Способ количественного определения малонового диальдегида методом ВЭЖХ-МC/МС Российский патент 2023 года по МПК G01N30/06 G01N30/24 G01N30/38 G01N30/72 G01N30/78 G01N1/38 

Изобретение относится к аналитической химии и может быть использовано для определения содержания малонового диальдегида (МДА), являющегося маркером окислительного стресса. В настоящее время для изучения окислительного стресса широко применяют модели in vitro.

Уровень техники

Известен способ количественного определения МДА путем фотометрического анализа, в основе которого лежит способность МДА реагировать с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) и образовывать окрашенный аддукт (МДА-(ТБК)₂) [Mihara M., Uchiyama M., Fukuzawa K. Thiobarbituric acid value on fresh homogenate of rat as a parameter of lipid peroxidation in aging, CCl4 intoxication, and vitamin E deficiency. Biochem Med. 1980; 23(3): 302-11.].

Однако реакция с ТБК имеет невысокую специфичность к МДА и требует большого объема пробы, что затрудняет клинический анализ. ТБК может вступать в реакции с широким спектром компонентов, присутствующих в плазме, таких как альдегиды, сахара и мочевина [Sun Q., Faustman C., Senecal A., Wilkinson A.L., Furr H. Aldehyde reactivity with 2-thiobarbituric acid and TBARS in freeze-dried beef during accelerated storage. Meat Sci. 2001; 57: 55–60].

Известны способы определения МДА посредством хроматографической масс-спектрометрии (GC-MS/MS), жидкостной хроматографической масс-спектрометрии (LC-MS/MS) [Tsikas D. Assessment of lipid peroxidation by measuring malondialdehyde (MDA) and relatives in biological samples: Analytical and biological challenges. Anal Biochem. 2017; 524:13-30]. Однако все эти методы требуют предварительной дериватизации (ТБК [Yu L.W., Latriano L., Duncan S., Hartwick R.A., Witz G. High-performanceliquid chromatography analysis of the thiobarbituric acid adducts of malonaldehyde and trans,trans-muconaldehyde. Anal. Biochem. 1986; 156(2): 326-33], 2,4-динитрофенилгидразин [Cordis G.A., Das D.K., Riedel W. High-performance liquid chromatographic peak identification of 2,4-dinitrophenylhydrazine derivatives of lipid peroxidation aldehydes by photodiode array detection. J. Chromatogr. 1998; 798(1-2):117-23. doi: 10.1016/s0021-9673(97)01161-8], пентафторбензилбромид в водном ацетоне [Cordis G.A., Das D.K., Riedel W. High-performance liquid chromatographic peak identification of 2,4-dinitrophenylhydrazine derivatives of lipid peroxidation aldehydes by photodiode array detection. J. Chromatogr. 1998; 798(1-2):117-23], пентафторбензил [Tsikas D., Rothmann S., Schneider J.Y., Suchy M.T., Trettin A., Modun D., Stuke N., Maassen N., Frölich J.C. Development, validation and biomedical applications of stable-isotope dilution GC-MS and GC-MS/MS techniques for circulating malondialdehyde (MDA) after pentafluorobenzyl bromide derivatization: MDA as a biomarker of oxidative stress and its relation to 15(S)-8-iso-prostaglandin F2α and nitric oxide (NO). J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2016; 019:95-111.; Tsikas D. Pentafluorobenzyl bromide-A versatile derivatization agent in chromatography and mass spectrometry: I. Analysis of inorganic anions and organophosphates. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2017 Feb 1;1043:187-201] и не учитывают стадию высвобождения МДА из связанного состояния, на долю которого приходится до 90% [Langille E., Lemieux V., Garant D., Bergeron P. Development of small blood volume assays for the measurement of oxidative stress markers in mammals. PLoS One. 2018; 13(12): e0209802].

Техническим результатом изобретения является разработка чувствительного, селективного, точного, прецизионного способа количественного определения МДА в среде культивирования клеток.

Осуществление изобретения

МДА определяют в среде культивирования клеток, представляющей собой раствор Хэнкса после инкубирования с клетками линии Caco-2 в течение 3 часов. Образцы замораживают и хранят до дня анализа при температуре -80 °С.

С целью подготовки проб к хроматографированию проводят осаждение белков путём смешивания 10 мкл пробы среды культивирования клеток с 90 мкл ацетонитрила, последующим встряхиванием в течение 10 мин и дальнейшим центрифугированием при 10000g в течение 10 мин при температуре +4 °С. Полученный супернатант переносят в виалы («ThermoFisher», США) со специальными вставками объёмом 300 мкл, после чего пробы помещают в автосемплер хроматографа с поддерживаемой температурой +6 °С.

Определение МДА осуществляют с использованием хроматографической системы «Dionex Ultimate 3000», включающей в себя градиентный насос, оснащённый системой дегазации; автосемплером, колоночным термостатом. В качестве детектора в данную систему включен тандемный масс-селективный детектор TSQ Fortis («ThermoFisher», США). Управление аналитической системой, запись показаний детектора и контроль инструментальных параметров проводят с помощью модулей программного обеспечения «Thermo Scientific Xcalibur (ver. 4.2.47)».

Хроматографию проводят на колонке UCT Selectra C18 4,6 mm×100 mm, 3um, 100A в комплексе с предколонкой Selectra C18 Guard Cartridges SLC-18GDC46-3UM; температура колонки 35°С. Используют изократический режим элюирования со скоростью потока 300 мкл/мин подвижной фазой, состоящей из 20% ацетонитрила и 80% водного раствора формиата аммония с концентрацией 10 мМоль/л.

Детектирование МДА проводят при следующих условиях. Осуществляют ионизацию путём формирования электроспрея в негативном режиме при атмосферном давлении. Используют указанные далее условия источника ионов: напряжение электроспрея 2700 В, оболочечный газ (sheath gas) 50 arbitrary unit (arb), вспомогательный газ arbitrary unit (arb), продувочный газ (sweep gas) arbitrary unit (arb), температура испарителя 350 °С, ион-транспортирующей трубки 300 °С. Для детектирования используют режим Multiple Reactions Monitoring (MRM) со следующими параметрами: разрешение Q1 и Q3 установлено на 0,7, давление аргона (CID gas) – 1 мТорр. Определяемые переходы и дополнительные параметры представлены в таблице 1. Для количественного определения использовался переход m/z 71.1 Да → 41 Да.

Таблица 1

Условия определения переходов прекурсор-продукт малонового диальдегида

Соединение Прекурсор (m/z) Продукт (m/z) Энергия столкновения (V) Фрагментация источника (V) Напряжение линз (V) MDA41* 71.1 41 27 10 35 MDA43 71.1 43 9 10 35 MDA53 71.1 53.2 6 10 35

Объём вводимой пробы 5 мкл, время удерживания при указанных условиях составляет 3,05 мин. Общее время анализа равно 7 мин.

Для валидации методики использовали калибровочные стандарты, которые представляли собой образцы холостой среды культивирования клеток с добавлением матричного раствора малонового диальдегида до получения растворов с концентрацией 600, 1000, 2000, 6000, 10000, 16000 и 20000 нмоль/л.

Для приготовления матричного раствора 1 мг тетрабутиламмониевой соли малонового диальдегида растворяли в 1 мл метанола для получения раствора 1 мг/мл, после чего 100 мкл раствора разбавляли с 900 мкл воды деионизированной для получения концентрации 100 мкг/мл (стандартный раствор), что эквивалентно 320 мкМ малонового диальдегида в растворе. Матричный и стандартный растворы хранили при температуре -80°С.

Биоаналитическая методика была валидирована согласно Руководству по экспертизе лекарственных средств (Том I), правилам проведения исследований биоэквивалентности лекарственных препаратов в рамках Евразийского экономического союза 2016; руководству FDA Guidance for Industry: Bioanalytical method validation (U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center of Drug Evolution and Research (CDER), 2018), а также положениям EMA Guideline on bioanalytical method validation (European Medicines Agency. Committee for medicinal products for human use: London, 2011) по параметрам:

- селективность;

- линейность;

- нижний предел количественного определения;

- точность (внутрицикловая и межцикловая);

- прецизионность;

- перенос пробы;

- стабильность образцов;

- матричный эффект.

Результаты валидации

Селективность. Анализ пробы среды культивирования клеток без добавления раствора малонового диальдегида показал отсутствие хроматографических пиков на времени удерживания, соответствующем аналиту.

Предел обнаружения. По данной методике пределом обнаружения является концентрация малонового диальдегида 200 нмоль/л, при этом отношение сигнала к шуму составляет не менее 3.

Нижний предел количественного определения (НПКО). В описанных ранее условиях хроматографирования и детектирования уровень НПКО составляет 600 нмоль/л. При данной концентрации на хроматограмме отношение сигнала к шуму больше 10, а точность и прецизионность ниже 20%, что соответствует современным требованиям.

Калибровочная кривая. Анализировали 7 образцов среды культивирования клеток с добавлением матричного раствора малонового диальдегида до получения растворов с концентрацией 600, 1000, 2000, 6000, 10000, 16000 и 20000 нмоль/л. Полученные с данных растворов хроматограммы были использованы для построения калибровочных графиков зависимости концентрации малонового диальдегида от площади пика. В результате было получено 3 уравнения линейной регрессии:

Y = -17,1959 + 31,9356*X, R² = 0,9971;

Y = -17,0241 + 33,4093*X, R² = 0,9966;

Y = -19,429 + 32,6500*X, R² = 0,9968.

Для построения графиков принималось значение веса концентраций 1/Х для более точного построения кривой в области низких концентраций в выбранном аналитическом диапазоне. Рассчитанные коэффициенты корреляции соответствовали принятой норме (не менее 0,99). Отклонения концентраций калибровочных растворов от номинального значения приведены в табл. 2.

Таблица 2

Отклонения концентраций малонового диальдегида в калибровочных образцах от их номинальных значений

Концентрация номинальная, нмоль/л
График 1 График 2 График 3 Концентрация рассчитанная, нмоль/л Точность % Концентрация рассчитанная, нмоль/л Точность, % Концентрация рассчитанная, нмоль/л Точность, % 600 592 1,33 556 7,33 675 12,50 1000 1035 3,50 1069 6,90 1092 9,20 2000 1881 5,95 1830 8,50 1651 17,45 6000 6578 9,63 6570 9,50 5694 5,10 10000 9262 7,38 10214 2,14 9666 3,34 16000 16250 1,56 16385 2,41 16059 0,37 20000 20002 0,01 18976 5,12 20762 3,81

Точность и прецизионность. Для оценки данных параметров выполняли анализ образцов среды культивирования клеток с добавлением МДА до концентраций 600, 2000 и 16000 нмоль/л. Анализ проводили в трёх циклах, в ходе первого из которых определяли внутрицикловую точность и воспроизводимость, а в рамках второго и третьего – межцикловую. Для определения внутрицикловых параметров анализировали по 5 образцов каждой концентрации малонового диальдегида. Результаты данного теста представлены в табл. 3. Значения межцикловых параметров представлены в табл. 4. Полученные величины точности и прецизионности соответствовали принятым нормам (не более 20% для нижнего предела количественного определения и не более 15% для остальных точек).

Таблица 3

Точность и прецизионность методик количественного определения малонового диальдегида в среде культивирования клеток внутри аналитического цикла

Концентрация номинальная, нмоль/л Концентрация рассчитанная, нмоль/л Точность, % Средняя концентрация, нмоль/л Средняя точность, % SD Прецизионность, % 600 713 18,83 654 9,00 63,98 9,78 717 19,50 663 10,50 600 0,00 577 3,83 2000 2067 3,35 2071 3,53 171,86 8,29 2209 10,45 1834 8,30 2259 12,95 1984 0,80 16000 15655 2,16 16236 1,47 599,88 3,69 17197 7,48 16392 2,45 16040 0,25 15896 0,65

Таблица 4

Точность и прецизионность методик количественного определения малонового диальдегида в среде культивирования клеток между аналитическими циклами

Концентрация номинальная, нмоль/л Концентрация рассчитанная, нмоль/л Точность, % Средняя концентрация, нмоль/л Средняя точность, % SD Прецизионность, % 600 703 17,17 615 2,5 76,12 12,37 577 3,83 566 5,67 2000 2259 12,95 2103 5,15 141,05 6,7 1984 0,80 2067 3,35 16000 16040 0,25 15803 1,23 294,72 1,86 15473 3,29 15896 0,65

Стабильность. Стабильность стандартного раствора малонового диальдегида анализировалась при его хранении при -80 ^°С в течение 30 сут. Стабильность растворов малонового диальдгида в концентрациях 600 и 16000 нмоль/л в среде культивирования клеток оценивалась при краткосрочном хранении в условиях комнатной температуры, трехкратном цикле заморозки-разморозки при -80 ^°С, при хранении при -80 ^°С в течение 60 сут, после пробоподготовки и нахождении в течение 24 ч в автосемплере. Анализировали по 3 образца для как каждой концентрации и каждого вида стабильности.

Правильность для каждой концентрации (для средних значений) находилась в пределах 15% от номинальных значений.

Матричный эффект. Определяли площади пиков образцов с добавлением исследуемого вещества (МДА) в концентрациях 600 и 16000 нмоль/л в присутствии среды культивирования клеток (матрицы) и чистого раствора МДА в такой же концентрации в отсутствие матрицы. Относительное стандартное отклонение матричного эффекта, рассчитанное для серии из 6 образцов, не превысило 15%.

Перенос пробы. При последовательном анализе пробы холостой среды культивирования клеток после пробы с концентрацией 20000 нмоль/л на хроматограмме среды культивирования клеток отсутствовали пики, соответствующие по времени удерживания пику МДА.

Таким образом, разработанная биоаналитическая методика является чувствительной, селективной, точной, прецизионной и может быть использована для количественной оценки МДА в среде культивирования клеток.

Настоящий способ определения МДА был применен для исследования окислительного стресса в 10 экспериментах in vitro на линии клеток Caco-2.

Изобретение относится к области аналитической химии. Раскрыт способ количественного определения малонового диальдегида в среде культивирования клеток, представляющей собой раствор Хэнкса после инкубирования с клетками линии Caco-2 в течение 3 часов, включающий применение метода ВЭЖХ-МC/МС, отличающийся проведением пробоподготовки путём смешивания 10 мкл пробы среды культивирования клеток с 90 мкл ацетонитрила, последующим встряхиванием в течение 10 мин и дальнейшим центрифугированием пробы при 10000g в течение 10 мин при температуре +4°С с последующим вколом 5 мкл пробы с применением автосемплера и хроматографированием на колонке UCT Selectra C18 4,6 mm×100 mm, 3um, 100 A с предколонкой Selectra C18 Guard Cartridges SLC-18GDC46-3UM при температуре колонки 35°С, в изократическом режиме элюирования со скоростью потока 300 мкл/мин, с применением подвижной фазы, состоящей из 20% ацетонитрила и 80% водного раствора формиата аммония с концентрацией 10 ммоль/л, при этом ионизацию проводят путем формирования электроспрея в негативном режиме при атмосферном давлении, применяют напряжение электроспрея 2700 В, оболочечный газ 50 arb, вспомогательный газ 10 arb, продувочный газ 1 arb, температуру испарителя 350°С, ион-транспортирующей трубки 300°С и используют режим MRM m/z 71.1 Да → 41 Да при давлении аргона 1 мТорр. Изобретение обеспечивает разработку чувствительного, селективного, точного, прецизионного способа количественного определения МДА в среде культивирования клеток. 4 табл.

Способ количественного определения малонового диальдегида в среде культивирования клеток, представляющей собой раствор Хэнкса после инкубирования с клетками линии Caco-2 в течение 3 часов, включающий применение метода ВЭЖХ-МC/МС, отличающийся проведением пробоподготовки путём смешивания 10 мкл пробы среды культивирования клеток с 90 мкл ацетонитрила, последующим встряхиванием в течение 10 мин и дальнейшим центрифугированием пробы при 10000g в течение 10 мин при температуре +4°С с последующим вколом 5 мкл пробы с применением автосемплера и хроматографированием на колонке UCT Selectra C18 4,6 mm×100 mm, 3 um, 100 A с предколонкой Selectra C18 Guard Cartridges SLC-18GDC46-3UM при температуре колонки 35°С в изократическом режиме элюирования со скоростью потока 300 мкл/мин, с применением подвижной фазы, состоящей из 20% ацетонитрила и 80% водного раствора формиата аммония с концентрацией 10 ммоль/л, при этом ионизацию проводят путем формирования электроспрея в негативном режиме при атмосферном давлении, применяют напряжение электроспрея 2700 В, оболочечный газ 50 arb, вспомогательный газ 10 arb, продувочный газ 1 arb, температуру испарителя 350°С, ион-транспортирующей трубки 300°С и используют режим MRM m/z 71.1 Да → 41 Да при давлении аргона 1 мТорр.