Способ оценки эффективности применения клеточно-инженерной конструкции на основе полимерного носителя и клеточной культуры в эксперименте при замещении дефектов гиалинового хряща Российский патент 2023 года по МПК G01N33/48 A61B5/00 

Изобретение относится к области медицины, в частности, к травматологии и ортопедии, и может быть использовано в тканевой инженерии при разработке клеточно-инженерных конструкций (далее КИК) при проведении экспериментов in vivo для замещения дефектов гиалинового слоя суставной поверхности.

Для замещения поверхности поврежденного гиалинового хряща в настоящее время активно разрабатываются различные перспективные методики. Их апробация проходит как in vitro так и in vivo на экспериментальных животных. При использовании лабораторных животных в первую очередь моделируют стандартизированное повреждение, а затем с помощью разрабатываемой методики замещается дефект и на финальном этапе исследований анализируют эффективность выбранной методики. Такая последовательность обусловлена необходимостью всесторонней оценки эффективности разрабатываемого метода замещения гиалинового хряща.

Основной целью экспериментов на лабораторных животных является оценка реакций тканей на воздействие исследуемого метода (имплантацию клеточно-инженерной конструкции, культивированных клеток, электромагнитного излучения, микрофрактурирования и др.) и процесс регенерации гиалинового хряща. Для этого чаще всего используют клинические (оценка подвижности в суставе), лучевые (магнитно-резонансная томография) и микроскопические методы исследований (сканирующая электронная микроскопия, гистология).

Эксперименты in vivo должны проводиться строго в соответствии с соблюдением принципов гуманного обращения с лабораторными животными.

Наиболее распространенным методом оценки является классическое изготовление гистологических препаратов. Блоки вырезанных тканей декальцинируют, затем проводят по различным реагентам для получения парафинового блока с образцом, его дальнейшей депарафинизацией, нарезкой на микротоме с последующей специфической окраской, в том числе с применением современных гистохимических методов. Исследования области повреждения такими методами позволяют оценить перспективность разрабатываемого метода для замещения гиалинового хряща и изучить динамику перифокальных реакций тканей. Дополнительно применяют сложные и трудозатратные методы, использующие конфолькальную микроскопию и специфические флюоресцентные красители, в том числе, используя метод криомикроскопии.

Помимо вышеперечисленных методик, существуют данные о применении метода сканирующей электронной микроскопии для анализа эффективности использования различных экспериментальных методов замещения гиалинового хряща у лабораторных животных.

Впервые о возможности использования сканирующей электронной микроскопии в исследованиях, посвященных гиалиновому хрящу, было заявлено в 1979 г.В статье М.Н. Павловой [1] был описан примененный метод сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) в сравнении с методикой классической электронной микроскопии. В другой фундаментальной работе Ian C. Clarke [2,3] также рассматривали возможность применения СЭМ для анализа как поверхностной, так и внутренней структуры исследуемого образца, однако в последней работе не было произведено сравнение СЭМ методики с другими методами. В работе Rolf Zehbe [4] СЭМ методика была применена для анализа поверхностной структуры образца, и одновременно была представлена технологическая методика для изготовления поперечного среза для анализа с помощью СЭМ внутренней структуры. В этом обширном исследовании также было приведено сравнение этого метода с другими методиками. Однако в вышеописанных работах не был исследован вопрос применения сканирующей микроскопии для анализа повреждений у экспериментальных животных, не анализировали интенсивность динамики регенеративных или дегенеративных процессов, а также не использовался скаффолд для замещения дефектов.

Известно применение СЭМ для оценки эффекитвности замещения дефектов гиалинового хряща полимерным скаффолдом [5]. Из данного патента известна идея не только замещения дефекта полимером, но и предварительного заселения последнего клеточной культурой для формирования аутологичного регенерата и замещения дефекта в конечном этапе. Однако в этой публикации не дана сравнительная характеристика различных методов между собой и не исследована их корреляция.

Логичным продолжением развития данной технологии стала работа авторов Gawlitta, Debby и соавт.[6], включающая экспериментальные исследования на крысах, в ходе которых предварительно моделировали и анализировали повреждение в динамике и применяли клеточно-инженерную конструкцию для замещения дефектов. Так же, как и в предыдущих работах, в данных исследованиях использовали методику сканирующей электронной микроскопии для анализа регенеративных и дегенеративных повреждений. Однако полноценного сравнения разных методик между собой не производилось.

В работе H. Katagiri с соавт.[7] с использованием экспериментальных животных не применяли клеточную культуру для заселения скаффолда, однако было проведено сопоставление методик между собой.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ, предложенный Pengfei Zheng [8]. В ходе исследования изготовленную клеточно-инженерную конструкцию (КИК) имплантировали лабораторным животным. Для анализа фотографий макрообразцов использовали шкалу ICRS. Методом СЭМ оценивали состояние полимерного носителя. Недостатками данного способа является отсутствие количественной оценки результатов имплантации разрабатываемой КИК по микрофотографиям, полученным методом СЭМ. Также авторы не проводили сравнение полученных результатов с гистологическими или другими методами исследования. Кроме того, авторы не рассматривали возможность использования СЭМ в качестве самостоятельного метода анализа регенеративных повреждений гиалинового хряща.

Технической проблемой является необходимость разработки способа количественной оценки эффективности применения КИК на основе полимерного носителя и клеточной культуры в эксперименте при замещении дефектов гиалинового хряща.

Технический результат состоит в повышении эффективности оценки применения клеточно-инженерной конструкции для замещения дефектов гиалинового хряща в экспериментах in vivo за счет получения количественной оценки состояния зоны имплантации, что позволяет объективно определить динамику регенеративных процессов, а также сравнивать между собой результаты разных экспериментов.

Технический результат достигается тем, что при анализе микрофотографий зоны замещенного клеточно-инженерной конструкции дефекта, полученных методом СЭМ, используют количественную оценку визуализируемых изменений, согласно предлагаемым критериям: площадь дефекта, степень интеграции КИК, структура поверхности. Изменения площади дефекта оценивают в 0 баллов при увеличение диаметра дефекта, оценке 1 балл соответствует уменьшение диаметра дефекта не более чем на 10%), оценке 2 балла соответствует уменьшение диаметра дефекта от 11% и до 50%, оценке 3 балла соответствует интактная неповрежденная поверхность или уменьшение диаметра дефекта более чем на 51%. Затем оценивают интеграцию клеточно-инженерной конструкции в неповрежденный участок и в случае отсутствие биологических (структурных) связей между КИК и интактным хрящемприсваивают 0 баллов, в случае незначительная связь КИК с интактным хрящем, микротрещины по большей части границы дефекта (от 76% до 100% от периметра дефекта) присваивают 1 балл, в случае множественных микротрещин по границе дефекта, занимающие от 26% до 75% от его, частичной связи КИК и интактного хряща присваивают 2 балла, в случае единичных микротрещин по границе дефекта, занимающие не более 25% от его периметра, плотной фиксация КИК присваивают 3 балла, в случае отсутствия разрывов и микротрещин, непрерывной границы перехода (интактный хрящ - область регенерата), или неповрежденный интактный хрящ присваивают 4 балла, после чего анализируют поверхностную структуру области повреждения и если повреждение неправильной формы, единичные области регенерации в области повреждения или их полное отсутствие, признаков клеточной пролиферации нет то присваивают 0 баллов, а если регенерат правильной изначальной формы, но имеется незамнкнутая поверхностная структура площади дефекта или поверхность регенерата пористая, имеются признаки клеточной пролиферации топрисваивают 1 балл, если регенерат правильной изначальной формы, а поверхность регенерата отличная от интактной, но не пористая, есть признаки клеточной пролиферации (наличие делящихся клеток в области регенерата) то присваивают 2 бала, а если неповрежденная гладкая поверхность - схожая с интактным хрящем или интактный неповрежденный хрящ то присваивают 3 балла, после чего суммируют баллы и получают значение от 0 до 10, где 0 - это неэффективное применение клеточно-инженерной конструкции, а 10 - максимально эффективное применение клеточно-инженерной конструкции.

Более подробная информация о критериях вынесения оценки приведена в табл. 1.

Таблица 1.-Критерии оценки Характеристика Оценка Баллы Степень замещения дефекта интактная неповрежденная поверхность или уменьшение диаметра дефекта более чем на 51% 3 уменьшение диаметра дефекта от 11% и до 50% 2 уменьшение диаметра дефекта не более чем на 10%) 1 увеличение диаметра дефекта 0 Интеграция в неповрежденный участок отсутствие разрывов и микротрещин, непрерывная граница перехода (интактный хрящ - область регенерата), или неповрежденный интактный хрящ 4 единичные микротрещины по границе дефекта, занимающие не более 25% от его периметра, плотная фиксация КИК 3 множественные микротрещины по границе дефекта, занимающие от 26% до 75% от его, частичная связь КИК и интактного хряща 2 незначительная связь КИК с интактным хрящем, микротрещины по большей части границы дефекта (от 76% до 100% от периметра дефекта) 1 отсутствие биологических (структурных) связей между КИК и интактным хрящем. 0 Поверхностная структура области повреждения неповрежденная гладкая поверхность - схожая с интактным хрящем или интактный неповрежденный хрящ 3 Регенерат правильной изначальной формы, поверхность регенерата отличная от интактной, но не пористая, признаки клеточной пролиферации (наличие делящихся клеток в области регенерата) 2 Регенерат правильной изначальной формы, но имеется незамнкнутая поверхностная структура площади дефекта или поверхность регенерата пористая, имеются, признаки клеточной пролиферации 1 Повреждение неправильной формы, Единичные области регенерации в области повреждения или их полное отсутствие, признаков клеточной пролиферации нет 0 ВСЕГО
0-10

Предложенная методика обеспечивает более эффективную оценку применения КИК при замещении дефектов гиалинового хряща за счет получения количественной оценки состояния зоны имплантации методом СЭМ при использовании разработанной шкалы, что позволяет объективно определить динамику регенеративных процессов, а также сравнивать между собой результаты разных экспериментов.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

После вывода животных из эксперимента извлекают часть сустава и подготавливают образцы для сканирующей электронной микроскопии. В рамках подготовки извлеченный сустав могут обработать спиртом, подрезать (в случае необходимости - уменьшить размер образца для микроскопии) и подвергнуть лиофильной сушке. Далее осуществляют анализ области имплантации клеточно-инженерной конструкции на сканирующем электронном микроскопе, получают микрофотографии. Полученное изображение анализируют и присваивают баллы для количественной оценки зоны имплантации КИК, согласно приведенной методике оценке указанной в таблице №1.

Предпочтительно заявляемый способ используют для сравнения нескольких клеточно-инженерных конструкций с целью определения наиболее эффективной.

Заявляемое изобретение поясняется примерами.

Пример 1.

Был получен коленный сустав интактной половозрелой крысы в возрасте 6 месяцев. Поверхностный дефект гиалинового хряща не создавали. Клеточно-инженерную конструкцию не имплантировали. После получения образца были получены и проанализированы СЭМ изображения поверхности сустава. По результатам анализа - интактная неповрежденная поверхность или уменьшение диаметра дефекта более чем на 51%, на основании этого картина соответствует 3 баллам, что показано на фиг. 1.

По результатам анализа СЭМ изображения было установлено отсутствие разрывов и микротрещин, непрерывная граница перехода (интактный хрящ - область регенерата), или неповрежденный интактный хрящ, что соответствует 4 баллам и показано на фиг. 2.

По анализу СЭМ снимков было установлено, что структура поверхностная полностью соответствует нативному гиалиновому хрящу, что показано на Фиг. 3, в связи с чем была поставлена оценка 3 балла.

Таким образом, общее количество баллов составило 10, что соответствует высокой эффективности применения клеточно-инженерной конструкции на основе полимерного носителя и клеточной культуры.

Пример 2.

Половозрелой крысе возраста 6 месяцев создавали поверхностный дефект гиалинового хряща коленного сустава. В положении сгибания под общей анестезией с помощью фрезерного низкооборотистого воздействия создавали цилиндрический дефект диаметром 1,00 мм. Клеточно-инженерную конструкцию также имплантировали. Клеточная культура была предоставлена ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» ИНЦ РАН. Далее животное выводили из эксперимента через 90 суток после операционного вмешательства. После получения образца были получены и проанализированы СЭМ изображения поверхности сустава.

По результатам анализа СЭМ изображений было установлено, что увеличение диаметра дефекта , дефект явно визуализируется и увеличился в размере более чем в два раза. Данная картина соответствует 0 баллам, что показано на фиг. 4.

По результатам анализа СЭМ изображений было установлено отсутствие биологических (структурных) связей между КИК и интактным хрящем, что показано на фиг. 5 и фиг. 6. Картина соответствует 0 баллам.

По результатам анализа СЭМ изображений было установлено, что на поверхности области регенерации присутствует регенерат правильной изначальной формы, но имеется незамнкнутая поверхностная структура площади дефекта или поверхность регенерата пористая, имеются, признаки клеточной. Данная картина соответствует 1 баллу в предложенной оценке. Образцы данных явлений показаны на фиг. 7 и фиг. 8.

На фиг. 7 показана имплантированная КИК в области дефекта и видны значительные повреждения, неровная поверхность.

На фиг. 8 показана имплантированная КИК в области дефекта. Видны значительные повреждения, неровная поверхность, частичная клеточная пролиферация.

Общее количество баллов -1 балл, что соответствует низкой эффективности.

Пример 3.

Половозрелой крысе возраста 6 месяцев создавали поверхностный дефект гиалинового хряща коленного сустава. В положении сгибания под общей анестезией с помощью фрезерного низкооборотистого воздействия создавали цилиндрический дефект диаметром 1,00 мм. В область дефекта имплантировали клеточно-инженерную конструкцию, содержащую биодеградируемый каркас и культуру модифицированных цитокином с помощью цитокина TGF-β3 мезенхимальных стромальных клеток. Клеточно-инженерную конструкцию также имплантировали. Клеточная культура была предоставлена ЦКП «Коллекция культур клеток позвоночных» ИНЦ РАН. Далее животное выводили из эксперимента через 90 суток после операционного вмешательства. После получения образца были получены и проанализированы СЭМ изображения поверхности сустава.

По результатам оценки СЭМ снимков было установлено, что уменьшение диаметра дефекта от 11% и до 50%, что показано на фиг. 9 и фиг. 10. Картина соответствует 3 баллам по приведенной методике.

На фиг. 9 приведен образец поверхности гиалинового хряща половозрелой крысы через 90 суток после созданного повреждения и имплантации модифицированной КИК. Область регенерата в центре рисунка.

На фиг. 10 приведен образец поверхности гиалинового хряща половозрелой крысы через 90 суток после созданного повреждения и имплантации модифицированной КИК. Область регенерата в нижнем левом углу рисунка.

По результатам оценки СЭМ снимков было установлено, что множественные микротрещины по границе дефекта, занимающие от 26% до 75% от его, частичная связь КИК и интактного хряща, что по приведенной методике соответствует 2 баллам. Картина представлена на фиг. 11 и 12.

На фиг. 11 приведен образец зоны - неповрежденный гиалиновый хрящ область регенерата через 90 суток после созданного повреждения и имплантации модифицированной КИК. Видна краевая трещина по периметру КИК. Частичная связь КИК - неповрежденный хрящ.

На фиг. 12 приведена область регенерата после имплантации КИК на 90 сутки после повреждения. Видна краевая трещина по всей окружности.

По результатам оценки СЭМ снимков было установлено, что регенерат правильной изначальной формы, поверхность регенерата отличная от интактной, но не пористая, признаки клеточной пролиферации (наличие делящихся клеток в области регенерата). Картина по приведенной методике соответствует 3 баллам. Данные представлены на фиг. 13,14,15.

На фиг. 13 приведена область регенерата после имплантации КИК на 90 сутки после повреждения. Видна краевая трещина на части окружности.

На фиг. 14 приведена область регенерата после имплантации КИК на 90 сутки после повреждения. Видна краевая трещина на части окружности.

На фиг. 15 приведена область регенерата после имплантации КИК на 90 сутки после повреждения. Виден переход зоны интактный хрящ - область регенерата.

Общее количество баллов 8, что говорит о достаточно хорошей эффективности применения КИК.

Список литературы

1. Павлова М.Н. Электронная микроскопия человеческого суставного хряща. Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1979, 77(7): 65-71

2. Clarke I.C. Articular cartilage: a review and scanning electron microscope study. 1. The interterritorial fibrillar architecture. J Bone Joint Surg Br. 1971. 53(4): 732-50.

3. Clarke I.C. Articular cartilage: a review and scanning electron microscope study. II. The territorial fibrillar architecture. J Anat. 1974 Nov;118(Pt 2):261-80.

4. Rolf Zehbe, Heinrich Riesemeier, C James Kirkpatrick, Christoph Brochhausen. Imaging of articular cartilage--data matching using X-ray tomography, SEM, FIB slicing and conventional histology. Micron. 2012 Oct;43(10):1060-7. doi: 10.1016/j.micron.2012.05.001.

5. Tissue engineered cartilage, method of making same, therapeutic and cosmetic surgical applications using same. United States Patent 8202551. Li, Wan-ju (Madison, WI, US). Tuan, Rocky S. (Bethesda, MD, US)

6. Engineered Devitalized Cartilaginous Tissue For Bone Regeneration. European Patent Application EP3967335. Gawlitta Debby (NL) Longoni Alessia (NL) Utomo Lizette (NL) Rosenberg Antoine Johan Wilhelm Peter (NL)

7. H Katagiri, L F Mendes, F P Luyten. Definition of a Critical Size Osteochondral Knee Defect and its Negative Effect on the Surrounding Articular Cartilage in the Rat. Osteoarthritis Cartilage. 2017. Sep;25(9):1531-1540. doi: 10.1016/j.joca.2017.05.006

8. Pengfei Zheng, Xinyue Hu, Yue Lou, Kai Tang. A Rabbit Model of Osteochondral Regeneration Using Three-Dimensional Printed Polycaprolactone-Hydroxyapatite Scaffolds Coated with Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cells and Chondrocytes. Med Sci Monit. 2019 Oct 1;25:7361-7369. doi: 10.12659/MSM.915441.

Изобретение относится к области медицины, в частности к травматологии и ортопедии, и может быть использовано в тканевой инженерии для оценки эффективности применения клеточно-инженерной конструкции in vivo на основе полимерного носителя и клеточной культуры в эксперименте при замещении дефектов гиалинового хряща. Способ включает проведение электронной микроскопии, где на получаемых изображениях количественно и качественно анализируют изображения, при этом определяют степень замещения дефекта по изменению площади дефекта и анализируют поверхностную структуру области повреждения, затем присваивают баллы. Далее суммируют баллы и получают значение от 0 до 10, где 0 – это неэффективное применение клеточно-инженерной конструкции, а 10 – максимально эффективное применение клеточно-инженерной конструкции. Изобретение обеспечивает повышение эффективности оценки эффективности применения клеточно-инженерной конструкции на основе полимерного носителя и клеточной культуры в эксперименте при замещении дефектов гиалинового хряща. 15 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ оценки эффективности применения клеточно-инженерной конструкции на основе полимерного носителя и клеточной культуры в эксперименте при замещении дефектов гиалинового хряща, в ходе которого осуществляют исследование области имплантации клеточно-инженерной конструкции с помощью сканирующей электронной микроскопии, отличающийся тем, что по результатам электронной микроскопии на получаемых изображениях количественно и качественно анализируют изображения и присваивают баллы, при этом определяют степень замещения дефекта по изменению площади дефекта и оценивают в 0 баллов при увеличении диаметра дефекта, оценке 1 балл соответствует уменьшение диаметра дефекта не более чем на 10%, оценке 2 балла соответствует уменьшение диаметра дефекта от 11 и до 50%, оценке 3 балла соответствует интактная неповреждённая поверхность или уменьшение диаметра дефекта более чем на 51%, затем анализируют интеграцию клеточно-инженерной конструкции в неповрежденный участок и в случае отсутствия структурных связей между клеточно-инженерной конструкцией и интактным хрящем присваивают 0 баллов, в случае микротрещин от 76 до 100% от периметра границы дефекта присваивают 1 балл, в случае микротрещин по границе дефекта, занимающих от 26 до 75% от его периметра, присваивают 2 балла, в случае единичных микротрещин по границе дефекта, занимающих не более 25% от его периметра, и фиксации клеточно-инженерной конструкции присваивают 3 балла, в случае отсутствия разрывов и микротрещин, непрерывной границы перехода интактный хрящ – область регенерата, или неповреждённого интактного хряща присваивают 4 балла, после чего анализируют поверхностную структуру области повреждения, и если повреждение неправильной формы, единичные области регенерации в области повреждения или их полное отсутствие, признаков клеточной пролиферации нет, то присваивают 0 баллов, а если регенерат правильной изначальной формы, но имеется незамкнутая поверхностная структура дефекта или поверхность регенерата пористая, имеются признаки клеточной пролиферации, то присваивают 1 балл, если регенерат правильной изначальной формы, а поверхность регенерата не пористая, есть признаки клеточной пролиферации, наличие делящихся клеток в области регенерата, то присваивают 2 балла, а если неповрежденная гладкая поверхность или интактный неповреждённый хрящ, то присваивают 3 балла, после чего суммируют баллы и получают значение от 0 до 10, где 0 – это неэффективное применение клеточно-инженерной конструкции, а 10 – максимально эффективное применение клеточно-инженерной конструкции.