Лабораторный способ определения пола птиц по экспрессии гена Ribocomal Protein S6 Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 A01K43/00 G01N33/53 

Предлагаемое изобретение относится к области молекулярной биологии и генной инженерии. Более детально, предполагаемое изобретение относится к лабораторному способу определения пола различных видов птиц путем исследования яиц.

Далее заявителем представлены термины и/или определения, использованные в заявочных материалах.

BLAST - Basic Local Alignment Search Tool - алгоритм для сравнения биологический последовательностей.

BWA - Burrows-Wheeler Aligner - программный пакет для картирования коротких прочтений на большие референсные геномы.

CAGE - Cap Analysis of Gene Expression - кэп анализ экспрессии генов.

CDS - coding DNA sequence - кодирующая последовательность ДНК.

CHD - Chromo-helicase-DNA binding - белок семейства класса гидролаз, регулирует структуру хроматина.

DMRT1 - Doublesex and mab-3 related transcription factor 1 - фактор транскрипции, регулирует зародышевые клетки и клетки Сертоли.

HINTW - histidine triad nucleotide binding protein, W-linker - белки, связывающие нуклеотиды.

HH стадии - стадии развития эмбриона по Гамбургеру-Гамильтону.

HH36 - это середина эмбриогенеза развития гонад птиц.

PCA - principal component analysis - анализ основных компонент.

RPS6 - Ribosomal Protein S6 - рибосомальный белок.

TSS - Transcription star site - сайт начала транскрипции.

Разработанной способ в целом нацелен на определение пола птиц посредством определения уровня экспрессии гена RPS6 (по уровню содержания РНК гена RPS6 или концентраций соответствующего белка) и сравнения выявленного уровня экспрессии с диапазонами значений, установленными для особей разного пола животных разного пола у птиц разных видов и разных возрастов с использованием известных как таковых технологий.

На дату представления заявочных материалов в мире существует насущная потребность в области птицеводства - т.к. существующие технологии на дату представления заявочных материалов определения пола птиц имеют существенные недостатки, связанные как с низкой технологичностью при использовании так и высокими материально-трудовыми заттратами. Например, эндоскопические способы исчерпали возможности улучшения и не удовлетворяют потребностей общества по ряду причин, а именно - по сложности, дороговизне и применимости к узкому кругу видов.

Известно, что определение пола у яиц птиц и также молодых птиц по морфологическим признакам для большинства видов абсолютно невозможно. Более того, взрослые особи половины видов также не показывают никаких морфологических различий между взрослыми самцами и взрослыми самками, или они находятся на уровне настолько низком, что исключается надежное определение пола. Кроме того, несмотря на возможность определения пола по морфологии для некоторых видов, данный процесс характеризуется высокой трудоемкостью и требует высококвалифицированных операторов и, как правило, является стрессовым фактором для животных.

Разработанный способ универсален и позволяет определить пол животного по любому образцу биологических тканей (включая образцы из яйца), а также по культуре тканей, полученной из птиц.

Разработанный способ позволяет определить пол разных видов птиц по образцу биологических тканей зародыша в яйце.

Разработанное техническое решение в целом нацелено на создание неизвестного из исследованного уровня техники способа определения экспрессии гена RPS6. Разработанная биотехнология предполагает использование известных из уровня техники как таковых методов молекулярной биологии, используемых для определения уровня экспрессии гена RPS6. Краткой сущностью предлагаемого способа является определение уровня экспрессии гена RPS6 (Ribocomal Protein S6), и сравнения выявленного уровня экспрессии с диапазонами значений, установленными для особей разного пола у птиц разных видов и разных возрастов.

Из известного уровня техники известно, что ген RPS6 универсален для разных видов птиц, как птиц сельскохозяйственного назначения, так и для экзотических птиц.

Данный ген экспрессируется у различных групп птиц, имеет повышенную экспрессию в мужских особях, по сравнению с женскими, и остается неизменным на протяжении всей жизни птицы, в том числе и на стадиях развития, предшествующих появлению морфологически определяемых половых различий. В целом, экспрессия данного гена у самцов примерно в два раза выше, чем у самок, и максимальна у обоих полов в течение первой и половины второй недели после вылупления.

Последовательность гена RPS6 чрезвычайно консервативна, что при использовании широко применяемого стандартного метода количественной полимеразной цепной реакции позволяет использовать одни и те же материалы, включая используемые в реакции фрагменты ДНК с определенной последовательностью (праймеры), что обеспечивает значительное удешевления самого подхода определения пола птиц. Важным достоинством заявленного способа является его применимость в отношении исследованного круга видов птиц, при этом заявленный способ может быть применен и к биотехнологически перспективной группе бескилевых птиц (таких как эму).

Известно изобретение по патенту RU 2681536 «Определение пола, жизнеспособности и/или стадий развития птичьих эмбрионов в яйце». Сущностью является способ контролирования инкубации для получения выборки яиц путем определения пола, и/или стадии развития, и/или жизнеспособности птичьего эмбриона в яйце, включающий (a) определение по меньшей мере первого маркера пола, выбранного из глюкозы, холина и/или валина, и/или определение по меньшей мере первого маркера развития, выбранного из триметилглицина, аспартата, аргинина, глутамата, глутамина и пролина в яйце в период времени от начала инкубирования яйца до вылупления; (b) измерение количества по меньшей мере первого определенного маркера пола и/или по меньшей мере первого маркера развития, и (c) сравнение этого количества с базовым значением, установленным для мужского и женского эмбриона, стадии развития эмбриона, и/или живого и умершего или неразвившегося эмбриона, для определения, является ли эмбрион мужским и/или женским, и/или стадии развития эмбриона, и/или является ли эмбрион жизнеспособным.

Недостатком известного технического решения является низкая точность. Согласно описанию, а именно - таблице 1, для трех маркеров определения пола (глюкоза, холин, валин), средние значения со стандартными отклонениями для женских особей составляют: 51±17,7, 125,8±21,4 и 23,7±4,09 и для мужских особей: 32,2±10,5, 101,3±21,1 и 28,6±3,63. Диапазоны значений для мужских и женских особей у всех трех предложенных маркеров пересекаются на 9,4, 18 и 2,82 единиц, соответственно. Доля особей с неправильно определенным полом для каждого пола будет рассчитываться исходя из формулы 0,5 -(1-(SDп/C))*k, где SDп - стандартное отклонение для данного пола, С - пересечение стандартных отклонений для двух полов, k - коэффициент, отражающий долю особей с отклонением значения показателя от среднего значения не более наблюдаемого, в зависимости от стандартного отклонения для популяции с нормальным распределением показателей. Суммируя данные значения для обоих полов, доля особей с неправильно определенным полом по известному способу составляет около 39%.

Известна заявка на изобретение RU 2011141499 «Способ определения пола птиц». Сущностью является способ определения пола эмбриона в птичьем яйце перед вылупливанием, включающий стадии a. введения в яйцо антитела, предназначенного для соответствия специфическому для пола антигену на эмбрионе, причем антитело является меченым, b. предоставления возможности меченому антителу мигрировать к специфическому для пола антигену на эмбрионе и связаться с ним, c. выявления связывания меченых антител на эмбрионе с использованием средств выявления, расположенных снаружи яйца. Способ по п. 1, где специфический для пола антиген на эмбрионе выбран из группы W-специфических генных/белковых экспрессий, в частности CHD1W, ATP5A1W, Spin-W, ASW, и наиболее предпочтительно FET-1 (женский экспрессированный транскрипт; трансмембранный домен) или из ZZ-специфической генной/белковой экспрессии; в частности DMRT1, SF1 и Dax1, или из косвенно экспрессированных специфических для пола белков, в частности AMH (анти-Мюллеровского гормона).

Недостатком известного технического решения является необходимость использования уникального оборудования для детекции меток в яйце, и необходимость использования такого дорогостоящего компонента, как специфические для определенного вида и пола птиц меченые антитела, что приводит к высокой стоимости метода, а также ограниченная применимость - способ не применим к бескилевым птицам.

Известно изобретение по патенту RU 2756447 «Способ и система для неразрушающего in ovo определения пола птиц», сущность является способ неразрушающей идентификации половой характеристики эмбриона Gallus gallus domesticus in ovo, включающий: (a) получение образца материала, ассоциированного с яйцом, содержащим эмбрион, и (b) измерение значения оценки на наличие и концентрацию по меньшей мере первого биомаркера в образце, указывающего на половую характеристику эмбриона, и (c) применение порога к значению оценки и концентрации, полученным на стадии (b), для идентификации половой характеристики эмбриона, ассоциированной с наличием и концентрацией первого биомаркера, при этом первый биомаркер содержит аминосоединение, имеющее молекулярную массу в диапазоне от 150 до 170 г/моль; при этом стадия (c) дополнительно включает: (i) корреляцию каждого соответствующего сигнала биомаркера с эталонным биомаркером путем сопоставления спектра каждого корреляционного сигнала с ожидаемым спектром корреляционного эталонного биомаркера с использованием меры подобия для определения по меньшей мере одного положительно корреляционного сигнала; (ii) измерение интенсивности каждого положительно корреляционного сигнала и оценки его абсолютной и/или относительной интенсивности сигнала; и (iii) применение порога к значению оценки, полученной из функции подобия, для определения коррелированной характеристики эмбриона; причем первым биомаркером является 3-[(2-аминоэтил)сульфанил]бутановая кислота, а концентрация первого биомаркера составляющая 50 нг/мл или больше, в аллантоисной жидкости эмбриона в дни 7, 8 или 9 коррелирует с эмбрионом женского пола, тогда как наличие первого биомаркера, присутствующего при менее чем 50 нг/мл, коррелирует с эмбрионом мужского пола.

Недостатками известного способа являются необходимость использования специфического и чрезвычайно дорогостоящего метода масс-спектрометрии, причем разница в метаболическом профиле у птиц разных видов с одной стороны, делает его неприменимым для части видов птиц, а с другой, делает необходимым проведение исследований с использованием масс-спектрометрии для каждого вида птиц.

Из уровня техники известен источник [Kaewhom P, Srikijkasemwat K. Efficacy of two primer sets used in the sex identification of rufous-winged buzzard (Butastur liventer). Open Vet J. 2021 Oct-Dec; 11(4): 581-586. doi: 10.5455/OVJ.2021.v11.i4.7] (Эффективность двух наборов праймеров, используемых для определения пола у краснокрылых канюков (Butastur liventer). Способ предполагает определение пола у канюков и других птиц путем определения длины фрагмента гена CHD.

Недостатками известного способа является отсутствие данного гена у значительной доли птиц и его высокая вариабельность у разных видов, что требует проведения исследовательских работ в отношении каждого вида, снижает надежность идентификации и удорожает данный анализ.

Из уровня техники известен источник [Kalpana D. Acharya, Sean L. Veney. Sexually dimorphic expression and estradiol mediated up-regulation of a sex-linked ribosomal gene RPS6, in the zebra finch brain. Developmental Neurobiology, 2013, March, Vol. 73, Issue 8 p. 599-608] (Половая диморфная экспрессия, связанная с повышением регуляции эстрадиола сцепленного с полом рибосомного гена RPS6 в мозгу зебрового вьюрка). Сущностью новый связанный с Z-хромосомой рибосомный ген - RPS6 (Ribosomal Protein S6), который имеет повышенную экспрессию в мозге мужских особей, по сравнению с женскими, на протяжении всей жизни, особенно в стадии развития, предшествующие появлению морфологически определяемых половых различий (Acharya, Veney, 2013). В целом, экспрессия у самцов примерно в два раза выше, чем у самок, и максимальна у обоих полов в течение первой и половины второй недели после вылупления.

Недостаткамиизвестного технического решения являются определение экспрессии гена RPS6 в клетках мозга зебрового вьюрка, по сравнению с заявленным техническом решением,где оценивали потенциальный маркер пола на шести видах птиц: курице (Gallus gallus), индейке (Meleagris gallopavo), утке (Anasplatyrhynchos), эму (Dromaius novaehollandiae), павлине (Pavo cristatus) и японском перепеле (Coturnix japonica).

Из уровня техники известен источник [SmithCA, RoeszlerKN, HudsonQJ, SinclairAH.Aviansexdetermination: what, whenandwhere? CytogenetGenomeRes. 2007;117(1-4):165-73. doi: 10.1159/000103177](Определение пола птиц: что, где, когда?), по совокупности совпадающих признаков наиболее близкое к заявляемому техническому решению.Cущность известного способа заключается в определении пола кур и иных птиц по определению уровня экспрессии генов HINTW или DMRT1.

Недостатками известного технического решения являются разница в уровне экспрессии генов в разных тканях, и отсутствие данных генов у многих видов птиц, что снижает применимость данного метода.

Техническим результатом заявленного технического решенияявляется создание способа определения пола птиц путём определения уровня экспрессии гена RPS6 (Ribocomal Protein S6).

Сущностью заявленного технического решения являетсялабораторный способ определения пола птиц по экспрессии гена Ribocomal Protein S6, заключающийся в том, что получают эмбрионы разных видов птиц путём доведения до стандартной стадии развития эмбриона HH36, получают клетки эмбриональных фибробластов, культивируют полученные клетки в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы и среде DMEM/F12 для контроля вариации экспрессии, связанной со средой для достижения гомогенности при выделении РНК, из полученных культур клеток выделяют РНК, которые используют для приготовления библиотеки наборов фрагментов ДНК для определения последовательности РНК, определяют последовательность индивидуальных молекул РНК в полученных образцах РНК путём секвенирования приготовленных библиотек, проверяют качество полученных данных о последовательности РНК в библиотеках CAGE, получают данные об экспрессии генов в полученных образцах РНК, на основе полученных выравниваний определяют координаты ДНК, на которых начинают считываться индивидуальные молекулы РНК и получают данные о частоте использования тех или иных CTSS, строят генные модели для сборки; РНК, выделенную из фибробластов, используют для получения комплементарной ДНК, подбирают условия для проведения ПЦР в реальном времени, осуществляют серию ПЦР в реальном времени, используя в качестве матрицы комплементарную ДНК из образцов клеток эмбриональных фибробластов птиц, определяют эффективность праймеров в серии разведений ДНК и отбирают наиболее эффективные праймеры, по данным уровня экспрессии гена RPS6, определённого с помощью наиболее эффективных праймеров из использованных, определяют диапазоны экспрессии гена RPS6 для птиц разных полов у разных видов,благодаря разнице в уровне экспрессии гена RPS6 между птицами разных полов делают вывод о принадлежности птицы к мужскому или женскому полу соответственно.

Заявленное техническое решение иллюстрируется Фиг. 1 – Фиг. 3.

Фиг. 1 – Уровни экспрессии гена RPS6 в образцах, полученных из мужских и женских особях, в домашней курице, перепеле, индейке, синем павлине, утке, зебровом амадине и эму, определённые методом CAGE.

Фиг. 2 – Эффективность праймеров в серии реакций.

Фиг. 3 – Уровни экспрессии гена RPS6 в образцах из особей разных полов у курицы, утки, зебрового амадина и эму, определённые методом ПЦР в реальном времени. По оси ординат – уровень экспрессии гена RPS6, относительно уровня экспрессии контрольного гена ARPP19.

Далее заявителем приведено описание заявленного технического решения.

Заявленныйтехнический результат достигается тем, что в образцах тканей птиц или их биологических жидкостей определяется экспрессия гена RPS6 с последовательностью 1 и его вариантов в других видах птиц со сходством к последовательности 1, равном 78,02%. Уровень экспрессии гена RPS6 определяютизвестными методами, например – по содержанию в образцах РНК гена RPS6 или по содержанию соответствующего ему белка. Выявленный уровень экспрессии сравнивают с диапазонами значений, установленными для особей разного пола, c учётом вида и возраста птиц, а также типа использованных образцов тканей.

Далее заявителем представлены примеры конкретного выполнения заявленного технического решения.

Пример 1 ,демонстрирующий применимость заявленного способа для определения пола птиц различных видов (в том числе бескилевых) по уровню экспрессии гена RPS6, определяемому с использованием технологии CAGE.

1 - Получают эмбрионы разных видов птиц, например - курицы, перепела, индейки, синего павлина, утки, зебрового амадина и эму, например - путем инкубирования при 38,5°C до стадии, соответствующей стандартной стадии развития эмбриона HH36 для курицы.

2 - Получают образцы тканей и клеток, например способом, описанным ниже. У полученных эмбрионов производят резекцию головы и шеи, конечностей, кожи и жировых отложений, а также внутренних органов.

3 - Обрабатывают оставшуюся часть туловища трипсином при температуре 37°C с последующей нейтрализацией и центрифугированием для получения осадка.

4 - Ресуспендируют осадок очищенных эмбриональных фибробластов.

5 - Для подтверждения получаемых данных по определению пола, оценивают пол выделенных эмбрионов по размеру гонад и у каждого вида для выделения фибробластов собирали не менее трех эмбрионов (включая как самцов, так и самок, по одному эмбриону на образец).

6 - Культивируют полученные клетки в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы и среде DMEM/F12 для контроля вариации экспрессии, связанной со средой для достижения гомогенности при выделении РНК.

7 - После культивации культур клеток стандартным способом и пяти пассажей (пересевов) в течение не более чем пяти недель из полученных культур клеток выделяют РНК, например - стандартным способом с использованием коммерческого набора реагентов (Trizol, Invitrogen), в соответствии с инструкцией производителя.

8 - Используют РНК из каждого образца для приготовления библиотеки (наборы фрагментов ДНК) для определения последовательности РНК, например - известным методом CAGE секвенирования, стандартным способом в соответствии с инструкцией производителя набора для подготовки к секвенированию.

9 - Определяют последовательность индивидуальных молекул РНК в полученных образцах РНК путем секвенирования (определения последовательности) приготовленных библиотек, например - стандартным способом, с использованием платформы Illumina HiSeq2500, в соответствии с инструкцией производителя набора для секвенирования.

10 - Проверяют качество полученных данных о последовательности РНК в библиотеках CAGE, например, с помощью программы FastQC v0.11.5.

11 - Получают данные об экспрессии генов в полученных образца РНК, например, путем обработки полученных данных способом описанным ниже (п. 11-13). Обрезают полученные чтения с помощью программы fastx_trimmer -Q33 -l 75 (FASTX Toolkit 0.0.14). Стандартную программу (скрипт) Moirai removeN применяют для удаления прочтений с неизвестной последовательностью. Считывания CAGE, совпадающие с адаптерами (фрагментами ДНК со стандартными последовательностями, используемыми для секвенирования) или рибосомальной РНК, удаляют с помощью Trimmomatic-0,38 и RNAdust 1,06. Чтения CAGE, обработанные в соответствии с описанием выше, выравнивают с помощью программы BWA 0.7.10-r789, а оставшиеся (не выровненные) чтения выравнивают далее с использованием программы Hisat2 v2.1.0 по следующим эталонным сборкам: курица - galGal6 (GCF_000002315.6), перепел - Coturnix_japonica_2.1 (GCF_001577835.2), индейка - melGal5 (GCF_000146605.3), индейка - MGAL_WU_HG_1.0 (GCA_905368555.1), павлин - GT_SO_6221 (http://gigadb.org/dataset/100559), утка - ZJU1.0 (GCF_015476345.1), зебровый вьюрок - bTaeGut2.pat .W.v2 (GCF_008822105.2), эму - droNov1 (GCF_003342905.1), эму - ZJU1.0 (GCA_016128335.1).

12 - На основе полученных выравниваний определяют координаты ДНК, на которых начинают считываться индивидуальные молекулы РНК (CTSS, сайты начала транскрипции CAGE) и получают данные о частоте использования тех или иных CTSS в виде пиков CAGE с использованием программы PromoterPipeline с порогом по умолчанию не менее 10 TPM (меток на миллион) как минимум в одном из образцов. Определяют, с какими генами связаны полученные пики, с использованием пакета ChIPseeker v1.32.0 для программной среды R.

13 - Строят генные модели для сборки MGAL_WU_HG_1.0 с использованием программы Augustus v3.2.3 с опцией --species=chicken и подсказками на основе EST и мРНК. При этом используют области CAGE-пиков размером 2 тысяч пар нуклеотидов, расположенные в пределах 100 пар нуклеотидов от начала транскрипта, в качестве обучающего набора для программы TSSClassifier, а оставшиеся далеко удаленные (дистальные) межгенные, интронные, экзонные, и расположенные в нетранслируемых областях генов пики CAGE анализируют и классифицируют на «промоторы» или «не-промоторы». Для остальной части анализа используют только локализованные пики промоторной области (в пределах 3 тысяч пар нуклеотидов) или другие пики TSS, классифицированные как «промотор». Анализ дифференциальной экспрессии проводят с использованием пакета edgeR v3.38.1 для программной среды R отдельно для каждого вида птиц по подсчетам TPM с использованием подхода обобщенных линейных моделей. Проверяют правильность проведенных расчетов с помощью межвидового сравнения, в котором используют модифицированное преобразование, стабилизирующее дисперсию.

Вывод.

По полученным данным, ген RPS6 обладает уникальными характеристиками с точки зрения возможности его использования для определения поля птиц. Последовательность гена RPS6, обобщающая его варианты для использованных видов птиц (консенсусная последовательность), приведена на последовательности 2. Данный ген высоко экспрессирован в образцах тканей птиц различных видов, что облегчает его детекцию. У всех использованных видов птиц уровень экспрессии данного гена значительно отличается между особями разных полов, то есть данный ген обладает универсальным половым диморфизмом у всех семи видов [Фиг. 1]. Полученные данные указывают на то, что ген RPS6 экспрессировался по мужской линии у всех видов птиц. В случае всех семи видов, в том числе - в случае бескилевой птицы эму, разница в экспрессии данного гена между особями разных полов была настолько значительной, что возможность неправильной идентификации пола исключается [Фиг. 1]. Проведенный поиск аналогов гена RPS6 среди всех известных последовательностей генов птиц в базе данных NCBI свидетельствует, что известные на момент подачи заявки на изобретение варианты гена RPS6 в различных видах птиц (включая бескилевых) имеют сходство 78.02% и выше. Таким образом, для определения пола птиц может быть использован ген RPS6 (ribosomal protein S6, рибосомный белок S6) с последовательностью 1 и его варианты в других видах птиц, со сходством последовательности 78.02%. Поскольку из уровня техники известно [Molecular Biology of the Cell. Fourth Edition // B. Alberts, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, P. Walter (eds). New York: Garland Science ,2002. 1463 p.], что уровень экспрессии гена может быть определен по уровню содержания белка, соответствующего гену, уровень экспрессии гена RPS6 для определения пола птиц в соответствии с разработанным способом, может быть определен по уровню содержания белков, соответствующих гену RPS6 с последовательностью 1, и вариантам гена RPS6 в других видах птиц со сходством к последовательности 1, равным 78.02% и выше. Поскольку из уровня техники известно, что состав биологических жидкостей, например - аллантоисной жидкости яйца, отбираемой известным способом без потери жизнеспособности яйца по патенту RU 2756447, отличается у особей различных полов, разработанный способ может применяться для определения пола птиц в яйце (in ovo). Это связано с тем, что из уровня техники известно также, что ген RPS6 экспрессируется во всех тканях птиц [Национальный центр биотехнологической информации, интернет-ресурс. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/].

Пример 2 , демонстрирующий применимость разработанного способа для определения пола птиц различных видов (в том числе бескилевых) по уровню экспрессии гена RPS6, определяемому с использованием метода ПЦР в реальном времени.

1 - РНК, выделенную из фибробластов курицы, утки, зебрового амадина и эму, используют для получения комплементарной ДНК (ДНК, считанной с РНК и соответствующей РНК по своей последовательности), например - с помощью набора SuperScript III Reverse Transcriptase (Thermo Fisher).

2 - Подбирают условия для проведения ПЦР в реальном времени, например - способом, описанным далее. Осуществляют серию реакций ПЦР в реальном времени, используя в качестве матрицы комплементарную ДНК из образцов тканей птиц семи видов, полученную в соответствии с описанием выше. В реакциях используют серию десятикратных разведений комплементарной ДНК в концентрациях от 1:10 до 1:10000 и праймеры (короткие фрагменты ДНК) на различные фрагменты гена RPS6, например - с последовательностью в соответствии с последовательностью 2 (I-IV). В силу консервативности последовательности гена RPS6, данные праймеры подходят для определения уровня экспрессии гена RPS6 во всех семи видах птиц. В качестве контрольных генов, относительно которых определяют уровень экспрессии гена RPS6, используют любые гены, применимые для этой цели в силу меньшей, по сравнению с RPS6, вариабельности экспрессии, например - гены YWHAE и ARPP19, для которых используют подходящие для них праймеры, например - с последовательностью 2 (V-VIII).

3 - Определяют эффективность праймеров в серии разведений ДНК и отбирают наиболее эффективные праймеры, обеспечивающие максимальный уровень флуоресцентного сигнала после проведения реакции и наиболее высокий уровень корреляции полученного сигнала с концентрацией комплементарной ДНК в серии разведений (Фиг. 2).

4 - По данным уровня экспрессии гена RPS6, определенного с помощью наиболее эффективных праймеров из использованных, определяют диапазоны экспрессии гена RPS6 для птиц разных полов у разных видов, с использованием любых применимых статистических величин, например - арифметического среднего и стандартного отклонения (Фиг. 3). Значительная разница в уровне экспрессии гена RPS6 между птицами разных полов, успешно детектированная во всех семи использованных видах птиц и позволяющая определить пол (в том числе - в случае бескилевой птице эму) с использованием метода ПЦР в реальном времени, демонстрирует применимость разработанного способа для определения пола птиц, вне зависимости от способа определения уровня экспрессии гена RPS6.

На основании изложенного выше можно сделать вывод, что заявителем достигнут заявленный технический результат, а именно - создан способ определения пола бескилевых и килевых птиц путем определения уровня экспрессии гена RPS6.

Заявленное техническое решение удовлетворяет критерию «новизна», предъявляемому к изобретениям, так как при определении уровня техники не выявлены средства, которым присущи признаки, идентичные (то есть совпадающие по исполняемой ими функции и форме выполнения этих признаков) всем признакам, перечисленным в формуле предполагаемого изобретения, включая характеристику назначения.

Заявленное техническое решение удовлетворяет критерию «изобретательский уровень», т.к. не является очевидным для специалиста в данной области техники и из исследованного уровня техники заявителем не выявлены технические решения, совпадающие по технической сущности с предлагаемым решением, и не установлена известность влияния отличительных признаков на полученный технический результат.

Приложение

--->

Перечень последовательностей

SEQUENCE LISTING

SEQ ID NO: 1

<110> федеральное государственное автономное образовательное

учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный

университет" (ФГАОУ ВО КФУ)) (federalnoe gosudarstvennoe avtonomnoe

obrazovatelnoe uchrezhdenie vysshego obrazovaniya "Kazanskij

(Privolzhskij) federalnyj universitet" (FGAOU VO KFU))

<120> Лабораторный способ определения пола птиц по экспрессии гена

Ribocomal Protein S6

<160> 1

<210> 1

<211> 892

<212> RNA

<213> Gallus gallus ribosomal protein S6

<400> 1

>NM_205225.2-chicken-RPS6 Gallus gallus ribosomal protein S6 (RPS6),

mRNA

CGGCGCAGTTCGGCGAGGATGAAGCTCAACATCTCTTTCCCAGCCACTGGCTGCCAGAG

CTTATTGAAGTGGATGATGAGCGCAACGTGAGAACATTCTATGAGAAGCGAATGGCCACG

GAGGTTGCGGCTGATTCTCTTGGCGAGGAGTGGAAGGGCTATGTTGTCCGGATCAGTGGT

GGCAATGATAAACAAGGCTTCCCCATGAAGCAGGGTGTCCTTACTCATGGACGTGTCCGC

CTTCTGCTCAGCAAAGGCCACTCCTGCTACCGCCCCAGGAGAACTGGAGAGAGAAAACGC

AAGTCTGTTCGGGGTTGCATTGTTGACGCCAACTTGAGTGTTCTGAACTTGGTCATTGTG

AAAAAGGGTGAGAAGGATATTCCTGGGCTGACAGACACAACTGTGCCTCGTCGTCTTGGT

CCCAAGAGAGCTAGCAGGATCCGCAAGCTGTTCAATCTCTCTAAGGAAGATGATGTTCGC

CAGTATGTTGTGAGGAAACCTCTGAATAAAGAGGGCAAGAAACCCAGGACCAAGGCTCCT

AAGATCCAGCGACTAGTGACTCCTCGTGTTCTGCAACATAAGCGCAGACGTATTGCCCTG

AAGAAGCAGCGCACTCAGAAGAACAAGGAGGAGGCAGCAGATTACGCGAAGCTCTTGGCA

AAGAGAATGAAGGAGGCCAAGGAAAAACGCCAGGAGCAGATTGCGAAGAGACGCAGGCTT

TCTTCATTGAGAGCTTCTACATCTAAATCTGAGTCAAGTCAGAAGTAAAGATGTACATGA

TACTGAAAATAAAACCCTTTTGTGGTTAAATTTTACTGTGAGACTTCCAGTGAATATATT

TCCTGGCTATGTCTTAAAATAAATGGTAGTCCAGACTAAAAAAAAAAAAAAAA

Перечень последовательностей

SEQUENCE LISTING

SEQ ID NO: 1

<110> федеральное государственное автономное образовательное

учреждение высшего образования "Казанский (Приволжский) федеральный

университет" (ФГАОУ ВО КФУ)) (federalnoe gosudarstvennoe avtonomnoe

obrazovatelnoe uchrezhdenie vysshego obrazovaniya "Kazanskij

(Privolzhskij) federalnyj universitet" (FGAOU VO KFU))

<120> Лабораторный способ определения пола птиц по экспрессии гена

Ribocomal Protein S6

<160> 1

<210> 1

<211> 183

<212> DNA

<213> праймеры

<400> 2

I) GGAGTGGAAGGGCTATGTTG

II) TTGAACAGCTTGCGGAT

III) GACGTGTCCGCCTTCTGCTC

IV) TTCCTCACAACATACTGGCG

V) TGAAAGCAAGATACCCTCAT

VI) TCTTCATCTTTGCTTTAGCC

VII) CAGTGGAAGAAAGAAACCTG

VIII) GAATGAGGTGTTTGTCCAGT

<---

Изобретение относится к области молекулярной биологии и генной инженерии. Описан лабораторный способ определения пола птиц по экспрессии гена Ribocomal Protein S6. Получают эмбрионы разных видов птиц путём доведения до стандартной стадии развития эмбриона HH36. Получают образцы клеток эмбриональных фибробластов. Культивируют полученные клетки в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы и среде DMEM/F12 для контроля вариации экспрессии, связанной со средой для достижения гомогенности при выделении РНК. Из полученных культур клеток выделяют РНК, которые используют для приготовления библиотеки наборов фрагментов ДНК для определения последовательности РНК. Определяют последовательность индивидуальных молекул РНК в полученных образцах РНК путём секвенирования приготовленных библиотек. Проверяют качество полученных данных о последовательности РНК в библиотеках CAGE. Получают данные об экспрессии генов в полученных образцах РНК. На основе полученных выравниваний определяют координаты ДНК, на которых начинают считываться индивидуальные молекулы РНК и получают данные о частоте использования тех или иных CTSS, строят генные модели для сборки. РНК, выделенную из фибробластов, используют для получения комплементарной ДНК. Подбирают условия для проведения ПЦР в реальном времени, осуществляют серию ПЦР в реальном времени, используя в качестве матрицы комплементарную ДНК из образцов тканей птиц. Определяют эффективность праймеров в серии разведений ДНК и отбирают наиболее эффективные праймеры, по данным уровня экспрессии гена RPS6, определённого с помощью наиболее эффективных праймеров из использованных. Определяют диапазоны экспрессии гена RPS6 для птиц разных полов у разных видов. Техническим результатом заявленного технического решения является создание способа определения пола птиц путем определения уровня экспрессии гена RPS6 (Ribocomal Protein S6). 3 ил., 2 пр.

Лабораторный способ определения пола птиц по экспрессии гена Ribocomal Protein S6, заключающийся в том, что

получают эмбрионы разных видов птиц путём доведения до стандартной стадии развития эмбриона HH36,

получают клетки эмбриональных фибробластов,

культивируют полученные клетки в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы и среде DMEM/F12 для контроля вариации экспрессии, связанной со средой для достижения гомогенности при выделении РНК,

из полученных культур клеток выделяют РНК, которую используют для приготовления библиотеки наборов фрагментов ДНК для определения последовательности РНК,

определяют последовательность индивидуальных молекул РНК в полученных образцах РНК путём секвенирования приготовленных библиотек,

проверяют качество полученных данных о последовательности РНК в библиотеках CAGE,

получают данные об экспрессии генов в полученных образцах РНК,

на основе полученных выравниваний определяют координаты ДНК, на которых начинают считываться индивидуальные молекулы РНК и получают данные о частоте использования тех или иных CTSS,

строят генные модели для сборки;

РНК, выделенную из фибробластов, используют для получения комплементарной ДНК,

подбирают условия для проведения ПЦР в реальном времени,

осуществляют серию ПЦР в реальном времени, используя в качестве матрицы комплементарную ДНК из образцов клеток эмбриональных фибробластов птиц,

определяют эффективность праймеров в серии разведений ДНК и отбирают наиболее эффективные праймеры,

по данным уровня экспрессии гена RPS6, определённого с помощью наиболее эффективных праймеров из использованных, определяют диапазоны экспрессии гена RPS6 для птиц разных полов у разных видов,

благодаря разнице в уровне экспрессии гена RPS6 между птицами разных полов делают вывод о принадлежности птицы к мужскому или женскому полу соответственно.