Способ получения плазмы, обогащенной тромбоцитами, из малых объёмов крови Российский патент 2023 года по МПК A61K35/19 A61K35/16 G01N33/49 

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к ветеринарной хирургии, и может быть использовано при лечении раневой патологии аутологичной плазмой, обогащенной тромбоцитами, у животных, имеющих маленькую массу тела и, соответственно, малый объем циркулирующей крови.

В настоящее время как в гуманной, так и в ветеринарной медицине активно развиваются такие методы лечения общим названием, для которых является «регенеративная медицина». Смысл этих методов лечения заключается в том, чтобы обеспечить максимально быстрое и максимально полное восстановление утерянных вследствие заболеваний молекулярно-клеточных структурных компонентов тканей или органов пациента путем введения ему его же собственных или близкородственных клеточных композиций, способных замещать и/или активировать процессы регенерации. Одним из наиболее широко распространенных методов регенеративной медицины является метод введения в патологический очаг плазмы крови, обогащенной тромбоцитами.

Для получения такой плазмы предложено множество методов, которые отличаются друг от друга объемом крови, необходимым для процедуры выделения тромбоцитарной плазмы, пробирками, в которых производится забор крови, антикоагулянтом, который используется для стабилизации крови, пробирками, в которых производится выделение плазмы, режимом центрифугирования и т.д.

Однако, следует отметить, что все предложенные на сегодняшний день методы и расходные материалы предназначенные для получения плазмы обогащенной тромбоцитами предполагают использование достаточно больших объемов крови - от 5,0 мл и больше. В то же время среди ветеринарных пациентов есть кошки, собаки мелких пород и другие животные от которых крайне проблематично произвести забор крови в объеме более 1,0 мл.

Известен способ получения аутоплазмы с богатым содержанием тромбоцитов, получивший название Плазмолифтинг™. Данный способ получения аутоплазмы обогащенной тромбоцитами реализуется путем использования специальных пробирок, в качестве антикоагулянта используется гепарин, а в нижней части расположен разделительный гель, который в процессе центрифугирования должен пропускать эритроциты и лейкоциты, но задерживать тромбоциты (Патент РФ на изобретение №2606338). Недостатком этого способа является то, что пробирки такого рода не рассчитаны на выделение плазмы обогащенной тромбоцитами из объема крови 1.0 мл. Так же следует отметить, что в пробирках данного типа разделительный гель, присутствующий в пробирках, при низких оборотах не пропускает через себя эритроциты и лейкоциты. Т.е. не производит ни какого разделения. А при высоких оборотах адсорбирует на своей поверхности тромбоциты, приводя к получению плазмы с их низким содержанием. Пробирки такого типа имеют достаточно высокую стоимость. Кроме того, антикоагулянт гепарин, используемый в пробирках, препятствует последующему приготовлению фибриново-тромбоцитарного геля из полученной плазмы.

Наиболее близким к предложенному является способ получения аутогенной обогащенной тромбоцитами плазмы, включающий забор крови шприцем-пробиркой объемом 9 мл, в котором содержится антикоагулянт крови - цитрат натрия. Отобранную кровь в этой же пробирке центрифугируют в два этапа в лабораторной центрифуге «Heraeus Labofuge 300». В первом этапе центрифугируют в течение 12 минут со скоростью 4000 об/мин. Затем образовавшуюся плазму - надосадочный слой, из первого шприца-пробирки набирают в другой шприц-пробирку без цитрата и центрифугируют в течение 15 минут при скорости 3600 об/мин. После отделения бедной тромбоцитами плазмы - надосадочный слой, получают конечный продукт - обогащенную тромбоцитами плазму в количестве 0,3 мл. (М.Ю. Юрченко, А.В. Шумский «Обзор оборудования и методик получения аутогенной обогащенной тромбоцитами плазмы в стоматологии» // журнал «Новое в стоматологии», 2003 г., №7, с. 46). Недостатком этого метода исследования является то, что он не позволяет получить плазму, обогащенную тромбоцитами из количества крови объемом 1.0 мл. К тому же требует двукратного центрифугирования в разных пробирках.

Техническим результатом изобретения является разработка способа получения аутологичной плазмы с высоким содержанием тромбоцитов путем одноэтапного центрифугирования из количества крови объемом 1.0 мл. Технический результат изобретения состоит в получении аутологичной, богатой тромбоцитами плазмы, из количества крови, в объеме 1.0 мл, путем центрифугирования непосредственно в инсулиновом шприце, в который предварительно производят забор крови.

Сущность изобретения представлена на чертеже, где на фиг. 1 показан инсулиновый шприц с плазмой, обогащенной тромбоцитами, полученной из крови собаки.

Реализацию способа осуществляют следующим образом:

1. В стерильный инсулиновый шприц объемом 1.0 мл набирают 0.05 мл (50.0 мкл) 3.8% цитрата натрия и при помощи системы «бабочка» из любой доступной поверхностной вены животного, производя забор крови до полного заполнения шприца. Шприц отсоединяют от системы «бабочка», закрывая иглой с защитным колпачком, и, ровно, по линии упора для пальцев, шток обрезают, а затем помещают в стакан центрифуги ОПН-3 (Фиг. 1).

2. Шприц с кровью центрифугируют 1 минуту при 3000 об/мин и сразу без остановки центрифуги - 10 минут при 1000 об/мин, при этом в зависимости от цели лечения извлекают всю плазму, концентрация тромбоцитов, в которой будет составлять, примерно, 160.0±45.0 от концентрации тромбоцитов в цельной крови, или извлекают плазму послойно. В последнем случае, концентрация тромбоцитов в плазме варьирует и составляет примерно 60.0±15.0 тромбоцитов от количества тромбоцитов в цельной крови, взятых из верхней трети столбика плазмы, из средней трети столбика плазмы - примерно 140±25.0, а нижней трети столбика плазмы - примерно 250.0±50.0 (Табл.).

3. После полной остановки центрифуги шприц извлекают, снимают игла с колпачком и другим шприцом через отверстие наконечника, введя туда иглу, производят забор плазмы, объем которой составляет от 0.4% до 0.55% от исходного объема крови, при этом плазму извлекают аккуратно, не захватывая верхний эритроцитарный слой, в котором содержится большое количество лейкоцитов (Фиг. 1).

ПРИМЕР 1.

Кошка с длительно незаживающей раной в области бедра, полученной вследствие травмы. Назначенной лечение введение аутологичной плазмы обогащенной тромбоцитами вокруг и под раневой дефект. Кровь в объеме 1.0 миллилитр взята в инсулиновый шприц из подкожной вены предплечья. Выделение плазмы, обогащенной тромбоцитам проводили по предложенной методике. Из 1.0 миллилитра крови, исходно содержащей тромбоцитов 3748*103 в одном микролитре, получили 0.45 миллилитров плазмы, содержащей 279*106 тромбоцитов (620*10³ тромбоцитов в 1.0 микролитре). И не содержащей примеси лейкоцитов и эритроцитов. Концентрация тромбоцитов в верхней трети полученной плазмы составляла, примерно, 243*103 тромбоцитов в микролитре. Концентрация тромбоцитов в средней трети полученной плазмы составляла, примерно, 908*103 тромбоцитов в микролитре. Концентрация тромбоцитов в нижней трети полученной плазмы составляла примерно 1163*103 тромбоцитов в микролитре.

ПРИМЕР 2.

Собака породы йоркширский терьер. Поступила с диагнозом несостоятельность швов после проведенной плановой операцией. Назначенной лечение введение аутологичной плазмы обогащенной тромбоцитами вокруг и под раневой дефект. Кровь в объеме 1.0 миллилитр взята в инсулиновый шприц из подкожной вены предплечья. Выделение плазмы обогащенной тромбоцитам проводили по предложенной методике. Из 1.0 миллилитра крови, исходно содержащей тромбоцитов 240*10³ в одном микролитре, получили 0.55 миллилитров плазмы содержащей 322,85*10⁶ тромбоцитов (587*10³ тромбоцитов в 1.0 микролитре). И не содержащей примеси лейкоцитов и эритроцитов. Максимальная концентрация тромбоцитов визуализируется в нижней трети столбика плазмы по сильному увеличению ее мутности.

Предлагаемый способ является легко воспроизводимой процедурой при наличии стандартного лабораторного оборудования и стандартных расходных материалов медицинского назначения, что расширяет возможности ее применения при лечении аутологичной плазмы богатой тромбоцитами животных, имеющих маленькую массу, у которых осложнен забор крови, в объеме превышающим 1.0 мл.

Результаты подсчета количества тромбоцитов представлены в таблице:

Изобретение относится к области ветеринарии, а именно к ветеринарной хирургии. Способ получения плазмы, обогащенной тромбоцитами, из крови животных, выбранных из кошек или собак карликовых пород, включает забор и центрифугирование крови в стерильном инсулиновом шприце объемом 1,0 мл с 0,05 мл 3,8% цитрата натрия, при этом центрифугирование осуществляют в инсулиновом шприце однократного использования, при n, равном 3000 об/мин, в течение 1 мин, затем при n, равном 1000 об/мин, в течение 10 мин. Предложенный способ позволяет выделять плазму, обогащенную тромбоцитами, из малых объемов крови с наименьшей затратой времени. 1 ил., 1 табл., 2 пр.

Способ получения плазмы, обогащенной тромбоцитами, из крови животных, выбранных из кошек и собак карликовых пород, включающий забор и центрифугирование крови в шприце с цитратом натрия, отличающийся тем, что предварительно в стерильный инсулиновый шприц объемом 1,0 мл вводят 0,05 мл 3,8% цитрата натрия и кровь, при этом центрифугирование осуществляют в инсулиновом шприце однократного использования, при n, равном 3000 об/мин, в течение 1 мин, затем при n, равном 1000 об/мин, в течение 10 мин.