Набор олигонуклеотидных праймеров для определения метилирования промотора гена человека CCR5 в образах биологического материала, подвергшегося предварительной бисульфитной конверсии, методом пиросеквенирования Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к определению метилирования промотора гена CCR5 в образах биологического материала, подвергшегося предварительной бисульфитной конверсии, методом пиросеквенирования. Изобретение предназначено для оценки уровня метилирования промоторных областей гена CCR5 и может применяться в исследованиях по изучению влияния метилирования генов хозяина на жизненный цикл вируса иммунодефицита человека (ВИЧ).

ВИЧ-инфекция длительно текущая инфекционная болезнь, развивающаяся в результате инфицирования ВИЧ, поражающего и вызывающего гибель клеток иммунной системы. Вирус передается от человека к человеку половым путем, при переливании крови или ее компонентов, пересадке органов, парентеральных вмешательствах, а также от инфицированной матери к плоду во время беременности, при прохождении ребенка по родовому пути и грудном вскармливании. Проникновение ВИЧ в клетку регулируется рецепторами CCR5 и CXCR4, располагающихся на поверхности CD4+ клеток. Метилирование цитозина в промоторе гена является одним из механизмов регуляции экспрессии белка. Гиперметилирование определенных локусов в промоторе гена CCR5 может ингибировать работу данного рецептора.

Определение потенциальных мишеней для создания отечественных персонализированных подходов при разработке генотерапевтических препаратов является перспективной задачей. С целью определения таких потенциальных мишеней предложено определить статус метилирования промотора гена CCR5 методом пиросеквенирования.

Известны протоколы исследования направлены на выявление специфических нуклеотидных последовательностей в генах и межгенных промежутках, в частности: для определения уровня метилирования в промоторе гена NTRK3 [патент CN 113265464, дата подачи 12.05.2021, дата публикации 17.08.2021]; для определения уровня метилирования гена. Sox 10 [патент CN 108753958, дата подачи 30.08.2018, дата публикации 06.11.2018]; для обнаружения метилирования промотора гена NLRP3 [патент CN 113416783, дата подачи 08.07.2021, дата публикации 21.09.2021]; для определения уровня метилирования гена CDH1 [патент CN 109136375, дата подачи 12.09.2018, дата публикации 04.01.2019]; для определения уровня метилирования гена VGLL3 [патент CN 113249486, дата подачи 28.06.2021, дата публикации 13.08.2021]; для количественного определение уровня метилирования гена DMBT1 [патент CN 103276095, дата подачи 07.06.2013, дата публикации 04.09.2013]. Решения, описанные в упомянутых изобретениях, не предусматривают определение метилирования промотора гена человека CCR5.

Из уровня техники также известен набор реагентов «АмплиСенс® Пироскрин CCR5del32-скрин. Профиль генетического исследования «CCR5del32» [https://www.amplisens.ra/catalog/nabory-reagentov-dlya-vyyavleniya-geneticheskikh-polimorfizmov-snpanaliz/nabory-reagentov-dlya-detektsii-snp-metodom-pirosekvenirovaniya/amplisens-piroskrin-ccr5del32skrin-profil-geneticheskogo-issledovaniya-ccr5del32/] а также способ определения аллельного полиморфизма CCR5 delta 32 [патент RU 2563172, дата приоритета 12.11.2014], посредством которых определяют полиморфизм CCR5 delta 32 методом пиросеквенирования. Однако, данные решения не предназначены для определения уровня метилирования указанного гена CCR5.

Технический результат заявляемого решения направлен на выявление метилированных участков промотора гена CCR5 в образцах биологического материала посредством таких олигонуклеотидов - праймеров которые позволяют эффективно определять уровень метилирования промотора гена CCR5 с использованием метода пиросеквенирования.

Заявленный технический результат достигается за счет применения химически-синтезированных олигонуклеотидов для определения метилированных участков промотора гена CCR5, имеющих следующий состав:

прямой праймер 2CCR5-Fp - SEQ ID NO: 1,

обратный праймер 2CCR5-Rp - SEQ ID NO: 2,

секвенирующий праймер 2CCR5-S - SEQ ID NO: 3.

Праймеры представляют собой последовательности олигонуклеотидов для амплификации фрагмента, содержащего промотор гена CCR5 в образцах биологического материала.

Олигонуклеотиды, входящие в состав заявляемого набора, разработаны на основе проведенного анализа конвертированных последовательностей промотора гена CCR5 человека, (взятых из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)), в результате выбран фрагмент для детекции метилированного участка промотора гена CCR5 к которому подобраны прямой и обратный праймеры для амплификации фрагмента длиной 121 пара оснований, а также праймер для пиросеквенирования (прямой праймер 2CCR5-Fp - SEQ ID NO: 1; обратный праймер 2CCR5-Rp - SEQ ID NO: 2; секвенирующий праймер 2CCR5-S - SEQ ID NO: 3).

Для подбора целевых последовательностей - мест посадки олигонуклеотидов, используют фрагменты референсных геномов человека из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Для поиска промоторов гена используют данные базы Eukaryotic Promoter database (https://epd.epfl.ch//index.php). Составляют перечень мишеней для детекции метилированных участков промотора гена CCR5 с помощью базы данных UCSC Genome browser (http://genome.ucsc.edu/) путем наложения последовательности CpG-островков на последовательность промотора гена. Затем подбирают олигонуклеотидные последовательности прямого и обратного праймеров, а также праймера для пиросеквенирования с учетом проведения бисульфитной конверсии исследуемых последовательностей. Упомянутые олигонуклеотидные последовательности приведены в Таблице 1.

Анализ результатов секвенирования продемонстрировал, что прямой праймер 2CCR5-Fp (SEQ ID NO: 1) и обратный праймер 2CCR5-Rp (SEQ ID NO: 2) в реакции пиросеквенирования с секвенирующим праймером 2CCR5-S (SEQ ID NO: 3) амплифицируют участок промотора гена человека CCR5 со 100% специфичностью.

В качестве материала используется обработанная бисульфитом ДНК, экстрагированная из цельной (венозной) крови человека.

ПЦР-исследование проводят в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности». Для экстракции ДНК может быть использован комплект реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия) или любой аналогичный набор/комплект реагентов для выделения ДНК. Оптимальная концентрация ДНК - 10³ - 10⁵ копий в 10 мкл. Реакцию бисульфитной конверсии проводят с помощью комплекта реагентов «EpiTect Bisulfite Kit» (QIAGEN, Германия) или аналогичного коммерчески-доступного комплекта реагентов в соответствии с инструкцией производителя.

Пиросеквенирование - метод определения нуклеотидной последовательности в режиме реального времени, основанный на детекции высвобождающегося пирофосфата после цепочки ферментативных реакций. Определение осуществляется в ходе следующего процесса: в начале проводится наработка ампликона специфического фрагмента последовательности исследуемого гена методом полимеразной цепной реакции.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это эффективный способ получения in vitro большого числа копий специфических нуклеотидных последовательностей. Их амплификация осуществляется в ходе трехэтапного циклического процесса.

Процесс ПЦР-амплификации заключается в многократном повторении процессов денатурации, ренатурации и синтеза. Денатурация (95°С) - термическое воздействие на молекулу ДНК с целью получения одноцепочечной структуры. Ренатурация (55-60°С) - праймеры, добавленные в реакцию спариваются с разделенными цепями. Синтез (70-75°С) - синтез второй цепи ДНК. Каждый цикл длится 3-5 мин.

Затем проводится инкубация праймера и одноцепочечной матрицы в присутствии ДНК-полимер азы, АТФ-сульфурилазы, люциферазы, апиразы, и субстратов: аденозин - 5'-фосфосульфата (APS) и люциферина. Затем проводят добавление первого дезоксирибонуклеотид трифосфата (dNTP) в реакцию. ДНК-полимераза катализирует добавление dNTP к праймеру для секвенирования, если он комплементарен к последовательности матрицы ДНК. Каждое присоединение к цепи сопровождается выделением пирофосфата (PPi) в количестве, эквимолярном количеству встроившихся нуклеотидов. АТФ-сульфурилаза превращает пирофосфат в АТФ в присутствии аденозин-5'-фосфосульфата.

Образовавшаяся АТФ запускает люциферазо-опосредованную реакцию окисления люциферина в оксилюциферин, в результате чего происходит образование видимого света в количестве, пропорциональном количеству АТФ. Свет детектируется CCD-камерой и отображается на пирограмме в виде пиков. Высота пиков пропорциональна количеству нуклеотидов, встроившихся в матрицу. В течение всей реакции фермент апираза деградирует невстроившиеся нуклеотиды и избыток АТФ. После завершения деградации нуклеотидов, невстроившихся в цепь ДНК, добавляется новый нуклеотид. Добавление нуклеотидов осуществляется последовательно. В течение реакции комплементарная цепь ДНК достраивается, и последовательность нуклеотидов определяется согласно пикам на пирограмме. Процент метилирования искомых CpG-нуклеотидов в анализируемой последовательности определяется программным обеспечением прибора автоматически.

Для детекции метилированных участков промотора гена человека CCR5 проводят ПЦР с применением представленных в Таблице 1 олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO: 1,2.

ПЦР проводят при следующих условиях:

Общий объем реакционной смеси - 25 мкл.

Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:

(a) 5 мкл смеси, содержащей:

- олигонуклеотидные праймеры SEQ ID NO NO: 1, 2 - по 0,7 мМ;

- dNTPs - 0,44 мМ.

(b) реактив, содержащий рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу, например, 0,5 мкл «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любой аналогичный коммерческий набор в соответствии с инструкцией производителя.

(c) ПЦР-буфер, содержащий Сульфат аммония и MgCl2, например, 10,0 мкл ПЦР-буфера «ПЦР-буфер blue» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любого аналогичного коммерческого набора в соответствии с инструкцией производителя.

(d) полученная методом бисульфитной конверсии ДНК 10 мкл.

Амплификацию проводят на любом амплификаторе в соответствии с инструкцией производителя. При постановке реакции амплификации на приборе «Терцик» (НПО «ДНК-технология», Протвино, Россия) перед добавлением образцов необходимо добавить 10 мкл минерального масла для ПЦР.

Амплификацию проводят по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 секунд.

Реакцию пиросеквенирования проводят с применением секвенирующего праймера SEQ ID NO: 3, представленного в Таблице 1. Количество реагентов для работы с прибором рассчитывается программным обеспечением прибора автоматически. Пробоподготовку образцов перед реакцией пиросеквенирования проводят на наборе реагентов ПИРО-преп (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) или любом аналогичном коммерческом наборе в соответствии с инструкцией производителя согласно инструкции производителя.

Заявляемое изобретение является результатом работы в рамках внутреннего гранта «Влияние статуса метилирования ДНК у ВИЧ-1 положительных лиц на реактивацию вирусных резервуаров» ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора (Москва, Россия), номер 122053000056-2.

Реализация заявляемого изобретения поясняется следующими примерами:

Пример 1. Получение набора олигонуклеотидных прайм срок для определения метилирования промотора гена CCR5.

Для подбора целевых последовательностей - мест посадки олигонуклеотидов, использовали фрагменты референсных геномов человека из базы данных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Для поиска промоторов гена использовали данные базы Eukaryotic Promoter database (https://epd.epfl.ch//index.php). Составили перечень мишеней для детекции метилированных участков промотора гена CCR5 с помощью базы данных UCSC Genome browser (http://genome.ucsc.edu/) путем наложения последовательности CpG-островков на последовательность промотора гена, на основании которых подобраны олигонуклеотидные последовательности прямого 2CCR5-Fp и обратного 2CCR5-Rp праймеров, а также секвенирующего праймер 2CCR5-S.

Олигонуклеотиды для определения метилированного участка промотора гена человека CCR5 - прямой праймер 2CCR5-Fp, обратный праймер 2CCR5-Rp, праймер для пиросеквенирования 2CCR5-S, представлены уникальными последовательностями SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 и SEQ ID NO: 3 соответственно.

Пример 2. Подтверждение присутствия ампликона, содержащего участок промотора гена CCR5 методом ПЦР с детекцией в агарозном геле.

Подтверждение присутствия ампликона, содержащего участок промотора гена CCR5 проводили методом ПЦР. Общий объем реакционной смеси - 25 мкл.

Компоненты ПЦР смешиваются следующим образом:

(a) 5 мкл смеси, содержащей:

- олигонуклеотидные праймеры: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 - по 0,7 мМ;

- dNTPs - 0,44 мМ.

(b) 0,5 мкл реактива «Полимераза TaqF» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего рекомбинантный фермент Taq ДНК-полимеразу.

(c) 10,0 мкл ПЦР-буфера «2.5х ПЦР-буфер blue» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия), содержащего MgCl₂.

(d) 10,0 мкл минерального масла для ПЦР (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Россия).

(e) 10,0 мкл ДНК, подвергшейся бисульфитной конверсии.

ПЦР проводили с детекцией результата в агарозном геле. Длина получившегося фрагмента соответствовала ожидаемой (121 пара нуклеотидов).

Подготовленный описанным способом материал, содержащий уникальные олигонуклеотидные последовательности (SEQ ID NO:l, 2) участка промотора гена CCR5, использовали для определения метилирования участка промотора гена CCR5 при помощи пиросеквенирования в образцах биологического материала.

Пример 3. Определение метилирования промотора гена CCR5 методом пиросеквенирования.

Для определения метилированного участка промотора гена человека CCR5 выбрано 20 образцов ДНК человека, обработанных методом бисульфитной конверсии.

Для исследования использовали клинический материал - цельная венозная кровь человека.

Выделение ДНК из биологического материала проводили в соответствии с МУ 1.3.2569-09 «Организация работ лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».

Выделение ДНК осуществляли методом преципитации нуклеиновых кислот с применением набора реагентов «РИБО-преп» (ФБУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия) в соответствии с инструкцией к набору.

Бисульфитную обработку проводили с применением набора реагентов «EpiTect Bisulfite Kit» (QIAGEN, Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

ПЦР проводили в условиях, описанных в Примере 2, с использованием уникальных олигонуклеотидных последовательностей SEQ ID NO: 1,2.

Амплификацию проводили на приборе «Терцик» («НПО ДНК-Технология», Протвино, Россия) по следующей программе: 1 цикл 95°С в течение 15 минут, 45 циклов при температуре 95°С - 10 секунд / 60°С - 20 секунд.

Пиросеквенирование проводили на приборе PyroMark Q24 («Qiagen», Германия) с набором реагентов, рекомендованным производителей (PyroMark Gold Q24 Reagents («Qiagen», Germany)), при инкубации использовался секвенирующий праймеро 2CCR5-S (SEQ ID NO: 3). Прибор запускался по следующей программе:

SA: YGTTTTTTTATAAGAAATTTTTTTYGGTAAG;

DO: ATCGTTATAGTATTCGTA.

Расчет количества реагентов автоматически произведен программным обеспечением прибора.

Во всех образцах при проведении пиросеквенирования последовательность читаема, полученные пики ожидаемой высоты, заданная прибору последовательность совпадает с полученной.

Таким образом, во всех 20 образцах, содержащих метилированные участки промотора гена человека CCR5, удается проанализировать результаты и получить при помощи программного обеспечения прибора процент метилирования.

Набор уникальных синтезированных олигонуклеотидных праймеров SEQ ID NO: 1-3 не дает перекрестных реакций с другими последовательностями генома, амлифицирует последовательность, включающую целевые метилированные локусы в промоторе гена CCR5 со 100% специфичностью, что подтверждено вышеуказанными условиями секвенирования.

Изобретение относится к биотехнологии. Представлен набор олигонуклеотидных праймеров для определения метилирования промотора гена человека CCR5 в образах биологического материала. Набор включает прямой праймер 2CCR5-Fp - TAT GAT TGA TTT GTA TAG TTT ATT TGG TTA, обратный праймер 2CCR5-Rp - CTC АТС TCA AAA ACT AAC TAA С, секвенирующий праймер 2CCR5-S - GGT TAG AAG AGT TGA GAT ATT. Синтезированные олигонуклеотиды не дают перекрестных реакций с другими последовательностями генома, амплифицируют последовательность, включающую целевые метилированные локусы в промоторе гена CCR5 со 100% специфичностью. 4 з.п. ф-лы, 1 табл., 3 пр.

1. Набор олигонуклеотидных праймеров для определения метилирования промотора гена человека CCR5 в образах биологического материала, имеющий следующий нуклеотидный состав:

прямой праймер SEQ ID NO: 1

2CCR5-Fp - TAT GAT TGA TTT GTA TAG TTT ATT TGG TTA,

обратный праймер SEQ ID NO: 2

2CCR5-Rp - CTC АТС TCA AAA ACT AAC TAA С,

секвенирующий праймер SEQ ID NO: 3

2CCR5-S - GGT TAG AAG AGT TGA GAT ATT.

2. Набор по п. 1, где прямой праймер 2CCR5-Fp и обратный праймер 2CCR5-Rp применяют на этапе проведения ПЦР для подтверждения присутствия ампликона, содержащего участок промотора гена CCR5.

3. Набор по п. 1, где секвенирующий праймер 2CCR5-S применяют для проведения реакции пиросеквенирования.

4. Набор по п. 1, где обратный праймер 2CCR5-Rp содержит модификацию biotin для иммобилизации на твердых носителях.

5. Набор по п. 1, где входящие в его состав олигонуклеотидные праймеры разработаны на основе промотора гена CCR5.