коэффициента регрессии признака Х3;

Х3 - активность кальпаинов в тканях (Ед/мг белка);

- 7,898 - значение коэффициента регрессии свободного члена,

значение вероятности онкологического риска Р рассчитывают по формуле,

Р=1/(1+e^-F),

где е=2,718,

и при значении Р≥0,5 прогнозируют высокий риск развития рака гортани.

Способ осуществляет следующие этапы:

1. При выполнении видеоларингоскопии от пациентов получают образцы гиперпластического, диспластического, опухолевого и гистологически неизмененного эпителия гортани. Весь материал должен иметь гистологическую верификацию. Образцы тканей замораживают в растворе RNAlater и хранят при -80°С.

2. Выделение РНК. Для получения РНК образцы ткани смешивают с реагентом «Лира» (Биолабмикс, Россия), который представляет собой лизирующий буфер. В получившуюся гомогенную смесь добавляют хлороформ и осаждают изопропанолом. На спектрофотометре NanoDrop 2000С (Thermo Scientific, USA) оценивают концентрацию и чистоту выделенной РНК. Целостность РНК оценивается при помощи капиллярного электрофореза на приборе TapeStation (Agilent Technologies, USA) по показателю RIN (RNA Integrity Number). RIN выделенных образцов должен быть больше или равен 4, а концентрация РНК не меньше 80 нг/мкл.

3. Количественная обратно-транскриптазная ПЦР. Уровень экспрессии гена оценивают при помощи количественной обратно-транскриптазной ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR) на амплификаторе iCycler (Bio-Rad, USA). Для получения кДНК на матрице РНК проводят реакцию обратной транскрипции с помощью набора реактивов ОТ M-MuLV-RH (Биолабмикс, Россия) с олиго(dT)₁₆ праймерами в соответствии с инструкцией к набору. ПЦР ставят в трех репликах в объеме 25 мкл, содержащем 12,5 мкл БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue (2×) (Биолабмикс, Россия), 300 нМ прямого и обратного праймеров и 50 нг кДНК. Амплификация проводится согласно рекомендациям к набору. Праймеры подбирают с использованием программы Vector NTI Advance 11.5 и базы данных NCBI (Фиг. 1). В качестве гена-рефери используют ген «домашнего хозяйства» фермента GAPDH (Glyceraldehydes-3-Phosphate Dehydrogenase) и уровень экспрессии каждого целевого гена нормализовывают по отношению к экспрессии GAPDH. Количественный анализ экспрессии проводят по методу 2^-ΔΔCT [18]. 2^-ΔΔCT метод предполагает, что оба гена (опытный и референсный) имеют эффективность амплификации равную около 100%. Подсчет:

Нормализация значения C_T исследуемого гена со значениями референсного (ref) гена, как для изучаемой пробы, так и для калибровочной:

ΔC_T(тест)=ΔC_{T(иссл, тест)}-C_{T(реф, тест)}

ΔC_T(клб)=ΔC_{T(иссл, клб)}-C_{T(реф, клб)}

• Нормализация ΔC_T исследуемого образца с ΔC_T калибратора:

ΔΔC_T=ΔC_T(тест)-C_T(клб)

• Оценка уровня экспрессии по формуле:

2^-ΔΔCT = Нормализованная степень экспрессии

Результатом является соотношение исследуемого гена в пробе со значением в образце калибратора, нормализованного по экспрессии референсного гена. Процесс нормализации экспрессии исследуемого гена с референсным геном компенсирует любые различия в количестве взятых на анализ образцов биологического материала.

4. Определение активности протеасом и кальпаинов. Для получения осветленных гомогенатов замороженные образцы ткани гомогенизируют, затем ресуспендируют в 50 мМ трис-HCl буфере (рН 7,5). Гомогенат центрифугируют 60 минут при 10000g и 4°С. ХТП активность протеасом определяют в осветленных гомогенатах по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC (Sigma, USA), утилизирующегося химотрипсинподобными центрами протеасом. Для оценки активности примесных протеаз применяют специфический ингибитор протеасом - MG132 (Sigma, USA). За единицу активности протеасом принимают количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль флуорогенного олигопептида в течение 1 мин. Удельную активность протеасом выражают в единицах активности на 1 мг белка. Содержание белка определяют по методу Lowry [19]. Определение активности кальпаинов проводят в осветленных гомогенатах по гидролизу Suc-LLVY-AMC (Sigma, USA). За единицу активности принимают количество фермента, при котором гидролизуется 1 нмоль флуорогенного олигопептида в течение 1 мин. Удельную активность кальпаинов выражают в единицах активности на 1 мг белка.

5. На следующем этапе рассчитывают значение уравнения логистической регрессии по формуле, которая имеет следующий вид:

F=0,03X1+0,036X2+1,75X3-7,898, где

0,03 - значение коэффициента регрессии признака X1;

X1 - экспрессия PSMB5 (УЕ);

0,036 - значение коэффициента регрессии признака Х2;

Х2 - ХТП активность протеасом в тканях (Ед/мг белка);

1,75 - значение коэффициента регрессии признака Х3;

Х3 - активность кальпаинов в тканях (Ед/мг белка);

- 7,898 - значение коэффициента регрессии свободного члена.

6. Значение вероятности онкологического риска Р рассчитывают по формуле:

Р=1/(1+e^-F), где

е=2,718,

и при значении Р≥0,5 предполагают высокий онкологический риск.

Предлагаемый подход к оценке онкологического риска у пациентов с предопухолевыми заболеваниями гортани обусловлен рядом предпосылок. Предопухолевые (предраковые) заболевания определяются как эпителиальные диспластические поражения, которые могут трансформироваться в рак in situ [20]. В эпителиальных клетках повреждение ДНК вызывает диспластические изменения, которые прогрессируют постепенно (легкая, тяжелая степени) и в конечном итоге приводят к формированию рака in situ, с последующим развитием инвазивной формы [21, 22]. Наличие дисплазии в слизистой оболочке гортани позволяет отнести пациента в группу онкологического риска. Однако необходимы дополнительные критерии прогноза развития предраковых изменений.

Значимую роль в патогенезе предопухолевых и опухолевых заболеваний гортани играют молекулярные механизмы и генетические нарушения, вовлеченные в процессы канцерогенеза. Убиквитин-протеасомная система может регулировать судьбу раковых клеток, модулируя проапоптотические факторы суперсемейства Bcl-2 (B-cell lymphoma 2) [23]. Белок р53 наиболее изученный онкосупрессор, который принимает участие в широком спектре процессов, включая апоптоз, репарацию ДНК и клеточный цикл [24]. Протеасомная деградация является одним из способов регуляции данного белка. Мутации, нарушение активности и экспрессии в Е3-лигазах специфичных для р53 могут приводить к злокачественному перерождению клеток из-за недостаточной активности онкосупрессора р53 [25]. Передача сигналов TGFβ (Transforming growth factor β) играет важную роль в канцерогенезе плоскоклеточного рака гортани, действуя как опухолевый супрессор, связанный с регуляцией таких процессов как инвазия и метастазирование [26]. Все компоненты основной цепи каскада TGFβ, включая TβRI, TβRII и SMAD, регулируются убиквитинированием и деградацией протеасом [27]. Нарушения механизмов регуляции онкогенов семейства MYC происходит больше, чем в 50% случаев рака у человека, и эти нарушения часто связаны с плохим прогнозом и низкой выживаемостью пациентов. Работа Мус строго контролируется убиквитин-протеасомной системой, которая отвечает за стабилизацию данного онкогена, что в свою очередь приводит к повышенной пролиферативной активности опухолевых клеток [28]. Также с помощью убиквитинирования компонентов VEGFR (Vascular endothelial growth factor receptor) - сигнального пути, протеасомная система разрушает рецептор тромбоцитарного фактора роста (PDGFR), что ингибирует опосредованный VEGF и PDGF ангиогенез, как известно данные факторы играют ключевую роль в формировании плоскоклеточного рака гортани [10, 29, 30]. Протеасомы принимают активное участие в посттрансляционных процессах, которые ведут к изменению модификации ключевого полипептида р105 - предшественника NF-κBp50, отвечающего за появление активных форм этого транскрипционного фактора [14]. NF-κВ (Nuclear factor κВ) является ключевым регулятором транскрипции, участвующим в воспалительных реакциях, в процессах клеточной пролиферации, выживании и трансформации клеток организма [31]. Заслуживает внимания ряд работ, в которых показана информативность таких маркеров как р53, Ki67 и CD138 в качестве критериев риска развития злокачественного процесса при различной хронической воспалительной патологии гортани. Так, группой авторов было продемонстрировано значимое увеличение экспрессии р53 при диспластических изменениях I-III степени по сравнению с группой больных хроническими гиперпластическими заболеваниями гортани. Низкий уровень экспрессии Ki67 отмечался при наличии хронических заболеваний гортани без дисплазии. CD138 маркер, отражал степень выраженности дифференцировки опухолевого процесса. При анализе его экспрессии была выявлена обратная закономерность по сравнению с изменениями уровней маркеров Ki67 и р53. Во всех группах пациентов с хронической воспалительной патологией гортани как при наличии диспластических изменений I и II степени слизистой оболочки, так и без таковых были зарегистрированы высокие показатели экспрессии маркера CD138 [9, 32].

Кальпаины являются универсальными протеиназами, которые принимают участие во многих клеточных путях посредством контролируемого протеолиза различных субстратов. При опухолевых процессах активность кальпаинов значительно изменяется для осуществления ферментативных модуляций, регулирующих механизмы онкогенеза. Субстратами для кальпаинов являются некоторые онкобелки и продукты онкосупрессоров, и многочисленные исследования подтверждают участие кальпаиновой системы в опухолевом росте [33, 34]. Уровни экспрессии и активности некоторых кальпаинов значительно повышаются в различных типах злокачественных опухолей, включая шванному, рак молочной железы, рак желудка, колоректальный рак, меланому, рак поджелудочной железы, рак гортани и карциному эндометрия. Также стало известно, что активность кальпаинов необходима для полной клеточной трансформации и инвазии опухолей, вызванных воздействием обычных онкобелков, таких как v-Src, v-Jun, v-Myc, k-Ras и v-Fos [33, 35, 36]. В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что кальпаины участвуют в развитии опухолей различных локализаций, однако роль этих протеиназ в канцерогенезе во многом остается неясной. Известно, что кальпаины активно взаимодействуют с каспазами, а кроме того, многие эффекторы и регуляторы программируемой клеточной гибели являются субстратами кальпаинов. Осуществляемый ими лимитированный протеолиз про- и антиапоптотических белков может активировать или, напротив, инактивировать такие белки, как р53, Bcl-2, Bcl-xl, Bid, Вах, каспазы-3, -7, -8, -9 и -12, NF-κB [33, 37]. К значимым субстратам можно отнести белок р107 (регуляция совместно с протеасомами), член семейства белков ретинобластомы, который подавляет рост опухолевых клеток, продукт протоонкогена c-Mos, циклин D1, CDK-ингибитор р19 [37, 38]. Изучение каталитической активности кальпаиновой системы в тканях эндометрия и гортани показало значимое повышение активности кальпаинов в опухолевых тканях в сравнении с условно-нормальной тканью. Так в исследованиях Коваль В.Д. и соавторов, выявлено, что активность кальпаинов у пациентов с гиперпластическими процессами эндометрия почти в 12 раз больше в сравнении с пациентами, у которых был диагностирован рак эндометрия [35]. Также как и протеасомы, кальпаины принимают участие в регуляции механизмов ангиогенеза. Показано, что VEGF, ключевой ангиогенный цитокин, повышает экспрессию и активность кальпаинов, а их ингибирование подавляет образование новых кровеносных сосудов, что указывает на опосредующую роль кальпаинов в реализации эффектов VEGF [39, 40].

Таким образом, компоненты убиквитин-протеасомной и кальпаиновой систем могут служить важными факторами канцерогенеза и опухолевой прогрессии гортани и, вероятно, могут быть рассмотрены в качестве критериев перехода предопухолевых состояний в рак.

Оценка онкологического риска у пациентов с предопухолевыми заболеваниями гортани проводилась на основании значимости таких показателей, как экспрессия PSMB5, ХТП активность протеасом в ткани и активность кальпаинов в ткани. Общее количество пациентов, включенных в анализ, составило 49 человек, проходивших обследование в клинике НИИ онкологии Томского НИМЦ (2018-2022 гг.). Группу контроля составили 10 здоровых волонтеров без сопутствующих заболеваний и патологий. Были сформированы следующие группы:

I группа: 29 пациентов с плоскоклеточным раком гортани (T_1-3N₀M₀);

II группа: 11 пациентов с хроническими гиперпластическими заболеваниями (D0);

III группа: 9 пациентов с хроническими заболеваниями гортани, сочетающимися с диспластическими изменениями легкой и тяжелой степени (DI, II-III).

Всем пациентам проведено комплексное обследование, в том числе исследования на видиоэндоскопическом центре EVIS EXERA II, с определением гистологического типа опухоли и оценкой клинико-морфологических параметров заболевания. Уровень экспрессии генов оценивали при помощи количественной обратно-транскриптазной ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR) на амплификаторе iCycler (Bio-Rad, USA). ХТП активность протеасом определяли в осветленных гомогенатах по гидролизу флуорогенного олигопептида Suc-LLVY-AMC (Sigma, USA), утилизирующегося химотрипсинподобными центрами протеасом. Определение активности кальпаинов проводили в осветленных гомогенатах по гидролизу Suc-LLVY-AMC (Sigma, USA). Прогностическая значимость признаков в отношении онкологического риска пациентов с предопухолевыми заболеваниями гортани оценена с использованием методов логистической регрессии (Фиг. 2) и ROC-анализа (Фиг. 3). В разработанную модель в качестве независимых признаков включены: экспрессия PSMB5, ХТП активность протеасом в ткани и активность кальпаинов в ткани.

Чувствительность и специфичность разработанной модели составили 93,1% и 90%, соответственно.

Информативность применения способа иллюстрируется следующим клиническим примером.

Пример. Пациент К., 67 лет обратился в НИИ онкологии СО РАМН, где по результатам визуального осмотра был поставлен диагноз хронический гиперпластический ларингит. Для уточнения диагноза проведено исследование согласно предлагаемому способу. В образцах тканей, полученных от пациента путем взятия биопсии, были проведены исследования согласно предлагаемому способу. Экспрессия PSMB5 составила 4 УЕ, химотрипсинподобная активность (ХТП) - 141,1×10*6 Ед/мг белка, активность кальпаинов - 47×10*6 Ед/мг белка. Для определения значения вероятности онкологического риска Р для данного пациента, с учетом исследуемых показателей было рассчитано значение уравнения логистической регрессии:

F=0,03*4+0,036*141,1+1,75*47-7,898=79,5516

далее определяли значение вероятности онкологического риска:

Р=1/(1+e^-F)=0,99. Прогнозируют высокий онкологический риск развития рака гортани. Согласно полученным результатам, данного пациента можно отнести к группе повышенного онкологического риска, то есть вероятность развития рака гортани у данного пациента велика. В дальнейшем, было проведено гистологическое исследование, по результатам которого был сформулирован окончательный диагноз: хронический гиперпластический ларингит, ассоциированный с дисплазией тяжелой степени (DIII), которая, в свою очередь, является облигатным предраком с высокой вероятностью малигнизации (около 80%).

Таким образом, можно сделать вывод о том, что полученные данные характеризуют выраженный потенциал предракового процесса эпителия гортани к озлокачествлению, на основе которых стало возможным разработать способ прогнозирования развития рака гортани у больных предопухолевыми заболеваниями гортани.

Источники информации, принятые во внимание при составлении описания:

1. Sung Н. et al. Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries // CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2021. Vol. 71, №3. P. 209-249.

2. Leemans C.R., Braakhuis B.J.M., Brakenhoff R.H. The molecular biology of head and neck cancer: 1 // Nature Reviews Cancer. Nature Publishing Group, 2011. Vol. 11, №1. P. 9-22.

3. Siegel R.L., Miller K.D., Jemal A. Cancer statistics, 2020 // CA: A Cancer Journal for Clinicians. 2020. Vol. 70, №1. P. 7-30.

4. Мухамедов M.P. et al. Современный взгляд на комплексный подход к диагностике, лечению и реабилитации больных раком гортани // Российская оториноларингология. Россия, Санкт-Петербург: Общество с ограниченной ответственностью «Полифорум», 2012. №3. Р. 78-84.

5. Черемисина О.В., Чойнзонов Е.Л. Возможности эндоскопической диагностики предопухолевых заболеваний и рака гортани в современной онкологии // Сибирский онкологический журнал. Россия, Томск: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Томский научно-исследовательский институт онкологии», 2007. №3. Р. 5-9.

6. Obid R., Redlich М., Tomeh С. The treatment of laryngeal cancer // Oral Maxillofac Surg Clin North Am. 2019. Vol. 31, №1. P. 1-11.

7. Hu Y., Liu H. Histopathological variability and the prognosis of laryngeal premalignant lesions // Zhonghua Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke, Za Zhi 2014. Vol. 49, №12. P. 979-985.

8. Cosway В., Paleri V. Laryngeal dysplasia: an evidence-based flowchart to guide management and follow up // J Laryngol Otol. 2015. Vol. 129, №6. P. 598-599.

9. Черемисина O.B. et al. Характер экспрессии маркеров пролиферативной активности, апоптоза и клеточной дифференцировки при предраке и раке гортани // Сибирский онкологический журнал. Россия, Томск: Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Томский научно-исследовательский институт онкологии», 2015. №5. Р. 74-79.

10. Ciolofan M.S. et al. Clinical, histological and immunohistochemical evaluation of larynx cancer // Curr Health Sci J. 2017. Vol. 43, №4. P. 367-375.

11. Gale N. et al. Current review on squamous intraepithelial lesions of the larynx // Histopathology. 2009. Vol. 54, №6. P. 639-656.

12. Спирина Л.B. et al. Активность протеасом и содержание ростовых факторов при раке почки, мочевого пузыря и эндометрия // Российский Онкологический Журнал. 2010. №1.

13. Спирина Л.В. et al. Активность и субъединичный состав протеасом в плоскоклеточных карциномах головы и шеи // Бюллетень Экспериментальной Биологии И Медицины. 2010. Vol. 149, №1.

14. Спирина Л.В. et al. Регуляция инсулиноподобных факторов роста и NF-kB протеасомной системой при раке эндометрия // Молекулярная биология. 2012. Vol. 46, №3. Р. 452-460.

15. Спирина Л.В. et al. Активность протеасом и их субъединичный состав при гиперпластических процессах и раке эндометрия // Опухоли женской репродуктивной системы. Россия, Москва: Общество с ограниченной ответственностью «Издательский дом «АБВ-пресс», 2011. №4. Р. 64-68.

16. Chen S. et al. Structural basis for dynamic regulation of the human 26S proteasome // Proc Natl Acad Sci USA. 2016. Vol. 113, №46. P. 12991-12996.

17. Sorimachi H., Hata S., Ono Y. Impact of genetic insights into calpain biology // The Journal of Biochemistry. 2011. Vol. 150, №1. P. 23-37.

18. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔСТ Method // Methods. 2001. Vol. 25, №4. P. 402-408.

19. Lowry O.H. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J Biol Chem. 1951. Vol. 193, №1. P. 265-275.

20. Gale N. et al. Laryngeal squamous intraepithelial lesions: an updated review on etiology, classification, molecular changes, and treatment // Adv Anat Pathol. 2016. Vol. 23, №2. P. 84-91.

21. Lawrence M.S. et al. Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes // Nature. 2013. Vol. 499, №7457. P. 214-218.

22. Pai S.I., Westra W.H. Molecular pathology of head and neck cancer: implications for diagnosis, prognosis, and treatment // Annu Rev Pathol. 2009. Vol. 4. P. 49-70.

23. Zhang X., Linder S., Bazzaro M. Drug development targeting the ubiquitin-proteasome system (UPS) for the treatment of human cancers: 4 // Cancers. Multidisciplinary Digital Publishing Institute, 2020. Vol. 12, №4. P. 902.

24. Chumakov P.M. Versatile functions of p53 protein in multicellular organisms // Biochemistry Moscow. 2007. Vol. 72, №13. P. 1399-1421.

25. Sorokin A.V., Kim E.R., Ovchinnikov L.P. Proteasome system of protein degradation and processing // Biochemistry Moscow. 2009. Vol. 74, №13. P. 1411-1442.

26. Adorno M. et al. A mutant-p53/Smad complex opposes p63 to empower TGFβ-induced metastasis // Cell. 2009. Vol. 137, №1. P. 87-98.

27. Kowanetz M. et al. TGFβ induces SIK to negatively regulate type I receptor kinase signaling // Journal of Cell Biology. 2008. Vol. 182, №4. P. 655-662.

28. Chen H., Liu H., Qing G. Targeting oncogenic Мус as a strategy for cancer treatment // Signal Transduct Target Ther. 2018. Vol. 3. P. 5.

29. Schlüter A. et al. CD31 and VEGF are prognostic biomarkers in early-stage, but not in late-stage, laryngeal squamous cell carcinoma // BMC Cancer. 2018. Vol. 18, №1.

30. Спирина Л.B. et al. Регуляция экспрессии транскрипционных факторов и фактора роста эндотелия протеосомной системой при метастазировании рака почки: 1 // Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Россия, Москва: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, 2012. Vol. 23, №1. Р. 27-32.

31. Sau A. et al. Persistent activation of NF-κВ in BRCA1-deficient mammary progenitors drives aberrant proliferation and accumulation of DNA damage // Cell Stem Cell. 2016. Vol. 19, №1. P. 52-65.

32. Ashraf M.J. et al. Expression of Ki67 and P53 in primary squamous cell carcinoma of the larynx // Indian Journal of Pathology and Microbiology. 2010. Vol. 53, №4. P. 661.

33. Moretti D. et al. Calpains and cancer: Friends or enemies? // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2014. Vol.564. P. 26-36.

34. Suzuki K. et al. Structure, activation, and biology of calpain // Diabetes. American Diabetes Association, 2004. Vol.53, № suppl 1. P. S12-S18.

35. Коваль В.Д. et al. Активность протеасом и кальпаинов при новообразованиях эндометрия // Молекулярная медицина. Россия, Москва: Общество с ограниченной ответственностью «Издательский дом «Русский врач», 2012. №4. Р. 45-48.

36. Raimbourg Q. et al. The Calpain/Calpastatin system has opposing roles in growth and metastatic dissemination of melanoma // PLOS ONE. Public Library of Science, 2013. Vol. 8, №4. P. e60469.

37. Ono Y., Sorimachi H. Calpains - An elaborate proteolytic system // Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 2012. Vol. 1824, №1. P. 224-236.

38. Wang X.D. et al. Cyclin E in breast tumors is cleaved into its low molecular weight forms by calpain // Oncogene. 2003. Vol. 22, №5. P. 769-774.

39. Wu X. et al. Enriched housing promotes post-stroke neurogenesis through calpain 1-STAT3/HIF-1α/VEGF signaling // Brain Res Bull. 2018. Vol. 139. P. 133-143.

40. Saez M.E. et al. The therapeutic potential of the calpain family: new aspects // Drug Discovery Today. 2006. Vol. 11, №19. P. 917-923.

Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для определения риска злокачественной трансформации эпителиальных клеток гортани у больных предопухолевыми заболеваниями гортани. Получают образец ткани пациента путем взятия биопсии гортани. Исследуют эпителий гортани, в котором оценивают уровень экспрессии гена PSMB5 по отношению к экспрессии референсного гена GAPDH с помощью RT-qPCR. В осветленных гомогенатах определяют химотрипсинподобную активность протеасом (ХТП) и активность кальпаинов. Рассчитывают значение вероятности злокачественной трансформации по формуле Р=1/(1+e^-F). При значении Р≥0,5 прогнозируют высокий риск злокачественной трансформации эпителиальных клеток гортани у больных предопухолевыми заболеваниями гортани. Способ обеспечивает повышение точности и информативности определения риска злокачественной трансформации эпителиальных клеток гортани за счет использования новых маркеров: экспрессии PSMB5, ХТП активности протеасом и активности кальпаинов. 3 ил., 1 пр.

Способ определения риска злокачественной трансформации эпителиальных клеток гортани у больных предопухолевыми заболеваниями гортани, характеризующийся тем, что получают образец ткани пациента путем взятия биопсии гортани, исследуют эпителий гортани, в котором оценивают уровень экспрессии гена PSMB5 по отношению к экспрессии референсного гена GAPDH, с помощью количественной обратно-транскриптазной ПЦР в режиме реального времени (RT-qPCR), в осветленных гомогенатах определяют химотрипсинподобную активность протеасом (ХТП) и активность кальпаинов, рассчитывают значение уравнения логистической регрессии F по формуле:

F=0,03X1+0,036X2+1,75X3-7,898, где

0,03 - значение коэффициента регрессии признака X1;

X1 - соотношение экспрессии гена PSMB5 к экспрессии референсного гена GAPDH;

0,036 - значение коэффициента регрессии признака Х2;

Х2 - ХТП активность протеасом в тканях, Ед/мг белка;

1,75 - значение коэффициента регрессии признака Х3;

Х3 - активность кальпаинов в тканях, Ед/мг белка;

-7,898 - значение коэффициента регрессии свободного члена,

значение вероятности злокачественной трансформации Р рассчитывают по формуле:

Р=1/(1+e^-F),

где е=2,718,

и при значении Р≥0,5 прогнозируют высокий риск злокачественной трансформации эпителиальных клеток гортани у больных предопухолевыми заболеваниями гортани.