Способ получения богатой тромбоцитами плазмы крови для лечения макулярных разрывов сетчатки Российский патент 2023 года по МПК A61F9/07 A61M1/36 A61K35/19 A61P27/02 

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и может быть использовано при хирургическом лечении макулярных разрывов сетчатки.

В получении аутологичной богатой тромбоцитами плазмы крови (БоТП) можно выделить общие ключевые моменты: забор крови, использование антикоагулянта, двухэтапное центрифугирование с использованием различных систем. В самом простом варианте после прохождением двух этапов центрифугирования происходит разделение фракций богатой тромбоцитами плазмы (PRP, Platelet Rich Plasma) от бедной тромбоцитами плазмы (PPP, Platelet Poor Plasma) и слоя эритроцитов. Кроме того, применяя более сложные протоколы, из БоТП можно получить специфические препараты:

- L-PRP (Leukocyte Platelet Rich Plasma, лейкотромбоцитарный слой), группа препаратов БоТП с высоким содержанием тромбоцитов (в 3-4 раза превосходящую начальную концентрацию в крови) и лейкоцитов и с низкой плотностью сети фибрина после активации. L-PRP получают путем ручных лабораторных методов, которые используют последовательные этапы мягкого и жесткого центрифугирования для получения L-PRP. Именно на этапе жесткого вращения тромбоциты осаждаются вместе с лейкоцитами и эритроцитами.

- P-PRP (Pure Platelet Rich Plasma, область чистой богатой тромбоцитами плазмы), группа препаратов БоТП с высоким содержанием тромбоцитов (в 2-3 раза выше от первоначального содержания в крови), практически лишенных лейкоцитов и с низкой плотностью сети фибрина после активации. P-PRP получают путем лабораторного разделения клеток (плазмаферез), системы центрифугирования с мягким вращением или более технологичная обработка, такая как получение Р-PRP из фильтрованной крови с пониженным содержанием лейкоцитов.

В настоящее время известны различные подходы хирургического лечения макулярных разрывов с применением различных препаратов аутологичной плазмы, которые отличаются клеточным составом и степенью активации фибриногена.

Уровень техники.

1) Российскими авторами разработана технология хирургического лечения макулярных разрывов с использованием аутологичной обогащенной тромбоцитами плазмы и способ ее получения (патент RU 2606338 С1, дата приоритета 19.11.2015). Способ получения аутологичной, обогащенной тромбоцитами плазмы осуществлялся в специализированных для получения БоТП вакуумных пробирках, содержащих гепарин в качестве антикоагулянта и гель для отделения после центрифугирования эритроцитарной массы от плазмы, содержащей тромбоциты и лейкоциты. Забор порции БоТП для хирургического вмешательства осуществлялся на границе ее соприкосновения с гелем, следовательно, данная порция БоТП обогащена тромбоцитами и лейкоцитами. Значимые характеристики хирургической способа лечения, следующие: этап пассивной аспирации проводят непосредственно над зоной макулярного разрыва с последующим сведением края разрыва, после наносят БоТП на область макулярного разрыва.

Из недостатков данного способа следует отметить:

- в качестве антикоагулянта для приготовления БоТП используется гепарин, который препятствует высвобождению ростовых факторов из тромбоцитов, что снижает биологическую активность БоТП в плане влияния на митогенную и хемотаксическую активность клеток ретинальной глии и пигментного эпителия сетчатки;

- забор крови в пробирку для получения БоТП происходит под действием вакуума, который увеличивает вероятность механического повреждения/активации тромбоцитов на этапе забора крови;

2) Известен способ лечения больших макулярных разрывов сетчатки без тампонады витреальной полости, с аппликацией БоТП (патент RU 2735465 C1, дата приоритета 29.06.2020). Согласно описанию патента для получения БоТП используют специализированные пробирки YCELLBIO-KIT (Корея, РУ № РЗН 2014/2149 от 08.12.2014)., кровь забирают с антикоагулянтом (цитрат натрия с декстрозой). Режим центрифугирования со скоростью вращения 4000 об/мин в течение 5 минут. Порцию БоТП для операционного вмешательства отбирают в зоне над эритроцитарной массой в максимально зауженной части пробирки.

3) Ближайшим аналогом является метод получения БоТП в специализированных пробирках YCELLBIO-KIT (Юж. Корея, РУ № РЗН 2014/2149 от 08.12.2014) описан авторами Шкворченко Д.О. и Крупиной Е.А. (патент RU 2713772 C1, дата приоритета 29.05.2019). Забор крови проводят в подсоединенный к катетеру шприц с предварительно набранным антикоагулянтом в количестве 1,5 мл, при этом для мужчин объем крови составляет 12,5 мл, а для женщин - 13,5 мл; затем шприц закрывают, содержимое перемешивают и вводят в пробирку YCELLBIO-KIT иглой 18G через парацентральное отверстие в крышке пробирки; центрифугирование проводят при комнатной температуре со скоростью вращения 4000 об/мин в течение 5 минут, извлечение слоя богатой тромбоцитами плазмы проводят тупоконечной тонкостенной канюлей 27G через центральное отверстие в крышке пробирки.

Недостатками вышеуказанных способов являются сложности, возникающие во время получения и забора нужной фракции. Так, известны нестандартные случаи, когда после первого и второго центрифугирования слой PRP отсутствует, либо его количество очень мало или он достаточно четко не визуализируется, что создает сложности при использовании его во время хирургии. В сведениях, относящихся к уровню техники не говорится о разделении фракции PRP на слои и отсутствует конкретизация содержания количества тромбоцитов и лейкоцитов в присутствующих фракциях БоТП, используемой при операции.

Также, при использовании пробирок YCELLBIO-KIT с однократным центрифугированием в режиме 4000 об/мин в течение 5 минут не у всех пациентов можно получить БоТП с четким выделением лейкотромбоцитарного слоя (L-PRP) и чистой, прозрачной богатой тромбоцитами плазмы (P-PRP).

Технической проблемой, на решение которой направлено изобретение, является разработка способа получения БоТП для использования при хирургическом лечении макулярных разрывов сетчатки с использованием выпускаемых специализированных пробирок, предложить способ четкого выделения лейкотромбоцитарного слоя (L-PRP) и чистой богатой тромбоцитами плазмы (P-PRP).

Техническим результатом, достигаемым при использовании изобретения, является сокращение рисков послеоперационного воспаления, за счет оптимизации клеточного состава отбираемой для хирургического вмешательства БоТП из общего объема БоТП, получаемой в специализированной пробирке YCELLBIO-KIT (Юж. Корея).

Технический результат достигается тем, что в способе получения БоТП, для лечения макулярных разрывов сетчатки, включающем стандартную методику забора венозной крови, смешивание с антикоагулянтом, введение в пробирку YCELLBIO-KIT иглой 18G через парацентральное отверстие в крышке пробирки, центрифугирование, извлечение слоя БоТП, причем центрифугирование проводят двухкратно со скоростью вращения 3400 об/мин по 4 минуты, при получении мутного слоя БоТП, без четких границ слоя L-PRP, дополнительно проводят двухкратное центрифугирование со скоростью вращения 2000 об/мин в течение 1 минуты, а после извлекают слой чистой БоТП на уровне P-PRP.

В рамках разработки данного способа провели исследования на базе АО «Екатеринбургский центр МНТК «Микрохирургия глаза», для 20 образцов БоТП, полученной описанным в заявке способом, исследован клеточный состав ее фракций на гематологическом анализаторе Sysmex XS-500i (Sysmex, Германия). Получены следующие результаты:

- в лейкотромбоцитарном слое (L-PRP) концентрация тромбоцитов составила 6555,8±506,7×10³/мкл., лейкоцитов - 99,3±38,1×10³/мкл,

- в области чистой богатой тромбоцитами плазмы (P-PRP), забранной над лейкотромбоцитарном слоем (L-PRP), концентрация тромбоцитов равнялась 2600,4±329,9×10³/мкл, лейкоцитов - 1,49±0,58×10³/мкл.

Таким образом, концентрация тромбоцитов в БоТП над лейкотромбоцитарном слоем (L-PRP) (2600,4±329,9×10³/мкл) значительно превышает, либо приближена к наиболее оптимальной концентрации для активации регенераторных процессов в зоне макулярного разрыва (>1000×10³/ мкл) [Marx RE. Platelet-rich plasma (PRP): what is PRP and what is not PRP? Implant Dent. 2001;10(4):225-8. doi: 10.1097/00008505-200110000-00002].

Концентрация лейкоцитов при исследовании фракций БоТП в пробирках Ycellbio-Kit в лейкотромбоцитарном слое (L-PRP) составила от 6,12×10³/мкл до 494,69×10³/мкл (среднее значение 99,3±38,1×10³/мкл), а в БоТП над лейкотромбоцитарном слоем (L-PRP) составила от 0,02×10³/мкл до 7,08×10³/мкл (среднее значение 1,49±0,58×10³/мкл).

Тромбоциты участвуют в регенерации тканей за счет факторов роста (VEGF, PDGF, FGF, EGF, IGF, TGF, FGF, Ang) и других активных молекул (хемокинов, арахидоновой кислоты, фибриногена, серотонина, адениловых нуклеотидов и др.). Влияние факторов роста на поведение клеток и последовательность регенерации тканей широко изучены [Медведев В.Л., Коган М.И., Михайлов И.В., Лепетунов С.Н. Аутологичная плазма, обогащенная тромбоцитами: что это и для чего? // Вестник урологии. - 2020. - Т.8, №3-2. - С. 67-77. International Cellular Medicine Society. Guidelines for the use of platelet rich plasma (adopted 2011). Доступно по: http://www.cellmedicinesociety.org/icms-guidelines].

Лейкоциты наряду с тромбоцитами играют определенную роль в репарации тканей, которая начинается с реакции острого воспаления и переходит в фазу регенерации [Everts P, Onishi K, Jayaram P, Lana JF, Mautner K. Platelet-Rich Plasma: New Performance Understandings and Therapeutic Considerations in 2020 // Int. J. Mol. Sci. - 2020. - №21. - Р.7794.]. В то же время лейкоциты, секретируя протеолитические ферменты, могут оказать отрицательное воздействие на нейроэпителий сетчатки. Полагаем, что для хирургии макулярного разрыва рационально использовать БоТП из слоя чистой богатой тромбоцитами плазмы (P-PRP) с достаточным для терапевтического эффекта количеством тромбоцитов и минимальным количеством лейкоцитов, способных выполнить функции иммунной защиты и регуляции регенерации. Таким образом, авторы рекомендуют забирать БоТП для хирургического вмешательства над лейкотромбоцитарном слоем (L-PRP), на расстоянии 1- 2 мм над ним.

Способ осуществляется следующим образом.

Перед непосредственным хирургическим вмешательством производится забор венозной крови с антикоагулянтом (используется цитрат натрия 3,2%) и двухкратное центрифугирование пробирки YCELLBIO-KIT по 4 минуты со скоростью 3400 оборотов\мин (центробежная сила 2132g, центрифуга СМ-6М). При получении мутного слоя БоТП, без четких границ лейкотромбоцитарного слоя (L-PRP), проводятся дополнительные этапы центрифугирования. А именно, необходимо двукратно центрифугировать БоТП со скоростью 2000 оборотов\мин (центробежная сила 738g, центрифуга СМ-6М) в течение 1 мин, контролировать визуально четкость выделения лейкотромбоцитарного слоя (L-PRP). При необходимости повторить процедуру центрифугирования в предложенном режиме (двукратно центрифугировать БоТП со скоростью 2000 оборотов\мин в течение 1 мин).

Операция начинается с выполнения трехпортовой 25-27G витрэктомии в присутствии ирригационного раствора (сбалансированный солевой раствор BSS). Все порты имеют конструкцию клапанного типа, за счет этого обеспечивается наиболее полная герметизация витреальной полости и появляется возможность при необходимости перекрыть процесс, например подачи ирригационной жидкости во время окрашивания внутренней пограничной мембраны (ВМП). Завершается витрэктомия выделением и удалением задней гиалоидной мембраны. После чего на макулярный разрыв наносят каплю перфторорганического соединения (ПФОС), используя канюлю 27G, чтобы защитить слои сетчатки в макулярной зоне от воздействия красителя. Диаметр капли ПФОС составляет 1,5-2,0 диметра макулярного разрыва. Далее прекращают подачу раствора BSS через ирригационную систему (сама система не выводится из порта). При этом из соседнего порта выводят витреотом и в порт заводят канюлю на шприце с красителем, например, бриллиантовым синим («BrilliantBlueG» фирмы DORC). Вокруг капли ПФОС окрашивают ВПМ, которую после удаляют с помощью ILM-пинцета. Далее капля ПФОС аспирируется. Затем производят замену раствора BSS, которым заполнена витреальная полость, на воздух. Аспирацию остаточной жидкости проводят в пределах нижней и верхней височных сосудистых аркад без контакта с сетчаткой, далее извлекают чистый слой БоТП на уровне P-PRP на расстоянии 1-2 мм над четко выраженной границей лейкотромбоцитарного слоя (L-PRP), проводят аппликацию БоТП в количестве 0,05-0,1 мл с помощью экструзионной канюли с пластиковым наконечником 38G непосредственно в макулярный разрыв. Через одну минуту после нанесения образуется пленка фибрина в области разрыва, и сверху на эту пленку помещают каплю ПФОС. После чего сразу производят замену воздуха на раствор BSS. Экспозиция капли ПФОС составляет пять минут, после чего путем пассивной аспирации каплю ПФОС удаляют. Благодаря высокому удельному весу ПФОС, эта капля способствует более плотной адгезии (прилипанию) пленки фибрина к сетчатке, что дает возможность удерживать фибрин на сетчатке после аспирации ПФОС. Технология позволяет свести к минимуму возможность смещения фибриновой пленки во время удаления ПФОС, формированию правильного фовеального профиля и высокого функционального результата в послеоперационном периоде. Операция завершена, витреальная полость заполнена раствором BSS, который не является тампонирующим веществом, но при этом макулярный разрыв успешно устранен.

Заявленный способ поясняется следующими примерами.

Пример 1

Пациентка Т., 66 лет, обратилась 25.04.2022 с жалобами на «пятно» перед правым глазом в течение 3 месяцев. При осмотре: передний отрезок - без особенностей, глазное дно: ДЗН бледно-розовый, границы четкие, в макулярной зоне - разрыв. С помощью оптической когерентной томографии (ОКТ) был подтвержден макулярный разрыв диаметром 294 мкм.

Острота зрения правого глаза 0,1 sph -0,5 = ул Cyl -1,0 Ax10 = 0,35, ВГД (Pi) = 15 mm Hg.

Острота зрения левый глаза 0, ВГД (Pi) = 14 mm Hg.

Диагноз: макулярный разрыв 4 стадии правого глаза.

Приготовление БоТП: забор крови провели за 30 минут до операции из кубитальной вены в подсоединенный к катетеру шприц объемом 20 мл с предварительно набранным цитратом натрия (1,5 мл). Содержимое шприца перемешали и ввели в пробирку YCELLBIO-KIT иглой 18 G через парацентральное отверстие в крышке пробирки. Провели двухкратное центрифугирование на центрифуге СМ-6М (ELMI, Латвия) в режиме 3400 об/мин в течение 4 минут. После чего, был получен мутный слой БоТП, без четких границ лейкотромбоцитарного слоя (L-PRP), в связи с чем провели двухкратное центрифугирование со скоростью вращения 2000 об/мин в течение 1 минуты с получением четкого разграничения лейкотромбоцитарного слоя (L-PRP) и P-PRP. Дополнительно, в исследовательских целях, в параллельно набранной в пробирку YCELLBIO-KIT крови, провели оценку количества тромбоцитов и лейкоцитов БоТП на гематологическом анализаторе (Sysmex XS-500i).

Показатели крови: тромбоциты 245×10³/ мкл, лейкоциты 4,52×10³/ мкл.

Показатели БоТП:

- фракция P-PRP: тромбоциты 2382×10³/ мкл, лейкоциты 2,11×10³/ мкл;

- фракция L-PRP: тромбоциты 7571×10³/ мкл, лейкоциты 9,14×10³/ мкл.

Была проведена операция по поводу МР с использованием фракции P-PRP, извлеченная на расстоянии 1 мм над лейкотромбоцитарном слоем (L-PRP). При осмотре на вторые сутки после операции - передний отрезок без особенностей. По данным ОКТ макулярный разрыв сомкнут, наблюдалась пленка фибрина в фовеальной области. Острота зрения правого глаза с коррекцией составляла 0,55, ВГД (Pi) = 6 mm Hg.

Пациентка была выписана домой. При осмотре через 5 недель после операции передний отрезок без особенностей. Наблюдалась положительная динамика: острота зрения составляла 0,6, ВГД (Pi) = 18 mm Hg. По данным ОКТ макулярный разрыв сомкнут. При осмотре через 6 месяцев после операции передний отрезок без особенностей. Наблюдалась положительная динамика: острота зрения составляла 0,7, ВГД (Pi) = 16 mm Hg. По данным ОКТ макулярный разрыв сомкнут, определялся правильный фовеальный профиль. Пациентка была направлена под наблюдение офтальмолога по месту жительства.

Пример 2

Пациент П., 70 лет, обратился 16.05.2022 с жалобами на искажение изображения перед правый глазом. При осмотре: передний отрезок - без особенностей, глазное дно: ДЗН бледно-розовый, границы четкие, в макулярной зоне - разрыв. С помощью ОКТ был подтвержден макулярный разрыв диаметром 480 мкм.

Острота зрения правого глаза 0,08, ВГД (Pi) = 13 mm Hg.

Острота зрения левого глаза 0,7 sph -0,5 = ул и Cyl -1,0 Ax10 = 0,85.

Диагноз: макулярный разрыв 4 стадии правого глаза.

Приготовление БоТП и анализ ее клеточного состава провели аналогичным способом, описанным в примере 1.

Показатели крови: тромбоциты 181×10³/ мкл, лейкоциты 3,83×10³/ мкл.

Показатели БоТП:

- фракция P-PRP: тромбоциты 707×10³/ мкл, лейкоциты 0,06×10³/ мкл;

- фракция L-PRP: тромбоциты 3769×10³/ мкл, лейкоциты 357×10³/ мкл.

Была проведена операция по поводу МР с использованием фракции P-PRP, извлеченная на расстоянии 2 мм над лейкотромбоцитарном слоем (L-PRP). При осмотре на вторые сутки после операции - передний отрезок без особенностей. По данным ОКТ макулярный разрыв сомкнут, в зоне макулярного разрыва наблюдалась пробка из фибрина. Острота зрения с коррекцией составляла 0,1, ВГД (Pi) = 10 mm Hg.

Пациент был выписан домой. При осмотре через 6 недель после операции передний отрезок без особенностей, наблюдалась положительная динамика: острота зрения правого глаза составляла 0,45, ВГД (Pi) = 14 mm Hg. По данным ОКТ макулярный разрыв сомкнут. При осмотре через 6 месяцев после операции передний отрезок без особенностей, наблюдалась положительная динамика: острота зрения составляла 0,55, ВГД (Pi) = 16 mm Hg. По данным ОКТ макулярный разрыв сомкнут, определялся правильный фовеальный профиль. Пациент был направлен под наблюдение офтальмолога по месту жительства.

Пример 3

Пациент В., 74 года, обратился 18.05.2022 с жалобами на снижение зрения левый глаза. При осмотре: передний отрезок - без особенностей, глазное дно: ДЗН бледно-розовый, границы четкие, в макулярной зоне - разрыв. С помощью ОКТ был подтвержден макулярный разрыв диаметром 665 мкм.

Острота зрения правого глаза 0,15 sph -0.75 Cyl 0,5 Ax175 = 0,45, ВГД (Pi) = 8 mm Hg.

Острота зрения левого глаза 0,05 sph -0,5 = 0,15, ВГД (Pi) = 10 mm Hg.

Диагноз: макулярный разрыв 4 стадии левого глаза.

Приготовление БоТП и анализ ее клеточного состава провели аналогичным способом, описанным в примере 1.

Показатели крови: тромбоциты 146×10³/ мкл, лейкоциты 4,52×10³/ мкл.

Показатели БоТП:

- фракция P-PRP: тромбоциты 5546×10³/ мкл, лейкоциты 1,13×10³/ мкл;

- фракция L-PRP: тромбоциты 8548×10³/ мкл, лейкоциты 140,38×10³/ мкл.

Была проведена операция по поводу МР с использованием фракции P-PRP, извлеченная на расстоянии 2 мм над лейкотромбоцитарном слоем (L-PRP). При осмотре на вторые сутки после операции - передний отрезок без особенностей. По данным оптической когерентной томографии макулярный разрыв сомкнут. Острота зрения с коррекцией составляла 0,2, ВГД (Pi) = 16 mm Hg.

Пациент был выписан домой. При осмотре через 6 недель после операции передний отрезок без особенностей. Наблюдается положительная динамика: острота зрения левого глаза составляла 0,4, ВГД (Pi) = 14 mm Hg. По данным оптической когерентной томографии макулярный разрыв сомкнут. При осмотре через 6 месяцев передний отрезок без особенностей. Наблюдается положительная динамика: острота зрения составляла 0,5, ВГД (Pi) = 15 mm Hg. По данным оптической когерентной томографии макулярный разрыв сомкнут. Пациент был направлен под наблюдение офтальмолога по месту жительства.

Способ хирургического лечения при использовании БоТП из слоя чистой богатой тромбоцитами плазмы (P-PRP) позволяет повысить остроту зрения уже на первые сутки после операции. Данная техника позволяет достигать хорошего анатомического результата (полное закрытие макулярного разрыва с восстановлением структурных элементов сетчатки) и позволяет достичь стойкой положительной динамики зрительной функции в ранний (1-е сутки) и поздний (6 месяцев) послеоперационный период, снижается риск послеоперационного воспаления.

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и может быть использовано для получения богатой тромбоцитами плазмы крови (БоТП) при хирургическом лечении макулярных разрывов сетчатки. Способ включает забор венозной крови, смешивание с антикоагулянтом, введение в пробирку YCELLBIO-KIT иглой 18G через парацентральное отверстие в крышке пробирки. Центрифугирование проводят двухкратно со скоростью вращения 3400 об/мин по 4 минуты. При получении мутного слоя БоТП, без четких границ слоя L-PRP, дополнительно проводят двухкратное центрифугирование со скоростью вращения 2000 об/мин в течение 1 минуты, а после извлекают слой чистой БоТП на уровне P-PRP. Изобретение обеспечивает сокращение рисков послеоперационного воспаления за счет оптимизации клеточного состава отбираемой для хирургического вмешательства БоТП из общего объема БоТП, получаемой в специализированной пробирке YCELLBIO-KIT. Также изобретение позволяет достигать хорошего анатомического результата (полное закрытие макулярного разрыва с восстановлением структурных элементов сетчатки) и стойкой положительной динамики зрительной функции в ранний (1-е сутки) и поздний (6 месяцев) послеоперационный период, снижается риск послеоперационного воспаления. 3 з.п. ф-лы, 3 пр.

1. Способ получения богатой тромбоцитами плазмы крови (БоТП) для лечения макулярных разрывов сетчатки, включающий забор венозной крови, смешивание с антикоагулянтом, введение в пробирку YCELLBIO-KIT иглой 18G через парацентральное отверстие в крышке пробирки, центрифугирование, извлечение слоя БоТП, отличающийся тем, что центрифугирование проводят двухкратно со скоростью вращения 3400 об/мин по 4 минуты, при получении мутного слоя БоТП, без четких границ слоя L-PRP, дополнительно проводят двухкратное центрифугирование со скоростью вращения 2000 об/мин в течение 1 минуты, а после извлекают слой чистой БоТП на уровне P-PRP.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве антикоагулянта используют 1,5 мл цитрата натрия.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что слой чистой БоТП на уровне P-PRP извлекают на расстоянии 1-2 мм над слоем L-PRP.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при повторном получении мутного слоя БоТП, без четких границ слоя L-PRP, еще раз проводят двухкратное центрифугирование со скоростью вращения 2000 об/мин в течение 1 минуты.