Способ получения обогащенной тромбоцитами фракции аутоплазмы крови Российский патент 2023 года по МПК A61M1/36 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к области медицины, а именно к регенеративной медицине, и может быть использовано для стимуляции регенерации тканей при различных заболеваниях и дегенеративно-дистрофических состояниях. Оно может быть применено, например, в хирургии, ортопедии, урологии, гинекологии, стоматологии, косметологии.

Применение обогащенной тромбоцитами фракции аутоплазмы крови в настоящее время широко распространено в медицине. Тромбоциты содержат факторы, необходимые для активации гемостаза, способствующие миграции, делению, росту, дифференцировки клеток; стимуляции ангиогенеза и тканевой регенерации.

Эти факторы, наряду с плазменными факторами гемостаза, являются субстратом терапевтического и регенеративного эффекта обогащенной тромбоцитами фракции аутоплазмы крови /1/.

Уровень техники

Настоящее изобретение отличается использованием для получения обогащенной тромбоцитами фракции аутоплазмы устройства, содержащего антикоагулянт - цитрат натрия, расположенный над двумя разделительными средами: полиэфирным гелем и находящимся под ним раствором Ficoll.

Известен способ получения богатой тромбоцитами плазмы, включающий взятие крови, смешивание крови с антикоагулянтом и помещение ее в цилиндрический стакан, имеющий карман-ловушку для тромбоцитов и плазмы, центрифугирование стакана со скоростью, поэтапно уменьшающейся каждые три минуты с 4500 об/мин. до 2000 об/мин. и далее до 1000 об/мин. (Патент RU 2428995 C1). Следует отметить, что для центрифугирования стакана особой формы необходима специальная центрифуга. Кроме того, высокие скорости центрифугирования увеличивают риск снижения жизнеспособности тромбоцитов в богатой тромбоцитами плазме, полученной заявленным способом /2/.

Известен способ получения аутологичной богатой тромбоцитами плазмы, включающий забор венозной крови в двойной шприц-пробирку, с последующим центрифугированием устройства в режимах от 10 минут при 112 g до 2 минут при 447 g. Далее отделяют эритроциты и повторно центрифугируют устройство 10 минут при 1000 g для концентрации тромбоцитов, которые далее отделяют от плазмы крови. (Патент US 2015/OO64687 A1). Следует отметить сложность данного устройства, многоэтапность способа и необходимость специального оборудования для центрифугирования двойных шприцев-пробирок.

Известны способы получения аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмы, включающие забор венозной крови в подсоединенный к катетеру шприц с предварительно набранным антикоагулянтом в количестве 1,5 мл, затем шприц закрывают, содержимое перемешивают и вводят в пробирку «YCELLBIO-KIT» (Патент RU 2713772 С1), или «Стерильную пробирку АРМ для обработки цельной или разведенной крови» (Патент RU 2698723 C1). Центрифугирование проводят при комнатной температуре со скоростью вращения до 4000 об/мин в течение 4-5 минут, извлечение слоя богатой тромбоцитами плазмы проводят через центральное отверстие в крышке пробирки. Авторы изобретений (Патент RU 2713772 С1; Патент RU 2698723 C1) предлагают центрифугировать кровь в том числе и при скорости 4000 об/мин в течение 4-5 минут на центрифуге «Armed»:80-2S, что соответствует относительному ускорению 2130 g и является недостатком данного способа. При таком ускорении следует ожидать снижение количества тромбоцитов в готовом продукте т.к. согласно данным Jo et al 2013, при ускорении свыше 1500 g снижается выход тромбоцитов, вероятно, за счет их разрушения /2/.

Известен способ получения аутоплазмы с богатым содержанием тромбоцитов при помощи вакуумных пробирок с гепарином и разделительным гелем, получивший название Плазмолифтинг™. Взятие крови осуществляют в пробирку, которую далее центрифугируют при скорости 1000 об/мин в течение 10 минут (Патент RU 2606338).

Авторы изобретения (Патент RU 2606338) указывают на увеличение концентрации тромбоцитов в 3-3,5 раза от исходной, что не соответствует современным общепризнанным критериям терапевтически эффективной богатой тромбоцитами плазмы, согласно которым концентрация тромбоцитов должна составлять минимум пятикратную от исходной /1/. Кроме того, нельзя исключить сорбцию тромбоцитов к разделительному гелю, которая может приводить к снижению их количества в готовом продукте.

Наиболее близким к заявленному является способ сепарации крови (Патент US 4818418), включающий помещение в пробирку двух разделительных сред.

Далее в пробирку помещают кровь, смешанную с антикоагулянтом, центрифугирование пробирки со скоростью 600-2000 g, 5-20 минут. Авторы изобретения (Патент US 4818418) применяли его с целью выделения мононуклеарных клеток из периферической крови, однако, при адаптации режимов центрифугирования возможно альтернативное применение данного изобретения для получения обогащенной тромбоцитами фракции аутоплазмы.

Применение подобной технологии может устранить вероятный недостаток изобретения (Патент RU 2606338), а именно сорбцию тромбоцитов на разделительном геле, тем самым увеличив их количество в готовом продукте - обогащенной тромбоцитами фракции аутоплазмы крови.

Технической проблемой является разработка способа получения обогащенной тромбоцитами фракции аутоплазмы с высоким (т.е. более чем пятикратным) содержанием тромбоцитов путем однократного центрифугирования из небольшого количества крови, за счет снижения или полного отсутствия сорбции тромбоцитов к разделительному гелю.

Раскрытие изобретения

Техническим результатом, на достижение которого направлено заявленное изобретение, является получение обогащенной тромбоцитами фракции аутоплазмы с высоким (т.е. более чем пятикратным) содержанием тромбоцитов путем однократного центрифугирования из небольшого количества крови, за счет снижения или полного отсутствия сорбции тромбоцитов к разделительному гелю. Данный способ прост и воспроизводим на лабораторных центрифугах со стандартными роторами, что обеспечивает перспективу его широкого применения.

Технический результат достигается при осуществлении способа получения обогащенной тромбоцитами аутоплазмы крови, включающего забор 7-9 мл венозной крови в вакуумную пробирку с антикоагулянтом - цитратом натрия, расположенным над двумя разделительными средами: полиэфирным гелем и, находящимся под ним, раствором Ficoll, смешивание крови с антикоагулянтом путем переворачивания пробирки 8-10 раз, однократное центрифугирование пробирки с кровью 10-15 минут при 700-1000 g.

В ходе центрифугирования полиэфирный гель обеспечивает разделение обогащенной тромбоцитами аутоплазмы и эритроцитов, а раствор Ficoll создает дополнительный градиент плотности, препятствующий сорбции тромбоцитов на разделительном геле и способствующий выделению обогащенной тромбоцитами фракции аутоплазмы крови.

Далее происходит забор интерфазного слоя надосадочной фракции обогащенной тромбоцитами плазмы, который представляет из себя полоску между вышележащей плазмой и раствором Ficoll.

Этот слой содержит максимальную по градиенту концентрацию тромбоцитов во всей надосадочной фракции обогащенной тромбоцитами плазмы и забирается иглой в количестве 1 мл для обеспечения высокой концентрации тромбоцитов.

Краткое описание чертежей

Изобретение поясняется иллюстративным материалом, где на фигуре представлены схематические изображения общего вида:

А. пробирки с последовательно расположенными сверху вниз: антикоагулянтом - цитратом натрия (1), полиэфирным гелем (2), раствором Ficoll (3), таким образом, что вышележащий антикоагулянт (1) отделен полиэфирным гелем (2) от нижележащего раствора Ficoll (3)

Б. пробирки с кровью до центрифугирования, в которой кровь, смешанная с цитратом натрия (4), расположена над полиэфирным гелем (2) и нижележащим раствором Ficoll (3)

В. пробирки с кровью после центрифугирования, в которой кровь разделена на фракции обогащенной тромбоцитами плазмы (5), расположенной над раствором Ficoll (3), отделяющим ее от нижележащего полиэфирного геля (2) и расположенной под ним фракцией эритроцитов (6)

Г. положение иглы шприца (7) при заборе 1 мл интерфазного слоя, содержащего максимальную по градиенту концентрацию тромбоцитов (8) обогащенной тромбоцитами фракции аутоплазмы из пробирки (Г).

Осуществление изобретения

Получение обогащенной тромбоцитами аутоплазмы крови включает следующие этапы.

1. Забор венозной крови пациента в вакуумную пробирку с антикоагулянтом - цитратом натрия, расположенным над двумя разделительными средами: полиэфирным гелем и находящимся под ним раствором Ficoll.

2. Смешивание крови с антикоагулянтом путем переворачивания пробирки 8-10 раз.

3. Однократное центрифугирование пробирки с кровью 10-15 минут при 700-1000 g.

4. Забор иглой 1 мл интерфазного слоя надосадочной фракции обогащенной тромбоцитами плазмы, содержащего максимальную по градиенту концентрацию тромбоцитов.

Лабораторные исследования подтвердили увеличение концентрации тромбоцитов в полученной вышеуказанным способом обогащенной тромбоцитами аутоплазме крови в 5 раз от исходной концентрации тромбоцитов.

Список используемой литературы

1. Everts P, Onishi K, Jayaram P, Lana JF, Mautner K. Platelet-Rich Plasma: New Performance Understandings and Therapeutic Considerations in 2020. Int J Mol Sci. 2020 Oct 21; 21(20):7794. doi: 10.3390/ijms21207794. PMID: 33096812; PMCID: PMC7589810.

2. Jo CH, Roh YH, Kim JE, Shin S, Yoon KS. Optimizing platelet-rich plasma gel formation by varying time and gravitational forces during centrifugation. J Oral Implantol. 2013 Oct; 39(5):525-32. doi: 10.1563/AAID-JOI-D-10-00155. Epub 2011 Apr 11. PMID: 21480780.

Изобретение относится к медицине, а именно к способу получения обогащенной тромбоцитами аутоплазмы крови. Предложен способ получения обогащенной тромбоцитами аутоплазмы крови, включающий забор 7-9 мл венозной крови в вакуумную пробирку с антикоагулянтом - цитратом натрия, расположенным над двумя разделительными средами: полиэфирным гелем и находящимся под ним раствором Ficoll, смешивание крови с антикоагулянтом путем переворачивания пробирки 8-10 раз, последующее однократное центрифугирование пробирки с кровью 10-15 минут при 700-1000 g и забор иглой 1 мл интерфазного слоя надосадочной фракции обогащенной тромбоцитами плазмы. Предложенный способ обеспечивает получение обогащенной тромбоцитами фракции аутоплазмы с высоким, более чем пятикратным содержанием тромбоцитов путем однократного центрифугирования из небольшого количества крови, при этом снижается или отсутствует сорбция тромбоцитов к разделительному гелю. 1 ил.

Способ получения обогащенной тромбоцитами аутоплазмы крови, включающий забор 7-9 мл венозной крови в вакуумную пробирку с антикоагулянтом - цитратом натрия, расположенным над двумя разделительными средами: полиэфирным гелем и находящимся под ним раствором Ficoll, смешивание крови с антикоагулянтом путем переворачивания пробирки 8-10 раз, последующее однократное центрифугирование пробирки с кровью 10-15 минут при 700-1000 g и забор иглой 1 мл интерфазного слоя надосадочной фракции обогащенной тромбоцитами плазмы.