Способ количественного определения антигипертензивных лекарственных веществ в плазме крови Российский патент 2023 года по МПК G01N30/14 G01N30/24 G01N30/34 G01N30/72 G01N1/28 

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения содержания антигипертензивных лекарственных препаратов (лизиноприла, амлодипина, индапамида, метопролола и валсартана) в плазме крови людей. Разработанный метод можно использовать для проведения терапевтического лекарственного мониторинга и повышения эффективности терапии артериальной гипертензии.

Уровень техники

Описано несколько методов оценки концентрации антигипертензивных лекарственных препаратов в сыворотке/плазме крови пациентов.

Известен способ количественного определения лизиноприла в плазме крови человека методом ВЭЖХ с ионизацией электроспреем и с тандемным масс-спектрометрическим детектированием. Аналит и внутренний стандарт извлекали из образцов плазмы методом твердофазной экстракции с использованием картриджей для ТФЭ Waters HLB Oasis® и хроматографировали на аналитической колонке C8. Подвижная фаза состояла из ацетонитрила/воды (60:40, по объему) + 20 мМ уксусной кислоты + 4,3 мМ триэтиламина. Метод имел общее хроматографическое время выполнения 6,5 мин и был линейным в диапазоне 2,00–200 нг/мл [Ana A.F. Padua, Rafael E. Barrientos-Astigarraga, Vinicius M. Rezende, Gustavo D. Mendes, Gilberto De Nucci. Lisinopril quantification in human plasma by liquid chromatography–electrospray tandem mass spectrometry // Journal of Chromatography B, 809 (2004) 211–216].

Разработан способ детектирования ивабрадина, ребоксетина и метопролола методом УВЭЖХ-МС/МС. Пробоподготовка заключалась в добавлении к 200 мкл плазмы человека этилацетата. Хроматографическое разделение проводили на колонке BEH C18 длиной 50 мм с градиентным элюированием смесью воды и метанола, каждый из которых содержал 2 мМ ацетата аммония, в течение 4,5 мин. Масс-спектрометрическое детектирование проводили в режиме положительной ионизации электроспреем (ESI+). Разработанный метод был линеен в диапазоне 1 нг/мл до 500 нг/мл для всех трех аналитов [Alexander A. Zoerner, Christoph Schroeder, Arslan Arinc Kayacelebi, Maria T. Suchy, Frank-Mathias Gutzki, Dirk O. Stichtenoth, Jens Tank, Jens Jordan, Dimitrios Tsikas. A validated, rapid UPLC–MS/MS method for simultaneous ivabradine, reboxetine, and metoprolol analysis in human plasma and its application to clinical trial samples // Journal of Chromatography B, 927 (2013) 105–111. http://dx.doi.org/10.1016/j.jchromb.2013.01.016].

Описан метод детектирования периндоприла, периндоприлата и индапамида в плазме крови человека с помощью УВЭЖХ-МС/МС. Образцы плазмы готовили методом твердофазной экстракции, а затем разделяли на X-terra MS C18 (2,1 мм × 150 мм, 3,5 мкм) с изократическим элюированием. Анализировали следующие ионные переходы при m/z 369,165 → 172,000 (периндоприл), m/z 341,146 → 170,112 (периндоприлат), m/z 366,010 → 132,100 (индапамид) в режиме положительной ионизации электроспреем. Разработанный мето показал высокую чувствительность, линейность, точность и прецизионность при определении периндоприла, периндоприлата и индапамида в диапазоне 0,250–50,0 нг/мл [Xin Zheng, Huitao Gao, Xinge Cui, Yanbao Zhang, Rui Chen, Yaqin Wang, Pauline Lauruol, Hongyun Wang. Simultaneous determination of indapamide, perindopril and its active metabolite perindoprilat in human plasma using UPLC-MS/MS method // Journal of Chromatography B 1169 (2021) 122585].

Разделение проводили на обращенно-фазовой колонке Aquasil C18 (50 мм × 2,1 мм, 5 мкм) с использованием ацетонитрила и воды, содержащей 0,1% муравьиной кислоты (50:50, об./об.), в качестве подвижной фазы. Метод был подтвержден с точки зрения линейности, точности и прецизионности в диапазоне концентраций от 1 нг/мл до 1000 нг/мл. Внутрисуточная и междневная прецизионность и достоверность, стабильность и извлечения всех аналитов находились на высоком уровне.

Известен способ определения амлодипина, валсартана и гидрохлортиазида в плазме крови крыс методом ВЭЖХ-МС/МС. Разделение проводили на обращенно-фазовой колонке Aquasil C18 (50 мм × 2,1 мм, 5 мкм) с использованием ацетонитрила и воды, содержащей 0,1% муравьиной кислоты (50:50, об./об.), в качестве подвижной фазы. Метод был подтвержден с точки зрения линейности, точности и прецизионности в диапазоне концентраций от 1 нг/мл до 1000 нг/мл [G. Shankar Ganesh, Pragney Deme, K. Madhusudana, Ramakrishna Sistla, Simultaneous determination of amlodipine, valsartan and hydrochlorothiazide by LC-ESI-MS/MS and its application to pharmacokinetics in rats, Journal of Pharmaceutical Analysis, http://dx.doi.org/10.1016/j.jpha.2013.12.003].

Однако, методики, в которой одновременно детектировалось сразу 5 антигипертензивных препаратов (лизиноприл, амлодипин, индапамид, метопролол и валсартан) в плазме крови человека с пробоподготовкой в виде осаждения белков ацетонитрилом на данный момент не описано.

Техническим результатом изобретения является разработка чувствительного, селективного, точного, прецизионного способа количественного определения лизиноприла, амлодипина, индапамида, метопролола и валсартана в плазме крови человека.

Осуществление изобретения

Концентрацию лизиноприла, амлодипина, валсартана, метопролола и индапамида в плазме крови людей определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием с помощью хроматографа Ultimate 3000 и масс-спектрометра TSQ Fortis (ThermoFisher, США).

Для пробоподготовки использовали ацетонитрил с добавлением в качестве внутреннего стандартов фексофенадина в концентрации 1 нг/мл, который добавляли к образцам плазмы в соотношении 3:1 (600 мкл ацетонитрила с фексофенадином и 200 мкл плазмы). Полученную смесь встряхивали на шейкере в течение 1 минуты, затем центрифугировали при 19 000 g (Avanti JXN-3 «Beckman Coulter», США) в течение 10 минут при 4°С. 600 мкл надосадочной жидкости переливали пипеткой в промаркированные виалы и помещали в автосемплер для последующего анализа.

Объем вводимой пробы составил 5 мкл.

Разделение выполняли на колонке UCT Selectra C18 4,6 mm×100 mm, 3um, 100A с предколонкой Selectra C18 Guard Cartridges SLC-18GDC46-3UM при температуре 35°С, в градиентном режиме элюирования в соотношении 0,1% раствора кислоты муравьиной/ацетонитрил: 0 мин - 80%/20%, 0,1 мин - 45%/55%, 5 мин - 10%/90%, 10 мин - 80%/20%, со скоростью потока 300 мкл/мин и детектированием в положительном режиме ионизации электроспреем, напряжение электроспрея 4000 В, оболочечный газ 50 arb, вспомогательный газ 10 arb, продувочный газ 1 arb, температуру испарителя 350°С, ион-транспортирующей трубки - 300°С, с использованием режима мониторинга множественных реакций (MRM) с давлением подачи аргона 2 мТорр. Использовали следующие переходы:

1. метопролол 268 m/z → 115,5 m/z, напряжение столкновения 18 В, напряжение на элементе «Тубусная линза» 95 В, 268 m/z → 191 m/z, напряжение столкновения 17 В, напряжение на элементе «Тубусная линза» 95 В;

2. индапамид 365,8 m/z → 117 m/z, напряжение столкновения 36 В, напряжение на элементе «Тубусная линза» 111 В, 365,8 m/z → 131,4 m/z, напряжение столкновения 15 В, напряжение на элементе «Тубусная линза» 111 В;

3. лизиноприл 405,85 m/z → 84 m/z, напряжение столкновения 30 В, напряжение на элементе «Тубусная линза» 112 В, 405,85 m/z → 245,4 m/z, напряжение столкновения 24 В, напряжение на элементе «Тубусная линза» 112 В;

4. амлодипин 409,2 m/z → 237,8 m/z, напряжение столкновения 12 В, напряжение на элементе «Тубусная линза» 100 В, 409,2 m/z → 293,9 m/z, напряжение столкновения 10 В, напряжение на элементе «Тубусная линза» 100 В;

5. валсартан 436,2 m/z → 206,3 m/z, напряжение столкновения 27 В, напряжение на элементе «Тубусная линза» 104 В, 436,2 m/z → 234,9 m/z, напряжение столкновения 18 В, напряжение на элементе «Тубусная линза» 104 В.

Аналитический диапазон составил: для лизиноприла 5-500 нг/мл, для индапамида 5-500 нг/мл, для амлодипина 5-500 нг/мл, для валсартана 10 – 10 000 нг/мл, для метопролола 2-1000 нг/мл.

Разработанная методика была валидирована по следующим параметрам: селективность, калибровочная кривая, точность, прецизионность, предел количественного определения, перенос пробы, стабильность образцова, матричный эффект.

С помощью разработанного метода были проанализированы концентрации антигипертензивных лекарственных препаратов в плазме крови пациентов с артериальной гипертензией перед и через 2 ч после их приема.

Полученные результаты представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Концентрация антигипертензивных лекарственных препаратов в плазме крови пациентов с артериальной гипертнзией

№ Пациента Концентрации антигипертензивных лекарственных препаратов, нг/мл Лизиноприл Амлодипин Индапамид Метопролол Валсартан 0 ч 2 ч 0 ч 2 ч 0 ч 2 ч 0 ч 2 ч 0 ч 2 ч 1 МЕД 112,56 140,72 14,97 16,07 22,77 47,49 - - - - 2 БЮЕ 78,43 94,28 5,93 5,68 0,29 17,68 29,53 103,96 - - 3 ДВМ - - - - 6,27 7,98 - - 521,31 1352,93

Таким образом, разработанная биоаналитическая методика определения концентраций лизиноприла, амлодипина, индапамида, метопролола и валсартана является чувствительной, селективной, точной, прецизионной и может быть использована для проведения терапевтического лекарственного мониторинга.

Изобретение относится к области аналитической химии. Раскрыт способ одновременного количественного определения лизиноприла, индапамида, валсартана, амлодипина, метопролола в плазме крови, включающий применение метода ВЭЖХ-МC/МС. При этом проводят пробоподготовку с осаждением белков путем смешивания 200 мкл пробы плазмы крови с 600 мкл ацетонитрила, последующим встряхиванием в течение 10 мин и с дальнейшим центрифугированием при 19000g в течение 10 мин при температуре + 4°С с последующим вколом 5 мкл пробы с применением автосемплера и разделением на колонке UCT Selectra C18 4,6 mm×100 mm, 3um, 100A с предколонкой Selectra C18 Guard Cartridges SLC-18GDC46-3UM при температуре 35°С, в градиентном режиме элюирования в соотношении 0,1% раствора кислоты муравьиной/ацетонитрил: 0 мин - 80%/20%, 0,1 мин - 45%/55%, 5 мин - 10%/90%, 10 мин - 80%/20%, со скоростью потока 300 мкл/мин и детектированием в положительном режиме ионизации электроспреем, напряжение электроспрея 4000 В, оболочечный газ 50 arb, вспомогательный газ 10 arb, продувочный газ 1 arb, температура испарителя 350°С, ион-транспортирующей трубки - 300°С, с использованием режима MRM с давлением подачи аргона 2 мТорр. Изобретение обеспечивает чувствительный, селективный, точный и прецизионный способ количественного определения указанной смеси веществ в плазме крови. 5 з.п. ф-лы, 1 табл.

1. Способ одновременного количественного определения лизиноприла, индапамида, валсартана, амлодипина, метопролола в плазме крови, включающий применение метода ВЭЖХ-МC/МС, отличающийся проведением пробоподготовки с осаждением белков путём смешивания 200 мкл пробы плазмы крови с 600 мкл ацетонитрила, последующим встряхиванием в течение 10 мин и дальнейшим центрифугированием при 19000g в течение 10 мин при температуре +4°С с последующим вколом 5 мкл пробы с применением автосемплера и разделением на колонке UCT Selectra C18 4,6 mm×100 mm, 3um, 100A с предколонкой Selectra C18 Guard Cartridges SLC-18GDC46-3UM при температуре 35°С, в градиентном режиме элюирования в соотношении 0,1% раствора кислоты муравьиной/ацетонитрил: 0 мин - 80%/20%, 0,1 мин - 45%/55%, 5 мин - 10%/90%, 10 мин - 80%/20%, со скоростью потока 300 мкл/мин и детектированием в положительном режиме ионизации электроспреем, напряжение электроспрея 4000 В, оболочечный газ 50 arb, вспомогательный газ 10 arb, продувочный газ 1 arb, температура испарителя 350°С, ион-транспортирующей трубки - 300°С, с использованием режима MRM с давлением подачи аргона 2 мТорр.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что метопролол определяют в режиме MRM 268 m/z → 115,5 m/z, напряжение столкновения 18 В, напряжение на элементе «Тубусная линза» 95 В, 268 m/z → 191 m/z, напряжение столкновения 17 В, напряжение на элементе «Тубусная линза» 95 В.

3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что индапамид определяют в режиме MRM 365,8 m/z → 117 m/z, напряжение столкновения 36 В, напряжение на элементе «Тубусная линза» 111 В, 365,8 m/z → 131,4 m/z, напряжение столкновения 15 В, напряжение на элементе «Тубусная линза»111 В.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что лизиноприл определяют в режиме MRM 405,85 m/z → 84 m/z, напряжение столкновения 30 В, напряжение на элементе «Тубусная линза» 112 В, 405,85 m/z → 245,4 m/z, напряжение столкновения 24 В, напряжение на элементе «Тубусная линза» 112 В.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что амлодипин определяют в режиме MRM 409,2 m/z → 237,8 m/z, напряжение столкновения 12 В, напряжение на элементе «Тубусная линза» 100 В, 409,2 m/z → 293,9 m/z, напряжение столкновения 10 В, напряжение на элементе «Тубусная линза» 100 В.

6. Способ по п. 4, отличающийся тем, что валсартан определяют в режиме MRM 436,2 m/z → 206,3 m/z, напряжение столкновения 27 В, напряжение на элементе «Тубусная линза» 104 В, 436,2 m/z → 234,9 m/z, напряжение столкновения 18 В, напряжение на элементе «Тубусная линза»104 В.