Способ получения ниосомальной формы гентамицина Российский патент 2023 года по МПК A61K9/133 A61K31/7036 A61K47/14 A61K47/24 A61K47/26 A61K47/28 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в частности к способу микрокапсулирования антимикробных препаратов в ниосомы. Может быть использовано в медицинской и ветеринарной практике при применении антибактериальных препаратов в составе ниосом, что снижает степень их инактивации и позволяет оптимизировать антимикробное действие за счет концентрации микровезикул на основе неионных поверхностно-активных веществ.

Уровень техники

Известен препарат, который содержит биогелевую основу и действующие вещества - наночастицы серебра и экстракт корня солодки, ниосомы оксида цинка и диметилсульфоксид при следующем соотношении компонентов, мас.%: наночастицы серебра 0,008, экстракт корня солодки 0,3, ниосомы оксида цинка 0,8, диметилсульфоксид 5, биогелевая основа 38, вода - остальное. Использование этого препарата обеспечивает эффективное лечение при сокращении или исключении применения антибиотиков и соответственно содержании их в молоке, а также позволяет избежать развития резистентной микрофлоры (см. пат.RU2739112, МПК⁵¹ A61K 33/38, A61K 36/484, A61P 31/04).

Рассмотренный способ имеет ряд недостатков: отсутствие информации о способе получения ниосом и эффективности включения действующего вещества.

Известен ниосомальный антимикробный гель для лечения диабетических язв, ран, ожогов, в том числе инфицированных антибиотико-резистентными микроорганизмами, представляющий собой ниосомальныйантимикробный гель для лечения диабетических язв, ран, ожогов, включающий использование инкапсулированных пептидов, содержит инкапсулированные в кремнийорганические ниосомыдефензины, выделенные из лейкоцитарно-эритроцитарно-тромбоцитарной массы крови, и низкомолекулярные пептиды, выделенные из амниотической мембраны плаценты животного происхождения, а также гелеобразователь «Salcare SC80» и триэтаноламин.В частном случае указанные язвы, раны или ожоги являются инфицированными антибиотико-резистентными микроорганизмами(см. пат.RU 2781402, МПК⁵¹A61K 38/00, A61P 31/00, A61K 9/127).

Недостатком данного изобретения является трудоемкий процесс получения ниосомального антимикробного геля.

Известна модификация способа получения ниосом с использованием обращенно-фазной отгонки, предложенная Luciani с соавт.Согласно этому способу смесь Span 60, Solulan С-24, стеарилового эфира поли-100-оксиэтилена, холестерина, N-пальмитоилглюкозаминадиспергируется в водном растворе включаемого вещества (гадобенатдимеглюмина). Затем полученный раствор нагревают на водяной бане при 90°С в течение 30 мин и подвергают воздействию ультразвукового дезинтегратора в течение 5 мин (амплитуда 10 мкм). Среднее значение размеров частиц дисперсии при этом составило 163-268 нм в зависимости от соотношения компонентов препарата. Эффективность включения действующего вещества в микровезикулы, определенная методом спектрофотометрии, находилась в пределах 4,6-8% от общего количества гадобенатдимеглюмина (в молях), содержащегося в препарате (см. Luciani A., Olivier J.-C., Clement О., Siauve N., Brillet P.-Y., Bessoud В., Gazeau F., Uchegbu I., Kahn E., Frija G., Cuenod C. Glucose-Receptor MR imaging of tumors: study in mice with PEGylated paramagnetic niosomes // Radiology - 2004. - V. 231 (1). - P. 135-142).

Недостатком данного способа является низкая эффективность включения действующего вещества в микровезикулы.

Известен способ получения ниосомальных препаратов, в соответствии с которым смесь сорбитана моностеарата, холестерина и дицетилфосфата (молярное соотношение 47,5:47,5:5 соответственно) растворяют в 15 мл диэтилового эфира и эмульгируют в присутствии 2 мл водной фазы, содержащей действующее вещество (диклофенак натрия) в концентрации 5 мг/мл. Органический растворитель удаляют при пониженном давлении при комнатной температуре. Полученный гель затем гидратируют в присутствии 3 мл фосфатно-солевого буфера (pH 7,4). Смесь выдерживают при пониженном давлении до завершения гидратации. Эффективность включения действующего вещества составила 47,01±1,83% (см. Marwa A., Omaima S., Hanaa E.-G., Mohammed A.-S. Preparation and in-vitro evaluation of diclofenac sodium niosomal formulations // IJPSR - 2013. - V. 4 (5). - P. 1757-1765).

Рассмотренный способ имеет ряд существенных недостатков. В частности, в качестве органической фазы используется диэтиловый эфир, имеющий низкую температуру кипения, а также способный образовывать взрывоопасные смеси с воздухом и при хранении - нестойкие пероксиды, которые могут быть причиной самовоспламенения при комнатной температуре. В этом способе также отсутствует описание стандартизованных параметров температуры и времени этапа гидратации ниосомального геля, что может приводить к получению серий ниосомальных препаратов с разными показателями качества.

Известен способ получения ниосомальной формы офлоксацина. Хлороформенный раствор сорбитана моностеарата, холестерина, полиэтиленгликоля-4000 и дицетилфосфата в молярном соотношении 35:27:1:5 соответственно, смешивают с 0,025 М раствором калия фосфорнокислого, содержащего офлоксацин в соотношении 5:1 по объему и эмульгируют с помощью ультразвукового дезинтегратора в течение 5 мин. Затем удаляют хлороформ путем отгонки при пониженном давлении с использованием роторного испарителя, к полученному ПАВ-липидному гелю добавляют 20% от первоначального объема водной фазы и проводят гидратацию геля в течение 1 ч при (50±1)°C, после чего дисперсию ниосом выдерживают при температуре (22±2)°C в течение 12 ч (см. пат.RU 2583135, МПК⁵¹ A61K 31/538, A61K 47/34, B82B 3/00).

Рассмотренный способ имеет ряд недостатков, основными из которых является отсутствие стандартных условий обращенно-фазной отгонки и низкая эффективность включения для гидрофильных соединений.

Наиболее близким изобретением к описываемому способу по технической сущности является способ получения ниосомальной формы цефотаксима, включающий получение путем обращенно-фазовой отгонки, отличающийся тем, что хлороформенный раствор сорбитанамоностеарата (Span 60), холестерина, полиэтиленгликоля-4000 и дицетилфосфата в молярном соотношении 60:34:5:1 соответственно (38 ммоль компонентов на 50 мл хлороформа) смешивали с раствором цефотаксима (3 мг/мл) в 0,01 М фосфатно-солевом буферерН 7,40 в соотношении органической и водной фаз 5:1, затем смесь подвергают воздействию ультразвукового дезинтегратора течение 5 минут, амплитуда 7,5 мкм, частота 20 кГц, эмульсию перемещают в круглодонную колбу с тефлоновой мешалкой и отгоняют хлороформ на роторном испарителе в течение 20 минут при давлении 0,175 Бар, температуре (26±1)°С и 150 оборотах в минуту, затем 25 минут придавлении 0,175 Бар, температуре (55±1)°С, 200 оборотах в минуту, далее к смеси добавляют 20% первоначального объема водной фазы и продолжают отгонку в течение 45 минут при давлении 0,175 Бар, температуре (26±1)°С и 140 оборотах в минуту, препарат переносят в чистую посуду и оставляют при (20±5)°С на 12 ч (см. пат.RU 2687496, МПК⁵¹ A61K 31/429, A61K 47/34).

Недостатком данного изобретения является низкая эффективность включения для антибиотиков группы аминогликозидов.

Раскрытие изобретения

Задачей изобретения является разработка способа получения ниосомальной формы гентамицина, на основе неионных поверхностно-активных веществ.

Технический результат достигается с помощью способа получения ниосомальной формы гентамицина, в котором получение путем обращенно-фазовой отгонки, при этом хлороформенный раствор сорбитана моностеарата (Span 60), холестерина, дицетилфосфата и полиэтиленгликоля-2000 в молярном соотношении 50:44:5:1 соответственно смешивают с 10 мл водной фазы (10 мг/мл раствора гентамицина в 0,02М растворе фосфатно-солевого буфера).

Сущность способа получения ниосомальной формы гентамицина, включающий получение путем обращенно-фазовой отгонки, при этом хлороформенный раствор сорбитанамоностеарата (Span 60), холестерина, дицетилфосфата и полиэтиленгликоля-2000 в молярном соотношении 50:44:5:1 соответственно смешивают с 10 мл водной фазы (10 мг/мл раствора гентамицина в 0,02М растворе фосфатно-солевого буфера).

Краткое описание чертежей и их материалов

На таблице 1 (см. в графической части) способ получения ниосомальной формы гентамицина, эффективность инкапсуляции гентамицина в ниосомы различного состава.

Осуществление изобретения

Примеры конкретного выполнения способа получения ниосомальной формы гентамицина.

Определение эффективности включения препарата в ниосомы осуществляли по следующей методике.

К навеске ниосом с включенным в них гентамицином добавляют 4-кратный объем изопропилового спирта, выдерживают в течение 15 минут и тщательно перемешивают.Затем фильтруют через фильтр с размером пор 0,22 мкм и центрифугируют при 2700 g в течение 10 минут. Супернатант используют для количественного анализа содержания гентамицина. Количественный анализ на содержание антибиотика проводят методом обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографиис использованием калибровочных растворов гентамицина в качестве стандарта. Проводят не менее пяти измерений для каждого раствора. Эффективность включения антибиотика определяют относительно исходной концентрации по формуле:

где ЭВ - эффективность включения гентамицина в ниосомы, %; С - концентрация антибиотика в супернатанте, мг/мл; Сисх - исходная концентрация антибиотика в растворе, мг/мл.

Визуализация частиц в составе препарата проводится методом сканирующей зондовой микроскопии в электронном микроскопе для биологических исследований «EVO LS 10» («CarlZeiss», NTS Германия).

Для получения препаратов пригодных к изучению в электронном микроскопе взвесь везикул разводили в дистиллированной воде по стандарту мутности Государственного НИИ стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов (ГИСК) им. Л.А. Тарасевича. За единицу мутности была принята мутность суспензии живых клеток бактерий-возбудителей тифа в физиологических растворах, содержащих в 1 мл 100 млн клеток. Полученный раствор соответствующей мутности затем разводили водой I типа в соотношении 1:50 по объему. На двухсторонний углеродный диск наносили 1 мкл полученной взвеси, равномерно распределяя по поверхности. Полученные препараты высушивали на воздухе и сканировали в электронном микроскопедля определения формы и размера микрочастиц.

Расчет индекса полидисперсности определяли по формуле:

где r_w - среднемассовый радиус, r_n - среднечисленный радиус, N_i - общее количество измеренныхмикровезикул, r_i - результат отдельного измерения радиуса частицы.

Исследование гомогенности дисперсий с помощью проточной цитометрии проводили на приборе «Attune». Параметры измерения: объем пробы - 300 мкл, скорость потока - 100 мкл/мин. Условия прекращения регистрации: 10000 частиц, 5 мин. Для анализа результатов выбирают следующие оси соответствующих гистограмм: VL1-H - VL2-H.

Возможность практического применения заявленного способа подтверждается примерами его конкретного выполнения с использованием совокупности заявляемых признаков.

Пример 1

В 50 мл хлороформа растворяют при перемешивании сорбитан моностеарат (Span 60), холестерин, дицетилфосфат и полиэтиленгликоль ПЭГ-2000, в молярном соотношении составляют 50:44:5:1 соответственно. К смеси добавляют 10 мл водной фазы (10 мг/мл раствор гентамицина в 0,02 М растворе фосфатно-солевого буфера) рН 7,40. Смесь подвергают воздействию ультразвукового дезинтегратора (Soniprep 150, США) в течение 5 минут, амплитуда 7,5 мкм, частота 20 кГц. Эмульсию перемещают в круглодонную колбу с тефлоновой мешалкой и отгоняют хлороформ на роторном испарителе в режиме в течение 25 минут при давлении 0,175 Бар, температуре (26±1)°С и 150 оборотах в минуту, затем 30 минут при давлении 0,175 Бар, температуре (55±1)°С, 200 оборотах в минуту, далее к смеси добавляют 20% первоначального объема водной фазы и продолжают отгонку в течение 45 минут при давлении 0,175 Бар, температуре (26±1)°С, при 150 оборотах в минуту. Препарат переносят в чистую посуду и оставляют при (20±5)°С на 12 ч.

Опытные препараты ниосом содержат униламеллярные сферические или овальные микровезикулы со средним размером 263,4±21,2 нм. Индекс полидисперсности препаратов составил 0,21, что свидетельствует о высокой степени гомогенности системы. Эффективность включения антибиотиков в ниосомы составила 67,8±1,1%.

Пример 2

Отличается от примера 1 тем, что молярное соотношение сорбитана моностеарата, холестерина, дицетилфосфата и ПЭГ-2000 было 40:54:5:1.

Эффективность включения гентамицина составляет 48,2±2,9%. Опытные препараты ниосом содержат сферические или овальные микровезикулы со средним размером частиц 282,1±43,2 нм. Индекс полидисперсности препаратов составляет 0,21; частицы на гистограмме VL1-H - VL2-H формируют одну субпопуляцию.

Пример 3

Отличается от примера 1 тем, что молярное соотношение сорбитанамоностеарата, холестерина, дицетилфосфата и ПЭГ-2000 было 50:45:5:0.

Эффективность включения гентамицина составляет 65,0±4,5%. Опытные препараты ниосом содержат сферические или овальные микровезикулы со средним размером частиц 252,7±54,2 нм.

Пример 4

Отличается от примера 1 тем, что молярное соотношение сорбитанамоностеарата, холестерина, ПЭГ-2000 и дицетилфосфата было 60:34:5:1.

Эффективность включения гентамицина составляет 58,3±5,4%. Опытные препараты ниосом содержат сферические или овальные микровезикулы со средним размером частиц 269,0±39,8 нм. Индекс полидисперсности препаратов составляет 0,18; частицы на гистограмме VL1-H - VL2-H формируют одну субпопуляцию.

Пример 5

Отличается от примера 1 тем, что вместо сорбитана моностеарата (Span 60) использовали сорбитан моноолеат (Span 80).

Эффективность включения гентамицина составляет 48,7±1,4%. Опытные препараты ниосом содержат сферические или овальные микровезикулы со средним размером частиц 270,3±56,2 нм. Индекс полидисперсности препаратов составляет 0,21; частицы на гистограмме VL1-H - VL2-H формируют одну субпопуляцию.

Пример 6

Отличается от примера 1 тем, что вместо сорбитана моностеарата (Span 60) использовали Tween 60.

Эффективность включения цефотаксима составляет 20,9±2,6%. Опытные препараты ниосом содержат сферические или овальные микровезикулы со средним размером частиц 296,4±62,0 нм. Индекс полидисперсности препаратов составляет 0,20; частицы на гистограмме VL1-H - VL2-H формируют одну субпопуляцию.

Установлено, что оптимальный состав ниосом для инкапсулирования гентамицина включает Span 60, холестерин, дицетилфосфат и ПЭГ-2000 в соотношении 50:44:5:1. Эффективность включения антибиотиков в ниосомы составляет 67,8±1,1%. Таким образом, оптимальным является пример 1.

Предлагаемое изобретение по сравнению с другими известными техническими решениями имеет следующие преимущества: применение в качестве сложных эфиров стеариновой и олеиновой кислот обеспечивает устойчивость дисперсии к окислению и высокую эффективность включения гентамицина, а также биосовместимость и низкую токсичность; проведение трехэтапной обращенно-фазовой отгонки позволяет эффективно и воспроизводимо удалить хлороформ из готового препарата, без неконтролируемого вскипания смеси.

Изобретение относится к медицине и биотехнологии, в частности, к способу микрокапсулирования антимикробных препаратов в ниосомы. Может быть использовано в медицинской и ветеринарной практике при применении антибактериальных препаратов в составе ниосом, что снижает степень их инактивации и позволяет оптимизировать антимикробное действие за счет концентрации микровезикул на основе неионных поверхностно-активных веществ. Способ получения ниосомальной формы гентамицина, включающий получение путем обращенно-фазовой отгонки, отличающийся тем, что хлороформенный раствор сорбитанамоностеарата (Span 60), холестерина, дицетилфосфата и полиэтиленгликоля-2000 в молярном соотношении 50:44:5:1 соответственно смешивают с 10 мл водной фазы (10 мг/мл раствора гентамицина в 0,02М растворе фосфатно-солевого буфера). Способ обеспечивает получение ниосом с инкапсулированным антибактериальным препаратом с высокой эффективностью включения действующего вещества (до 67,8±1,1%). 6 пр., 1 табл.

Способ получения ниосомальной формы гентамицина, характеризующийся тем, что растворяют в 50 мл хлороформа сорбитан моностеарата (Span 60), холестерин, дицетилфосфат и полиэтиленгликоль-2000 в молярном соотношении 50:44:5:1, смешивают с 10 мл водной фазы, представляющей собой раствор гентамицина в 0,02 М растворе фосфатно-солевого буфера с концентрацией 10 мг/мл, смесь подвергают воздействию ультразвукового дезинтегратора в течение 5 минут, при амплитуде 7,5 мкм, частоте 20 кГц, из полученной эмульсии отгоняют хлороформ на роторном испарителе в режиме: в течение 25 минут при давлении 0,175 Бар, температуре (26±1)°С и 150 оборотах в минуту, затем 30 минут при давлении 0,175 Бар, температуре (55±1)°С, 200 оборотах в минуту, далее к смеси добавляют 20% первоначального объема водной фазы и продолжают отгонку в течение 45 минут при давлении 0,175 Бар, температуре (26±1)°С, при 150 оборотах в минуту.