Способ получения безвирусного посадочного материала перспективных сортов земляники с применением культуры ткани in vitro на модернизированной питательной среде Российский патент 2023 года по МПК A01H4/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения безвирусного посадочного материала сортов земляники с применением модернизированной питательной среды для этапа мультипликации, основанной на замене химически чистых (ХЧ) или чистых для анализа (ЧДА) реактивов, применяемых для создания стандартной питательной среды Murashige & Skoog medium including vitamins original concentration (1962), на комплексные водорастворимые удобрения АгроМастер 15.5.18 и Агромикс.

Предлагаемое изобретение позволяет увеличить интенсивность образования пазушных почек у рассматриваемых сортов земляники, а также снизить себестоимость производства оздоровленного посадочного материала.

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к отрасли биотехнологии в растениеводстве, и может быть использовано для массового получения качественного оздоровленного посадочного материала ценных сортов земляники методом in vitro в питомниководстве.

Уровень техники

Известно, что базовой средой для технологии in vitro в мировой практике является среда Murashige & Skoog medium including vitamins original concentration (1962) [2].

Недостатком данной питательной среды является то, что для ее приготовления используются химически чистые реактивы (ХЧ) или чистые для анализа (ЧДА), согласно ГОСТ 13867-68 [1], что является основным недостатком данного способа приготовления питательных сред, так как высокая стоимость химически чистых реактивов приводит к высокой добавленной стоимости промышленного производства посадочного материала.

Известен способ получения универсальной питательной среды Мурасиге-Скуга для размножения сортов земляники Ирма, Елизавета в условиях in vitro (патент RU 27417781 С1, МПК А01Н 1/00 (2006.01), опубл. 14.05.2021 г.), основанный на снижении концентрация 6 - БАП с 0,5 мл/л до 0,35 мл/л с последующим стимулированием продуцирования цитокининов растениями, содержанием индолилуксусной кислоты (ИУК) 0,2 мг/л при одновременном снижении концентрации углеводного компонента (сахароза) до 25 г/л.

Основным недостатком указанного питательного раствора является то, что дисбаланс цитокининов и ауксинов в растительном организме не позволяет получить высокий коэффициент микроразмножения. В связи с этим, важно учесть особенности гормонального состава организмов различных породно-сортовых групп растений при корректировке питательных растворов.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому решению и принятым за прототип является способ получения питательной среды для микроклонального размножения земляники, в основе которой химически чистые удобрения заменяются комплексными водорастворимыми. Компонентный состав среды состоит из следующих элементов: кальций хлористый, пиридоксин, тиамин, никотиновая и аскорбиновая кислоты, мезоинозит, сахароза агар-агар, индолилуксусная кислота, дистиллированная вода. Основное отличие заключается во введении в среду комплексных водорастворимых удобрений АгроМастер 15.5.18 и Агромикс [3].

Раскрытие изобретения

Задачей предлагаемого изобретения является получение модифицированной питательной среды для этапа мультипликации, способствующей увеличению интенсивности формирования пазушных почек и прироста длины образовавшихся вегетативных частей, а также снизить себестоимость производимых саженцев.

Технический результат, который может быть достигнут с помощью предлагаемого изобретения, сводится к разработке промышленного способа получения безвирусного посадочного материала путем модификации питательной среды, позволяющей повысить эффективность микроклонального способа размножения посадочного материала земляники и снизить себестоимость производимых саженцев.

Технический результат достигается тем, что способ получения безвирусного посадочного материала земляники с применением культуры ткани in vitro на модернизированной питательной среде включает приготовление модернизированной среды, состоящей из компонентов мг/л:

АгроМастер 15.5.18 3375 Аммиачная селитра 825 Агромикс 1000 CaCl₂ 332 Тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота по 0,5 Мезоинозит 100 Сахароза 20000 Агар-агар 8000 6 ВАР 1 Дистиллированная вода Остальное,

при этом объем доводится до 1 литра дистиллированной водой, в результате чего рН устанавливается на уровне 5,6-5,8, далее полученную питательную сред разливают в культивационные контейнеры и автоклавируют при давлении 1 атмосфера с выдержкой 20 минут, когда среда остывает, ее разливают в контейнеры в ламинарном боксе и проводят переноса эксплантов на питательную среду, с последующим переносом контейнеров в световую комнату с температурой 24±2°С, уровнем освещенности 5 тыс. люкс с 16-часовой продолжительностью световой фазы, способ выполняется в трехкратной повторности на фоне контроля, учет показателей проводится каждые 7 суток.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 - Характеристики сортового состава земляники различной селекции, типа плодоношения и отношения к продолжительности светового дня, используемый в опыте.

На фиг. 2 - Количественный состав содержания макро, мезо-, и микро-, элементов в стандартных и модернизированных средах.

На фиг. 3 - Питательная среда для стимулирования роста пазушных почек растений земляники.

На фиг. 4 - Сравнительный расчет себестоимости компонентов среды MURASHIGE & SKOOG MEDIUM INCL. NITSCH VITAMINS, приготовленной из химически чистых реактивов и модернизированной ростовой среды 1 (для этапа мультипликации), приготовленной из стандартных водорастворимых комплексных удобрений.

Осуществление изобретения

Основа изобретения состоит в том, что базовая среда для микроклонального размножения земляники готовится из водорастворимых форм комплексных удобрений АгроМастер (NO₃^-; NH₄⁺=15%; P₂O₅=5%; K₂O=18%; MgO=2%; В=0,04%; Fe=0,012%; Mn=0,08%; Zn=0,05%; Cu=0,03%; Мо=0,01%), Аммиачная селитра (N=34,6%), Агромикс (В=0,6%; Fe=3,5%; Mn=2,5%; Zn=2,0%; Cu=0,4%; Мо=0,15%; Са=3,0%; Со=0,02%), хелатированных форм микроэлементов Fe EDTA (11%), Mn EDTA (13%), Zn EDTA (15%), Mg EDTA (6%), Агробор 21 (20%), так как именно эти марки удобрений наиболее оптимально подходят по своему количественному составу к базовой среде Murashige & Skoog medium incl. nitsch vitamins [3].

Предложенный нами вариант среды имеет существенное отличие от стандартных питательных сред тем, что в ее составе содержатся водорастворимые комплексные удобрения АгроМастер и Агромикс. В связи с этим данное техническое решение выделяется своей новизной.

Данный технический подход имеет изобретательскую составляющую, так как модернизированный состав питательной среды на основе удобрений не использовался ранее для микроклонального размножения земляники. Соответственно, этот способ используется впервые.

Удобрения АгроМастер и Агромикс, входящие в состав модернизированных питательных сред, производятся промышленностью Р.Ф. и соответственно могут применяться в любой лаборатории специализирующейся на размножении растений.

Пример 1 (Среда 1 - ростовая). Готовится модернизированная питательная среда компонентами которой являются мг/л: АгроМастер 15.5.18 - 3375, аммиачная селитра - 825, Агромикс - 1000, CaCl₂ - 332, тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота - по 0,5, фолиевая кислота - 2, мезоинозит - 100, сахароза - 20000, агар-агар - 8000, 6 ВАР - 1. Объем доводится до 1 литра дистиллированной водой, устанавливается рН на уровне 5,6-5,8. Полученная питательная среда и культивационные контейнеры автоклавируются при давлении 1 атмосфера с выдержкой 20 минут. Остывшая среда разливается в контейнеры в ламинарном боксе. Процесс переноса эксплантов на питательную среду проводится в ламинарном боксе, с последующим переносом контейнеров в световую комнату с температурой 24±2°С, уровнем освещенности 5 тыс. люкс, 16-часовой продолжительностью световой фазы. Опыты выполняются в трехкратной повторности на фоне контроля. Учет показателей проводится каждые 7 суток.

На основании анализа основных компонентов оригинальных рабочих сред (фиг. 2) был произведен пересчет по элементам питания для модернизированной среды, с учетом содержания в них элементов питания, находящихся в предлагаемых водорастворимых комплексных удобрениях и хелатах. Содержание витаминов в модернизированных питательных средах было сохранено на уровне стандартных рекомендаций для среды Quoirin & Lepoivre medium including vitamins.

Оценка эффективности сред проводилась по показателям, представленным на фиг. 3 и 4.

Анализ полученных данных доказывает эффективность применения модернизированной среды 1

Культивирование микроклонов земляники, в течение 28 суток показал значительный прирост пазушных почек, но в то же время высота общего прироста явных признаков увеличения не проявила.

Сравнительный расчет себестоимости компонентов среды Murashige & Skoog medium incl. nitsch vitamins, приготовленных из химически чистых реактивов и модернизированной среды 1 приготовленной из стандартных водорастворимых комплексных удобрений доказал значительное снижение себестоимости последней (фиг. 5).

Данный метод подхода к решению вопросов оптимизация технологического процесса соответствует уровню новизны в области промышленного питомниководства, так как позволяет упростить основные виды операций и значительно снизить себестоимость основных затрат на приобретение химически чистых компонентов для приготовления питательных сред с увеличением количественных и качественных показателей по процессам деления и укоренения.

По сравнению с прототипом заявленный способ имеет следующие преимущества:

- повышает интенсивность закладки пазушных почек у микрочеренков,

- активизирует рост образованных вегетативных побегов,

- снижает себестоимость производства посадочного материала.

Источники информации

1. ГОСТ 13867-68, Продукты химические. Обозначение чистоты, Государственный комитет по стандартам, Москва.

2. Biochemicals Plant Cell and Tissue Culture Plant Molecular Biochemicals Phytopathology / Seed Health Testing Antibiotics., Catalogue edited by drs. F.T.M. Kors., DUCHEFA BIOCHEMIE B.V.

3. Патент 2485768 C1, МПК A01H 4/00 (2006.01), Питательная среда для ризогенеза яблони и груши in vitro, Пронина Ирина Николаевна, Матушкина Ольга Васильевна.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии. Изобретение представляет собой способ получения безвирусного посадочного материала сортов земляники с применением модернизированной питательной среды для этапа мультипликации, основанной на замене химически чистых (ХЧ) или чистых для анализа (ЧДА) реактивов, применяемых для создания стандартной питательной среды Murashige & Skoog medium including vitamins original concentration (1962), на комплексные водорастворимые удобрения АгроМастер 15.5.18 и Агромикс. Способ включает приготовление модернизированной среды, состоящей из компонентов, мг/л: АгроМастер 15.5.18 - 3375, Аммиачная селитра - 825, Агромикс - 1000, CaCl₂ - 332, Тиамин, Пиридоксин, Никотиновая кислота - по 0,5, Мезоинозит - 100, Сахароза - 20000, Агар-агар - 8000, 6 ВАР - 1, дистиллированная вода - остальное, при этом объем доводят до 1 литра дистиллированной водой, в результате чего рН устанавливается на уровне 5,6-5,8, далее полученную питательную сред разливают в культивационные контейнеры и автоклавируют при давлении 1 атмосфера с выдержкой 20 минут, когда среда остывает, ее разливают в контейнеры в ламинарном боксе и проводят перенос эксплантов на питательную среду с последующим переносом контейнеров в световую комнату с температурой 24±2°С, уровнем освещенности 5 тыс. люкс с 16-часовой продолжительностью световой фазы, способ выполняют в трехкратной повторности на фоне контроля, учет показателей проводят каждые 7 суток. Изобретение позволяет повысить эффективность микроклонального способа размножения посадочного материала земляники. 5 ил.

Способ получения безвирусного посадочного материала перспективных сортов земляники с применением культуры ткани in vitro на модернизированной питательной среде, включающий приготовление модернизированной среды, состоящей из компонентов, мг/л:

АгроМастер 15.5.18 3375 Аммиачная селитра 825 Агромикс 1000 СаСl₂ 332 Тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота по 0,5 Мезоинозит 100 Сахароза 20000 Агар-агар 8000 6 ВАР 1 Дистиллированная вода Остальное,

при этом объем доводят до 1 литра дистиллированной водой, устанавливая рН на уровне 5,6-5,8, далее полученную питательную среду разливают в культивационные контейнеры и автоклавируют при давлении 1 атмосфера с выдержкой 20 минут, когда среда остывает, ее разливают в контейнеры в ламинарном боксе и проводят перенос эксплантов на питательную среду с последующим переносом контейнеров в световую комнату с температурой 24±2°С, уровнем освещенности 5 тыс. люкс, с 16-часовой продолжительностью световой фазы, способ выполняют в трехкратной повторности на фоне контроля, учет показателей проводят каждые 7 суток.