УСТРОЙСТВО ДЛЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ДНК НА ОСНОВЕ КОНЦЕНТРАЦИИ Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Область техники

Данная заявка относится к методам секвенирования ДНК, основанным на измерении изменения концентрации добавленных нуклеотидов до и после реакции.

Уровень техники

Принципы секвенирования:

Ранее разработаны два основных метода секвенирования ДНК:

1 - Секвенирование путем синтеза:

- метод Сэнгера/метод обрыва цепи (Life Technologies, Applied Biosystems)

- пиросеквенирование (Roche/454)

- секвенирование на основе обратимых терминаторов (Illumina)

- секвенирование третьего поколения с использованием волноводов с нулевым режимом (Pacific Biosciences)

2 - Секвенирование путем лигирования и детекции олигонуклеотидов

- SOLiD (Applied Biosystems)

Ниже приводится более подробное описание этих методов.

1 - Секвенирование методом обрыва цепи (по Сэнгеру)

В этом методе используют модифицированную реакцию репликации ДНК, в которой растущие цепи обрываются дидезоксинуклеотидами (ddNTP). В дидезоксинуклеотидах (ddNTP) отсутствует 3'-ОН группа, необходимая для образования фосфодиэфирной связи. При добавлении фермента (ДНК-полимеразы) праймер удлиняется до тех пор, пока не будет обнаружен ddNTP. Цепь завершится включением ddNTP. При правильном соотношении dNTP: ddNTP цепь обрывается по всей длине шаблона. Все оборванные цепи завершаются ddNTP, добавленным к этой реакции. Полученные оборванные цепи разделяют электрофорезом. Для каждого из четырех ddNTP используется отдельный краситель или «цвет». Поскольку обрывающие нуклеотиды можно различить по цвету, все четыре реакции можно проводить в одной пробирке.

2 - Пиросеквенирование

Каждый нуклеотид добавляется по очереди в каждом цикле. Тогда только один из четырех генерирует световой сигнал. Для подготовки к следующему циклу оставшиеся нуклеотиды удаляют ферментативно. Световой сигнал записывается на пирограмму.

Пиросеквенирование основано на генерировании светового сигнала за счет высвобождения пирофосфата (PPi) при добавлении нуклеотидов.

- DNA_n+dNTP → DNA_n+i+PP_I

- PP_I применяют для генерирования аденозинтрифосфата (АТР) из аденозинпирофосфата (APS).

- APS+PP_I → ATP

ATP и люцифераза генерируют свет за счет преобразования люциферина в оксилюциферин.

3 - Волновод с нулевым режимом

Этот метод представляет собой секвенирование отдельной молекулы в реальном времени, основанное на детекции идентичности каждого нуклеотида сразу после его включения в растущую цепь ДНК.

4 - Секвенирование лигированием

Вместо полимеразы используется лигаза, которая соединяет последовательности зонда (фрагменты ДНК вместо олигонуклеотидов). После добавления зонда вырабатывается флуоресцентный сигнал. На основании флуоресценции можно сделать вывод об идентичности нуклеотида. Этот метод секвенирования включает более одного праймера, который отличается от предыдущего только одним основанием.

5 - Нанопоровое секвенирование

Используется наноразмерное устройство, которое перемещает молекулы полимера в последовательном порядке мономеров через очень небольшой объем пространства. Устройство включает детектор, который напрямую преобразует характерные особенности перемещающегося полимера в электрический сигнал. Трансдукция и распознавание происходят в режиме реального времени, от молекулы к молекуле. Устройство может исследовать тысячи различных молекул за несколько минут и может исследовать очень длинные участки ДНК.

6 - Секвенирование путем синтеза (SBS)

Секвенирование путем синтеза включает детекцию идентичности каждого нуклеотида сразу после его включения в растущую цепь ДНК в полимеразной реакции. SBS включает «флуоресцентное секвенирование «на месте» (FISSEQ) и метод пиросеквенирования.

С помощью фоторасщепляемого линкера к каждому из четырех оснований присоединяют разный флуорофор. ДНК-полимер аза включает комплементарный однонуклеотидный аналог. Обнаруживаемая уникальная флуоресценция зависит от включенного нуклеотида. Затем флуорофор удаляют фотохимически, группа 3-ОН химически регенерируется, и цикл продолжается.

Новое в данной заявке:

Принципы секвенирования и устройства для секвенирования включают в себя очень дорогостоящие приборы и инструменты. Кроме того, приобрести такую аппаратуру в наших лабораториях непросто. Большинство из этих методов сложны и требуют использования специальных ферментов или специальных меток, например флуоресцентных красителей, что увеличивает затраты на эксперименты. Поэтому необходимо разрабатывать и внедрять новые методы для упрощения технологии и снижения связанных с ней затрат.

Описание изобретения

Новый принцип:

Термин «секвенирование ДНК» обычно применяется к нескольким методам и технологиям, которые используются для определения порядка расположения нуклеотидных оснований: аденина, гуанина, цитозина и тимина в молекуле ДНК. Секвенирование ДНК широко применяют во многих прикладных областях, таких как диагностика, биотехнология, судебная биология и биологическая систематика, при секвенировании генома человека и в проекте «Геном человека». В предлагаемом устройстве для секвенирования фрагменты образцов ДНК амплифицируются обычным методом ПЦР. К синтезируемой ДНК добавляются отдельные нуклеотиды. Если нуклеотид комплементарен исследуемому фрагменту ДНК, изменение концентрации добавленного нуклеотида может быть отслежено любым методом.

Подробное описание устройства

Фрагменты геномной ДНК закреплены на твердой подложке. Каждый фрагмент ДНК амплифицируется методом ПЦР для получения кластера ДНК. В методе ПЦР температура реакционной смеси должна изменяться во время цикла ПЦР от 95°С до 40-60°С и, наконец, до 72°С в течение определенного количества циклов. Каждый кластер, происходящий из одного фрагмента ДНК, действует как одна реакция секвенирования. В реакции секвенирования кластер ДНК тестируется путем добавления одного из нуклеотидов за один раз. Если нуклеотид комплементарен, можно проследить изменение концентрации добавленного dNTP. Это изменение можно тестировать непосредственно в любой части камеры секвенирования.

Подробное описание камеры секвенирования

1. Твердая подложка, несущая фрагменты геномной ДНК, которые необходимо амплифицировать и затем протестировать на наличие комплементарных нуклеотидов. Эта камера оборудована электронными системами нагрева и охлаждения.

2. Каждый фрагмент ДНК амплифицируется методом ПЦР для получения кластера ДНК. В методе ПЦР температура реакционной смеси должна изменяться во время цикла ПЦР от 95°С до 40-60°С и, наконец, до 72°С в течение определенного количества циклов.

3. Четыре разных раствора, каждый из которых содержит все необходимые компоненты для добавления одного из четырех типов нуклеотидов в амплифицированный кластер ДНК, помещают в четыре разных контейнера.

4. В реакции секвенирования кластер ДНК тестируется путем добавления одного из нуклеотидов за один раз. Если нуклеотид комплементарен, можно проследить изменение концентрации. Это изменение можно тестировать непосредственно в любой части камеры секвенирования или вне ее.

Краткое описание фиг. 1

1 - Реакционная камера (1), содержащая твердую подложку, несущую фрагменты геномной ДНК, подлежащие амплификации любым методом.

2 - Система (2) нагрева и охлаждения любого типа для управления температурой реакционной камеры.

3 - Блок управления для управления всеми процессами, выполняемыми в реакционной камере (4), соединенный с блоком ввода в средства программирования и датчиками (5), (6) внутри или снаружи реакционной камеры, которые собирают данные и отправляют их в блок управления.

4 - Система (3) переноса жидкости и воды, несущая все необходимые растворы для тестирования кластера ДНК на наличие комплементарных нуклеотидов путем добавления одного из нуклеотидов за один раз и промывки.

5 - Измерительный блок, подключенный к датчикам (5) и (6), включая все типы датчиков, необходимые для проверки того, является ли нуклеотид комплементарным или нет, и для детекции любого изменения концентрации, которое можно отследить. Это изменение можно тестировать внутри камеры секвенирования или вне ее. Затем данные собираются и могут быть отправлены в главный блок управления.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и представляет собой устройство для секвенирования ДНК, содержащее: реакционную камеру, выполненную с возможностью приема образца нуклеиновой кислоты, содержит твердую подложку, несущую фрагменты геномной ДНК, подлежащие амплификации, при этом реакционная камера оснащена системами охлаждения и нагрева любого типа для регулирования температуры реакционной камеры, систему переноса жидкости для соответствующей доставки всех компонентов для добавления одного нуклеотида на каждом этапе реакции секвенирования, датчик любого типа, который может быть размещен в любой части внутри или снаружи реакционной камеры, обеспечивая информацию о концентрации нуклеотидов до и после добавления каждого нуклеотида, и систему управления, соединенную с блоком ввода и блоком вывода для соответствующего программирования, выполненную с возможностью управления частями устройства, регулирования температуры реакционной камеры и сбора данных, полученных от датчиков в реакционной камере. Изобретение позволяет осуществить секвенирование ДНК на основании изменения концентрации добавленных нуклеотидов до или после реакции. 7 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Устройство для секвенирования ДНК, содержащее:

а) реакционную камеру, выполненную с возможностью приема образца нуклеиновой кислоты, содержит твердую подложку, несущую фрагменты геномной ДНК, подлежащие амплификации,

при этом реакционная камера оснащена системами охлаждения и нагрева любого типа для регулирования температуры реакционной камеры,

б) систему переноса жидкости для соответствующей доставки всех компонентов для добавления одного нуклеотида на каждом этапе реакции секвенирования,

в) датчик любого типа, который может быть размещен в любой части внутри или снаружи реакционной камеры, обеспечивая информацию о концентрации нуклеотидов до и после добавления каждого нуклеотида, и

г) систему управления, соединенную с блоком ввода и блоком вывода для соответствующего программирования, выполненную с возможностью управления частями устройства, регулирования температуры реакционной камеры и сбора данных, полученных от датчиков в реакционной камере.

2. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что система управления соединена с блоком ввода для разработки программного обеспечения, системой переноса жидкости, реакционной камерой, датчиками контроля температуры и датчиками процессов секвенирования, которые различаются в зависимости от способа, используемого для обнаружения изменения концентрации любым способом, известным в данной области, и могут быть расположены внутри или снаружи реакционной камеры.

3. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что система переноса жидкости удаляет непрореагировавший нуклеотид после измерения концентрации нуклеотида на каждом этапе реакции секвенирования.

4. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что блок ввода включен для разработки программного обеспечения и выбора параметров.

5. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что система управления регулирует температуру, необходимую для амплификации образца перед началом реакции секвенирования, и поддерживает температуру для соответствующего добавления одного нуклеотида на каждом этапе реакции реакционной камеры, при этом системы охлаждения и нагрева любого типа и датчики соединены с реакционной камерой и подключены к блоку управления.

6. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что внутри реакционной камеры можно размещать много контрольных образцов для большей точности и воспроизводимости результатов.

7. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что обнаружение изменения концентрации добавленного нуклеотида осуществляют датчиком любого типа, при этом датчики системы обнаружения могут быть расположены внутри или снаружи реакционной камеры.

8. Устройство по п. 1, отличающееся тем, что в нем не определено конкретное количество образцов.