Способ восстановления нерва с помощью имплантата ствола нерва, содержащего фиброин шелка, в эксперименте Российский патент 2024 года по МПК A61B17/00 A61F2/02 G09B23/28 

Изобретение относится к области медицины, в частности, к моделированию тканезаместительной терапии и тканевой инженерии, а также нейрохирургии.

Травматическое повреждение периферических нервов до сих пор остается одной из значимых проблем современной нейрохирургии из-за высоких цифр неудовлетворительных результатов лечения. В России ежегодно до 7 тысяч пациентов нуждаются в хирургическом вмешательстве по поводу травмы периферической нервной системы. Исходы этого лечения оставляют желать лучшего. Пациенты зачастую выписываются из стационара с грубым неврологическим дефицитом, что приводит в последующем к инвалидизации. Например, уровень благоприятного результата хирургического лечения при травме седалищного нерва, не смотря на значимый прогресс в медицине, до сих пор остается в пределах 20%.

Известно, что периферическая нервная система обладает хорошим посттравматическим регенераторным потенциалом, однако проблема высокой степени инвалидизации больных до сих пор не решена [Lee S . K ., Wolfe S .W . Peripheral nerve injury and repair . J . Am . Acad . Orthop . Surg . 2000; 8(4): 243-52 . Navarro X . Functional evaluation of peripheral nerve regeneration and target reinnervation in animal models: a critical overview . Eur . J . Neurosci . Epub ahead of print . 2015 .]. В значительной степени это связано с нерешенностью задачи преодоления протяженных диастазов нерва.

Неудовлетворительные результаты лечения травм периферических нервов, связаны с изменениями, описанными еще в 1850 г. A. Waller. Сразу после повреждения нерва запускаются процессы его дегенерации. Основной проблемой при регенерации нерва является формирование грубой рубцовой ткани в месте повреждения нерва, соединительная ткань полностью блокирует прорастание нервных волокон из проксимального конца нерва в дистальный.

С целью предотвращения прорастания соединительной ткани между концами повреждённого нерва активно разрабатываются кондуиты нерва из биосовместимых материалов, которые предназначены для направления и поддержания регенерации нервных волокон.

Среди тубулированных тканеинженерных конструкций кондуит из поли (е-капролактона) (PCL) обладает оптимальными механическими свойствами и способностью к биодеградации [ Николаев С. И., Галлямов А. Р., Мамин Г. В. и др. Кондуит нерва на основе поли(е-капролактона) и локальная доставка генов vegf и fgf2 стимулируют нейрорегенерацию . Клеточные технологии в биологии и медицине 2014; 1: 44-49. Chang С. J. The effect of pulse-released nerve growth factor from genipin-crosslinked gelatin in schwann cell-seeded polycaprolactone conduits on large-gap peripheral nerve regeneration. Tissue Eng. Part A. 2009; 15(3): 547-57. ]

Среди полимеров природного происхождения особый интерес представляют такие белки внеклеточного матрикса, как коллаген и фибрин, а также белок природного происхождения фиброин шелка (ФШ). Наиболее интенсивно используемым фиброином в тканевой инженерии является шелк, полученный от тутового шелкопряда Bombyx mori, для которого характерно высокое содержание глицина и аланина (77 %), а также серина и тирозина (11 %) (Кричевский, 2001). Молекулярная масса ФШ колеблется от 25 кДа для «легких» цепей до 350 кДа для «тяжелых», которые связаны между собой дисульфидными связями (Altman, 2003).

Известен токопроводящий полимерный композит, состоящий из поликапролактонового фумарата и полипиррола (электропроводящего полимера), предназначенный для регенерации нерва. При пропускании сквозь нерв тока в присутствии упомянутого композита наблюдалось восстановление нервного волокна в направлении приложенного тока (US 2013331869 A1, A61F 2/04, 12.12.2013).

Ограничение в использовании описанного композита заключается в том, что по нему не может регенерировать поврежденный нерв, так как нет субстрата, по которому могут прорастать аксоны и его нельзя использовать в качестве больших (больше 5см) отсутствующих участков нерва, принимающих или передающих сигнал органам.

Известен медицинский искусственный трансплантат ствола нерва, включающий оболочку или оболочку со вставленным в нее строительным волокном, при этом оболочка содержит множество микропор, и оболочка и/или строительное волокно содержат фиброин шелка (ЕР 1938774 A1, A61F 2/04, 02.07.2008).

Ограничение в использовании описанного трансплантата заключается в отсутствии биодеградации его составляющих, а также внутри кондуита нет содержимого.

Золотым стандартом замещения больших дефектов нервных стволов в настоящее время является аутотрансплантат подкожного нерва голени. К сожалению, эта операция более травматичная, трудоемкая, с дополнительным косметическим дефектом (при взятии аутотрансплантатов), не найдено универсального и достоверного способа идентификации одноименных пучков на обоих концах нерва. Окончательно не доказано, что лучше для исхода - выполнить микрохирургический эпиневральный и межпучковый шов ценой обширной мобилизации, приданием соответствующего положения в суставах конечности или прибегнуть к межпучковой аутопластике? Но главным является не полное восстановление функции нерва.

В основу изобретения положена задача создания способа применения медицинского искусственного имплантата ствола нерва, содержащего фиброин шёлка, в эксперименте, который позволяет более точно определить возможность применения данного вида трансплантата.

Решение поставленной задачи обеспечивается тем, что в способе применения медицинского искусственного имплантата ствола нерва, содержащего фиброин шёлка, в эксперименте, перед проведением хирургических манипуляций крысам выполняют неингаляционную анестезию путём введения раствора 20 % золетила, затем в области левого бедра выполняют разрез кожи длиной 1,0см, затем тупым и острым путем выделяют седалищный нерв, левый седалищный нерв на уровне середины бедра пересекают, концы его подшивают к концам искусственного нерва в виде полимерной трубки из поликапролактона, заполненной коллагеновым гелем и нитями фиброина шелка длиной 10 мм двумя швами, затем рану послойно ушивают; прорастание нерва контролируют через 1,5 и 3,0 месяца.

Применение нами нитей фиброина шёлка (аналог лент Бюгнера) внутри имплантата даёт возможность аксонам проксимального конца нерва по ним, как по направляющим прорастать к дистальному концу этого нерва, в результате чего увеличивается возможность восстановления нерва около 70-80% по сравнению с «золотым стандартом» эпиневральным швом который предполагает прорастание нерва до 50%.

Изобретение поясняется фиг.1, на котором представлено фото внешнего вида искусственного имплантата. а) трубка из поликапролактона с коллагеновым гелем; б) волокна фиброина – щелка. На фиг.2 показано фото раны крысы в эксперименте поэтапного замещения дефекта нервного ствола биорезорбируемой полимерной матрицей; на фиг.2а показан выделенный участок седалищного нерва крысы, на фиг.2б показано иссечение фрагмента седалищного нерва, на фиг.2в показан искусственный нерв, вшитый в дефект нерва. На фиг.3 представлена подготовка и взятие седалищного нерва на гистологическое исследование; на фиг.3а представлено фото проросшего нерва и кондуита в ране, на фиг.3б показано фото проросшего нерва подготовленного к гистологическому исследованию. На фиг.4 представлены данные гистологического исследования, показывающие полное прорастание нерва; на фиг.4а показан проксимальный участок нерва, поперечный срез Х100 окраска (гематоксилин-эозин), на фиг.4б показан дистальный участок нерва, поперечный срез Х400 окраска (гематоксилин-эозин), на фиг.4в показан проксимальный участок нерва в кондуите, продольный срез Х100 окраска (гематоксилин-эозин), на фиг.4г показан дистальный участок нерва в кондуите, продольный срез Х100 окраска (гематоксилин-эозин), на фиг.4д показан дистальный участок нерва в кондуите, продольный срез Х400 окраска по (Маллори), на фиг.4е показан дистальный участок нерва в кондуите, продольный срез Х100 окраска по (Маллори).

В своих экспериментах мы применяли созданный нами искусственный нерв. Искусственный нерв представляет собой полимерную трубку, заполненную коллагеновым гелем и нитями фиброина шелка. Полимерную трубку готовили по ранее запатентованной методике (Нащекина Ю.А., Юдинцева Н.М., Никонов П.О., Блинова М.И., Нащекин А.В., Москалюк О.О., Юдин В.Е., Михайлова Н.А. патент на изобретение «Способ получения биорезорбируемого сосудистого протеза малого диаметра» RU 2 709 621 C1 от 19.12.2019). Она изготавливалась из поли (ε-капролактона) со средней молекулярной массой (Sigma, США). Диаметр полимерной трубки, возможно, варьировать в зависимости от потребностей. Толщина трубки составила 50-100 мкм. Длина полимерной трубки также может варьировать в зависимости от размера повреждения нерва. В полимерную трубку вводятся нативные нити фиброина шелка тутового шелкопряда. Диаметр нитей фиброина шелка составляет порядка 10 мкм (Нащекина Ю.А., Никонов П.О., Юдинцева Н.М., Нащекин А.В., Лихачёв А.И., Москалюк О.А., Юдин В.Е., Блинова М.И. «Взаимодействие мезенхимных клеток костного мозга с нативными волокнами фиброина шёлка», Цитология, 2016, Том 58, № 11, стр. 843-849.). Трубки с нитями заполняли раствором коллагена с концентрацией 2 мг/мл. Раствор полимеризовался в гель внутри трубки. Все процедуры проводили в стерильных условиях с предварительно простерилизованными полимерными трубками и нитями фиброина шелка. Готовую конструкцию можно использовать как сразу после приготовления, так и спустя 1-3 месяц после приготовления. При длительном хранении коллагеновый гель высыхает, но при выдерживании в физиологическом растворе повторно частично набухает, что позволяет создавать аксонам благоприятную среду для миграции (Фиг.1).

Способ экспериментального применения искусственного нерва

Исследование проводили на крысах-самцах (n= 5) массой 180-220 грамм, полученных из ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово» Национального исследовательского центра «Курчатовский институт» (пос. Рапполово Ленинградской обл.).

В работе руководствовались требованиями нормативно-правовых актов о порядке экспериментальной работы с использованием животных, в том числе по гуманному отношению к ним [1, 2]. Перед проведением хирургических манипуляций крысам выполняли неингаляционную анестезию путём введения раствора золетила («Virbac S.A.», Франция). Для введения в анестезию внутрибрюшинно вводили раствор золетила в дозе 20 мг/кг, при этом состояние седации развивалось через 6-7 мин. Для поддержания анестезии золетил вводили однократно подкожно в дозе 10 мг/кг. В области левого бедра выполняли раз кожи длиний 1,0см, затем тупым и острым путем выделяли седалищный нерв. Левый седалищный нерв на уровне середины бедра пересекали, концы его подшивали к концам искусственного нерва длинной 10 мм двумя швами. (Фиг.2а,б,в). Рану послойно ушивали. Животных содержали в стандартных условиях со свободным доступом к воде и корму. Контроль прорастания нерва контролировали через 1,5 и 3,0 месяца. Во время наблюдения за крысами отмечалось быстрое восстановление активных движений в конечности и отсутствие выраженных трофических нарушений. Кроме того через 1,5 месяца при ЭНМГ регистрировался М-ответ икроножной мышцы, равный 50% аналогичного ответа с контрольной (здоровой стороны). Через 3 месяца животных выводили из эксперимента и готовили препараты для гистологического исследования (Фиг.3а,б). Результаты гистологического исследования представлены на Фиг.4а-е.

1. ГОСТ 33044-2014 Принципы лабораторной практики GLP. – М. : Стандартинформ, 2015. – 16 с.

2. Директива 2010/63/EU Европейского парламента и совета европейского союза по охране животных, используемых в научных целях НП объединение специалистов по работе с лабораторными животными. – СПб.: Rus–LASA, 2012. – 48 с.

Изобретение относится к экспериментальной медицине, а именно к нейрохирургии, тканевой инженерии. Перед проведением хирургических манипуляций крысам выполняют неингаляционную анестезию путём введения раствора золетила. Затем в области левого бедра выполняют разрез кожи длиной 1,0см. После этого тупым и острым путем выделяют седалищный нерв. Пересекают левый седалищный нерв на уровне середины бедра, концы его подшивают к концам искусственного нерва в виде полимерной трубки из поликапролактона, заполненной коллагеновым гелем и нитями фиброина шелка длиной 10 мм, двумя швами. Затем рану послойно ушивают, а прорастание нерва контролируют через 1,5 и 3,0 месяца. Способ позволяет восстановить нерв, с помощью искусственного имплантата, который увеличивает уровень прорастания нерва до 70-80%, что в свою очередь обеспечивает быстрое восстановление активных движений в конечности и отсутствие выраженных трофических нарушений. 4 ил., 1 пр.

Способ восстановления нерва с помощью имплантата ствола нерва, содержащего фиброин шёлка, в эксперименте, отличающийся тем, что перед проведением хирургических манипуляций крысам выполняют неингаляционную анестезию путём введения раствора золетила, затем в области левого бедра выполняют разрез кожи длиной 1,0 см, затем тупым и острым путем выделяют седалищный нерв, левый седалищный нерв на уровне середины бедра пересекают, концы его подшивают к концам искусственного нерва в виде полимерной трубки из поликапролактона, заполненной коллагеновым гелем и нитями фиброина шелка длиной 10 мм двумя швами, затем рану послойно ушивают; прорастание нерва контролируют через 1,5 и 3,0 месяца.