Способ лечения лимбальной недостаточности с помощью трансплантации культивированных стволовых клеток в интрастромальные роговичные тоннели Российский патент 2024 года по МПК A61F9/07 A61F9/08 

Изобретение относится к области медицины, а именно, к офтальмологии, а также к биотехнологии, и может быть использовано в лечении лимбальной недостаточности (ЛН) при дефиците или отсутствии лимбальных эпителиальных стволовых клеток (ЛЭСК).

Прозрачность роговицы во многом зависит от целостности эпителия. Эпителий роговицы постоянно обновляется на протяжении всей жизни за счет деления ЛЭСК, находящихся в области базального эпителия лимба. Однако различные приобретенные и наследственные причины, например, ожоги, лучевые травмы, ношение контактных линз, врожденная аниридия, синдром Стивенса-Джонсона и многие другие, могут привести к ЛН вследствие дефицита ЛЭСК. Трансплантация культивированных аутологичных ЛЭСК показала большой потенциал в качестве варианта лечения для восстановления эпителия роговицы и лимбального барьера у пациентов с ЛН. Однако, низкая острота зрения после трансплантации ЛЭСК, рецидивы симптомов ЛН требует доработки подходов к ее лечению.

Хирургическое лечение должно быть направлено на восстановление популяции стволовых клеток, которые могут выживать в течение длительного времени и являться источником эпителиальных клеток роговицы. Трансплантация культивированных ЛЭСК является относительно новой процедурой, в краткосрочной перспективе (средний период наблюдения менее 3 лет для большинства пациентов в зарегистрированных исследованиях) эффективность процедуры наблюдалась в 67% случаев.

Длительное хранение культивированных ЛЭСК может сделать возможной повторную трансплантацию без необходимости повторной биопсии лимба здорового глаза. Потенциально криоконсервация культивируемых ЛЭСК может обеспечить их неограниченное хранение для повторных трансплантаций и транспортировки из централизованных лабораторий. Достоинство метода трансплантации культивированных ЛЭСК сводит к минимуму воздействие чужеродных антигенов в случае аллогенных трансплантатов, т.к. используется минимальный размер биоптата для последующего культивирования, и культуры содержат небольшое количество антигенпрезентирующих клеток Лангерганса, меланоцитов и эндотелия сосудов.

Трансплантация культивированного эпителия слизистой оболочки полости рта (COMET), описанная Nakamura et al. в 2003 г., обеспечивает еще один вариант использования аутологичных клеток для восстановления эпителиальной поверхности роговицы. Технология COMET известена как культивируемый ex vivo аутотрансплантат слизистой оболочки полости рта (EVOMAU). Данный метод лечения ЛН показывает уменьшение площади конъюнктивизации, помутнения роговицы, неоваскуляризации и симблефарона у большинства пациентов. Как и при трансплантации ЛЭСК, сквозная кератопластика может потребоваться в качестве второго этапа хирургического лечения для замещения глубокого стромального фиброза. Кроме этого существуют альтернативные источники стволовых клеток, которые могут применяться в лечении ЛН.

Существуют различные варианты доставки культуры ЛЭСК, наиболее распространенным из них является амниотическая мембрана. В качестве носителей ЛЭСК могут применятся фибриновый гель, коллаген, кератиновые пленки, пленки фиброина шелка, хитозановый гидрогель, капсула хрусталика человека, гидрогелевые контактные линзы, каркас из нановолокон. Использование биологических материалов связано с риском передачи заболеваний, некоторые из них не обладают оптимальными свойствами биодеградации и биосовместимости, так, например, гидрогели коллагена не имеют достаточной механической прочности.

Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является Holoclar (Италия), который является первым коммерчески доступным вариантом с применением стволовых клеток для лечения ЛН. Практическое использование этого терапевтического лекарственного препарата на основе фибрина предполагает трансплантацию культивированных ex vivo аутологичных стволовых клеток при односторонних поражениях после химического или термического ожога.

Также известен способ восстановления эпителиального слоя роговицы при одностороннем синдроме ЛН, включающий иссечение фиброваскулярного паннуса, выполнение поверхностных симметричных радиальных разрезов на периферии стромы роговицы у лимба, формирование туннелей длиной до 1,0 мм, а также предварительное выкраивание лимбального лоскута в верхнем секторе на здоровом глазу и разделение его на фрагменты, каждый из которых по одному помещают в сформированные туннели, затем в качестве защитного покрытия на всю поверхность роговицы накладывают амниотическую мембрану и фиксируют ее швами за пределами лимба (патент РФ на изобретение №2766166).

Недостатком данного способа является невозможность повторных процедур из-за риска возникновения ЛН на здоровом глазу.

Задачей изобретения является создание способа лечения ЛН с помощью трансплантации культуры клеток в среде-носителе для его введения в роговичные интрастромальные тоннели, выполненные на уровне залегания ЛЭСК в периферических отделах роговицы, при помощи специального изогнутого шпателя или фемтосекундного лазера.

Ожидаемым клиническим результатом является уменьшение проявлений ЛН за счет восстановления роговичного фенотипа эпителиальной поверхности, эпителизации эрозий и регресса неоваскуляризации.

Технический результат достигается последовательностью этапов. На начальном этапе культура клеток лимба до пятого пассажа, достигшая конфлюэнтности (или культура стволовых клеток из альтернативных источников), полученная из биоптата лимба парного глаза, смешивается со средой-носителем. Далее проводится подготовка роговичных интрастромальных тоннелей с помощью изогнутого шпателя или фемтосекундного лазера на глубине залегания ЛЭСК (лимбальных ниш). Тоннели формируются вдоль лимба, в одной плоскости, в верхней и нижней гемисферах, протяженностью 100-175° каждый. При механическом способе возможно предварительное формирование насечки с помощью дозированного алмазного ножа, кератома или роговичного ножа. Далее происходит заполнение сформированных тоннелей биомедицинским клеточным продуктом (БМКП), содержащим среду-носитель и диспергированные в ней культивированные стволовые клетки. На завершающем этапе возможно наложение роговичного шва на тоннель в месте первоначального входа для предотвращения потери БМКП, также возможна обтурация входного отверстия фибриновым клеем или гемостатической губкой с аналогичной целью. После выполнения всех этапов на глаз может быть установлена мягкая контактная линза.

Способ поясняется фигурой 1. Позицией 1 обозначено схематичное расположение роговичных интрастромальных тоннелей в верхней и нижней гемисферах, глубина тоннелей на уровне залегания ЛЭСК (лимбальных ниш).

Пример 1. Все манипуляции проводились в условиях экспериментальной операционной под общей анестезией, дополненной субтеноновой анестезией. В экспериментальном исследовании кролику предварительно формировали ЛН комбинацией щелочного ожога 2,5% раствором гидроксида натрия и удалением лимбальной ткани. Одномоментно с этим на парном глазу производили биопсию лимбальной ткани 2×2 мм для дальнейшего получения культуры клеток. Через 2 месяца формировалась лимбальная недостаточность: наблюдалось стойкое стромальное помутнение роговицы, рост новообразованных сосудов, эрозии роговицы, эпителиопатия, рубцовые изменения конъюнктивы и век, при окрашивании флюоресцеином отмечались дефекты эпителия. Диагноз ЛН был подтвержден обнаружением бокаловидных клеток, характерных для конъюнктивального типа эпителия, по результатам импрессионной цитологии.

После подтверждения ЛН на глазу были сформированы периферические туннели с помощью изогнутого шпателя, повторяющего окружность лимба, на расстоянии 0,5-1,0 мм от него. Был подготовлен БМКП - культивированные ЛЭСК в вискоэластике (Когевиск, Россия). БМКП был введен в тоннели, на место первоначальных входов было наложено по 1 узловому шву полипропиленом 10/0. По данным оптической когерентной томографии роговицы тоннели располагались на глубине 149-159 мкм (на уровне глубины залегания ЛЭСК у кроликов). С целью избегания механической травмы была выполнена временная блефарорафия. Через 7 дней швы с век были сняты.

В течение всего периода наблюдения (2 месяца после трансплантации культивированных ЛЭСК) нежелательные явления не отмечались. Со 2 недели после лечения площадь эрозий стала меньше. К концу периода наблюдения отмечалась полная эпителизация роговицы при сохранении незначительных дефектов, обнаруживаемых при окрашивании флюоресцеином.

Пример 2. Все манипуляции проводились в условиях экспериментальной операционной под общей анестезией, дополненной субтеноновой анестезией. В экспериментальном исследовании кролику предварительно формировали ЛН комбинацией щелочного ожога 2,5% раствором гидроксида натрия и удалением лимбальной ткани. Одномоментно был осуществлен забор биоптата лимбальной ткани 2×2 мм с парного глаза для дальнейшего получения культуры клеток. Через 1,5 месяца наблюдалось формирование субэпителиального помутнения роговицы, рост новообразованных сосудов, кератопатия, при окрашивании флюоресцеином отмечались множественные точечные прокрашивания.

После подтверждения ЛН фемтосекундным лазером были сформированы интрастромальные роговичные туннели вдоль лимба на глубине 150 мкм. БМКП на основе культивированных ЛЭСК и вискоэластика (Когевиск, Россия) был введен в тоннели, вход в тоннели был закрыт гемостатической губкой, наложена мягкая контактная линза, выполнена временная блефарорафия. Через 7 дней швы после блефарорафии были сняты, мягкая контактная линза удалена. В течение всего периода наблюдения (2 месяца после трансплантации культивированных ЛЭСК) нежелательные явления не наблюдались. С 10 дня отмечалась уменьшение кератопатии и площади субэпителиального помутнения.

Изобретение относится к медицине, а именно к офтальмологии. Осуществляют лечение лимбальной недостаточности с помощью трансплантации культивированных стволовых клеток в интрастромальные роговичные тоннели, включающее подготовку культуры стволовых клеток. Подготовку роговичных интрастромальных тоннелей проводят с помощью изогнутого шпателя или фемтосекундного лазера на глубине залегания лимбальных эпителиальных стволовых клеток, вдоль лимба, в одной плоскости, в верхней и нижней гемисферах, протяженностью 100-175° каждый. Заполняют сформированные тоннели биомедицинским клеточным продуктом, содержащим среду-носитель и диспергированные в ней культивированные стволовые клетки. Способ позволяет уменьшить проявления лимбальной недостаточности за счет восстановления роговичного фенотипа эпителиальной поверхности, эпителизации эрозий и регресса неоваскуляризации. 1 ил., 2 пр.

Способ лечения лимбальной недостаточности с помощью трансплантации культивированных стволовых клеток в интрастромальные роговичные тоннели, включающий подготовку культуры стволовых клеток, отличающийся тем, что проводят подготовку роговичных интрастромальных тоннелей с помощью изогнутого шпателя или фемтосекундного лазера на глубине залегания лимбальных эпителиальных стволовых клеток, вдоль лимба, в одной плоскости, в верхней и нижней гемисферах, протяженностью 100-175° каждый, заполняют сформированные тоннели биомедицинским клеточным продуктом, содержащим среду-носитель и диспергированные в ней культивированные стволовые клетки.