Питательная среда для микроклонального размножения безвирусных растений картофеля Российский патент 2025 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области сельского хозяйства и биотехнологии и может использоваться для ускоренного размножения безвирусных растений картофеля при их массовом производстве для семеноводства картофеля на безвирусной основе.

Картофель относится к интенсивным сельскохозяйственным культурам. Для значительной части населения он входит в число основных продуктов питания. В большинстве стран, в том числе и в России, сложилась и законодательно утверждена система семеноводства картофеля, направленная на максимальное снижение поражаемости его возбудителями болезней различной природы, заражающих растения и передающихся через семенные клубни. Переход семеноводства на безвирусную основу требует строго последовательного выполнения этапов работы по оздоровлению семенного материала, которые базируются на методах биотехнологии. Одним из основных и важных этапов этой работы является микроклональное размножение оздоровленных безвирусных растений картофеля. Процесс размножения картофеля в культуре in vitro осуществляется в искусственных условиях фитотрона на питательных средах. Состав питательных сред для культивирования и размножения микрорастений постоянно модифицируется.

Известна питательная среда для микроклонального размножения картофеля, которая содержит в качестве замедлителя роста парааминобензойную кислоту (патент RU 2228354 С2, МПК C12N5/04//A01 Н 4/00, 2004 г.).

Недостатком изобретения является ограниченное использование данного состава среды: она пригодна только для поддержания коллекционного материала картофеля, так как замедляет рост растений и поэтому не подходит для применения при массовом производстве безвирусных микрорастений, когда за короткий срок нужно получить большое количество микроклонов.

Известна модифицированная питательная среда для культивирования растений картофеля на основе питательной среды Мурасиге-Скуга, содержащая нанокомпозит на основе природных полисахаридов (патент RU 2794777 С1, МПК С 05G 3/00, 2023 г.).

Недостатком изобретения является трудоемкий и сложный процесс синтеза компонентов нанокомпозитов и использование дорогостоящего к-каррагинана (III) импортного производства, вводимого в питательную среду, что не способствует широкому применению в практике микрокло-нального массового размножения безвирусных растений картофеля.

Известен способ размножения гречихи in vitro с добавлением в питательную среду сернокислой меди в количестве от 9,2 до 23,0 мг/л (патент RU 2538167 С1, МПК А01Н 4/00, 2015 г.), при котором статистически достоверно увеличился выход растений гречихи в 1,7-1,9 раза, чем на контрольной среде с содержанием сернокислой меди 0,025 мг/л.

На картофеле физиологическое и гормональное влияние меди подтверждено исследованиями А.С. Гуревич (Гуревич А.С. Изменение гормонального баланса растений картофеля [Solanum tuberosum L.) под действием предпосадочной обработки материнских клубней сульфатом меди. Известия Калининградского государственного технического университета. (2012), 27, 131-140). Однако публикации о действии сульфата меди на микрорастения картофеля в условиях in vitro отсутствуют.

Наиболее близкой по технической сущности к заявляемому изобретению является питательная среда с минеральной основой по Мурасиге-Скуга (далее МС) (Murashige, Т., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tussue cultures. Physiol. Plant. (1962), 15, 473-497.), дополненная рекомендуемым соотношением компонентов согласно исследованиям А.И. Замотаев и др. (Методические указания по ускоренному размножению в первичном семеноводстве картофеля / [сост. А.И. Замотаев, Л.Н. Трофимец, В.А. Гуров [и др.]; МСХ СССР, НИИКХ. М.: Колос, (1983), 15.с), Е.Н. Барсуковой и др. (Барсукова Е.Н., Чекушкина Т.Н., Ким И.В.

Оздоровление и микроразмножение in vitro сортов картофеля для безвирусного семеноводства. Дальневост. аграр. вестн. (2018), 4 (48), 20-26). В состав среды прототипа входят компоненты, представленные в табл.1.

Однако данная питательная среда имеет недостатки: невысокий коэффициент размножения, а значит увеличение сроков размножения растений в условиях in vitro.

Целью изобретения является сокращение сроков культивирования оздоровленных микрорастений картофеля in vitro и ускоренное получение необходимого количества пробирочных растений при массовом производстве.

Указанная цель достигается тем, что в питательную среду для микроклонального размножения картофеля, содержащую аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый семиводный, кальций хлористый двухводный, железо сернокислое семиводное, трилон Б, борную кислоту, марганец сернокислый четыре-хводный, кобальт хлористый шестиводный, медь сернокислую пятиводную, цинк сернокислый семиводный, калий йодистый, натрий молибденовокислый двухводный, мезоинозит, гидролизат казеина, аскорбиновую кислоту, тиамин хлорид, пиридоксин хлорид, индолилуксусную кислоту, кинетин, индолилмасляную кислоту, сахарозу, агар и воду и согласно изобретения в ее состав дополнительно добавляют сернокислую медь в количестве 2 мг/л среды.

По сравнению с прототипом признаками изобретательского уровня предлагаемой питательной среды для микроклонального размножения безвирусных растений картофеля является:

1. «дополнительно добавляют сернокислую медь...», что позволяет:

- улучшить морфологическое и физиологическое состояние растений картофеля в процессе культивирования в условиях in vitro;

- стимулировать рост растений картофеля в культуре in vitro;

- увеличить коэффициент размножения и выход пробирочных растений картофеля;

- ускорить производство большого количества безвирусных растений;

2. «... в количестве 2 мг/л», что способствует:

- повысить стрессоустойчивость растений и адаптивный потенциал перед посадкой в условия ex vitro в субстрат (теплицу);

- нормальному росту и развитию корневой системы микрорастений картофеля;

- хорошей приживаемости пробирочных растений в субстрате. Признаки, указанные в отличительной части описания достижения

цели, доказывают, что заявляемая питательная среда для микроклонального размножения безвирусных растений картофеля обладает новизной. Совокупность признаков, приведенных в сравнении свойств заявляемого и известного решений, дает основание сделать вывод, что заявляемая питательная среда имеет изобретательский уровень.

Техническим результатом изобретения является использование в качестве стимулятора роста и развития микроклонов картофеля сернокислой меди в количестве 2 мг/л.

Предлагаемая питательная среда для микроклонального размножения безвирусных растений картофеля готовится по прописи, указанной в таблице 1. В мерном цилиндре на 500 мл соединяют растворенные навески компонентов, затем дополнительно добавляют 2 мг/л сульфата меди. Измеряют показатель кислотности среды (рН) и доводят его значения до 5,6-5,8 с помощью раствора КОН. В 500 мл дистиллированной воды растворяют и доводят до кипения агар. Соединяют 500 мл раствора компонентов с 500 мл раствора горячего агара. Питательную среду, разливают в пробирки диаметром 16 мм по 5 мл в каждую, плотно закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют в стерилизаторе паровом (автоклаве) при режиме: 30 мин при 0,2-0,5 атм. (прогрев-продувка), 20 мин - при 0,9 атм. (стерилизация). В стерильных условиях ламинар-бокса безвирусные растения картофеля извлекают из пробирок и с помощью скальпеля делят стебель на сегменты (черенки) размером 1,0-1,5 см с пазушной почкой и листом. Черенки пинцетом помещают в пробирки с питательной средой на глубину междоузлия (около 0,5 см). Высаженные черенки и растения картофеля культивируют в фитотроне при температуре 22±2°С, влажности воздуха - 60-70%, освещенности 4-5 клк, 16-часовом дне.

Результаты экспериментов представлены в примерах. Изобретение иллюстрируется таблицами и фигурой. В табл.2 приведены составы исследованных вариантов питательных сред, в табл.3 - представлены морфометрические параметры опытных растений картофеля сорта Моряк на средах с различным содержанием сернокислой меди, в табл.4 - представлены морфометрические параметры растений картофеля сорта Моряк и Жуковский ранний на средах с различным содержанием сернокислой меди, в табл.5 -приведены результаты дисперсионного анализа двухфакторного опыта по показателю «количество междоузлий», на фигуре показан выход микрорастений картофеля в зависимости от состава среды.

Пример 1. Эксперимент по микроклональному размножению картофеля проведен на 5 вариантах питательных сред с различным содержанием сернокислой меди (табл.2) в сравнении с контролем (прототип).

Растения размножали делением стебля на черенки 1,0-1,5 см с листом (микрочеренкование) в соответствии с общепринятыми методиками работы в стерильных условиях. Опыт проведен в трехкратной повторности. Период культивирования микроклонов на питательной среде составлял 24 дня. В опыте по микроклональному размножению использовали оздоровленные микрорастения картофеля сорта Моряк (селекции ФГБНУ «ФНЦ агробио-технологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки» (табл.3). Микроразмножение растений показало, что из исследованных концентраций сернокислой

меди, наибольший эффект выявлен в варианте 1 (2,025 мг/л). В этом случае у растений формировалось достоверно большее количество междоузлий, что и обуславливает высокий коэффициент размножения (1:7,7).

Пример 2. Эксперимент был повторно проведен на двух сортах - Моряк и Жуковский ранний и двух вариантах сред с содержанием сернокислой меди 2,025 мг/л (1 вариант) и 4,025 мг/л (2 вариант). Коэффициенты размножения у обоих сортов на предлагаемой среде были выше, чем на контрольной среде (табл.4). Для хорошей адаптации и приживаемости пробирочных растений при посадке в условия (ex vitro) в субстрат в теплицу важно, чтобы растения сформировали хорошо развитую корневую систему. При добавлении в питательную среду для микроклонального размножения картофеля 2 мг/л сернокислой меди не наблюдается значительного отрицательного эффекта на процесс ризогенеза. Существенных различий в развитии корневой системы растений сорта Моряк при выращивании в контроле и вариантах с повышенным содержанием меди не выявлено (табл.4). У пробирочных растений сорта Жуковский ранний наиболее значительно масса корневой системы снизилась по сравнению с контролем на 2-м варианте среды, который мы не предлагаем к применению.

Результаты двухфакторного опыта после дисперсионного анализа по главному показателю («количество междоузлий»), влияющему на коэффициент размножения безвирусных растений картофеля приведены в таблице 5.

В итоге с вероятностью 99% доказано преимущество применения предлагаемого варианта среды.

При массовом микроразмножении безвирусные растения картофеля тиражируют на питательных средах до высадки в теплицы в течение 5 месяцев (120 дней). На фигуре продемонстрировано количество микрорастений, которые можно получить за этот период исходя из полученных коэффициентов размножения (табл.5). На заявленной питательной среде с содержанием сернокислой меди 2,025 мг/л получено в 2,99 раза больше микрорастений, чем на контрольной среде.

Таким образом, применение предлагаемой питательной среды с добавлением сернокислой меди в количестве 2 мг/л, в процессе микроклонального размножения безвирусных растений картофеля позволяет получить необходимый объем растений картофеля в более короткий срок и сэкономить затраты. Использование заявленного состава питательной среды Мурасиге-Скуга с содержанием сернокислой меди 2,025 мг/л, при микроразмножении безвирусных растений картофеля in vitro повышает эффективность данного процесса за счет увеличения коэффициента размножения и получения большего количества растений.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой питательную среду для микроклонального размножения безвирусных растений картофеля, содержащую следующие компоненты в мг/л: аммоний азотнокислый 1650, калий азотнокислый 1900, калий фосфорнокислый однозамещенный 170, магний сернокислый семиводный 370, кальций хлористый двухводный 440, железо сернокислое семиводное 27,8, трилон Б 37,3, борную кислоту 6,2, марганец сернокислый четырехводный 22,3, кобальт хлористый шестиводный 0,025, медь сернокислую пятиводную 0,025, цинк сернокислый семиводный 8,6, калий йодистый 0,83, натрий молибденовокислый двухводный 0,25, мезоинозит 80, гидролизат казеина 50, аскорбиновую кислоту 0,5, тиамин хлорид 0,5, пиридоксин хлорид 0,5, индолилуксусную кислоту 1,0, кинетин 0,2, индолилмасляную кислоту 0,2, сахарозу 20000, агар 6000 и воду до 1 л, при этом дополнительно содержит сернокислую медь в количестве 2 мг/л среды. Предлагаемое изобретение позволит сократить сроки культивирования оздоровленных микрорастений картофеля in vitro и ускорить получение необходимого количества пробирочных растений картофеля при массовом производстве. 1 ил., 5 табл.

Питательная среда для микроклонального размножения безвирусных растений картофеля, содержащая следующие компоненты в мг/л: аммоний азотнокислый 1650, калий азотнокислый 1900, калий фосфорнокислый однозамещенный 170, магний сернокислый семиводный 370, кальций хлористый двухводный 440, железо сернокислое семиводное 27,8, трилон Б 37,3, борную кислоту 6,2, марганец сернокислый четырехводный 22,3, кобальт хлористый шестиводный 0,025, медь сернокислую пятиводную 0,025, цинк сернокислый семиводный 8,6, калий йодистый 0,83, натрий молибденовокислый двухводный 0,25, мезоинозит 80, гидролизат казеина 50, аскорбиновую кислоту 0,5, тиамин хлорид 0,5, пиридоксин хлорид 0,5, индолилуксусную кислоту 1,0, кинетин 0,2, индолилмасляную кислоту 0,2, сахарозу 20000, агар 6000 и воду до 1 л, отличающаяся тем, что дополнительно содержит сернокислую медь в количестве 2 мг/л среды.