ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КЛОНАЛЬНОГО МИКРОРАЗМНОЖЕНИЯ ЛИЛИЙ (LILIUM L.) В УСЛОВИЯХ IN VITRO Российский патент 2021 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к биотехнологии в области сельского хозяйства, в частности, к эффективному клональному микроразмножению лилий in vitro.

Задачей настоящего изобретения является разработка питательной среды для клонального микроразмножения лилий (Lilium 1.) в условиях in vitro.

Лилия - великолепное растение, служащее настоящим украшением наших садовых участков. Это одна из наиболее древних декоративных культур и в то же время популярная благодаря огромному количеству сортов, созданных в последнее время. Разнообразие окрасок, классическая форма цветка, неприхотливость поставили ее в один ряд с розами, гладиолусами, пионами.

Во многих странах возрастает рост потребления свежесрезанных цветов, в том числе и лилий. Применение на материально-технической базе биотехнологических лабораторий новых высокотехнологичных методов размножения in vitro, а также современных технологий выращивания цветочной продукции в условиях защищенного грунта способны решить данную проблему.

В последние годы разрабатывается и находит все более широкое распространение метод вегетативного размножения лилий - клональное размножение методом культуры ткани.

Первые работы в области клонального микроразмножения лилий проведены С.Робб [1] в середине прошлого века. Для исследований были использованы чешуи луковиц L. longiflorum.

У лилий для введения в культуру исследователи с успехом использовали практически все части растений (ткани стеблей цветоножек, завязь, листья, верхушки побега и междоузлия, пыльники, пестики, цветочные бутоны, чешуи луковиц, семена) [2].

Однако, по мнению некоторых исследователей [3, 4] чешуи луковиц можно вводить в любое время года, так как в природе они способны к регенерации всегда, но с различным коэффициентом размножения.

В связи с этим, успех клонального микроразмножения лилий во многом зависит от правильного подбора основы питательной среды, углеводов и регуляторов роста, а также различных способов стимуляции пролиферации растительных тканей.

Так, например, Шибановой Н.Л. и Попковой А.С. [5] описан способ размножения некоторых сортов лилий в культуре in vitro. Его суть заключается в том, что экспланты высаживаются на твердую питательную среду с минеральной основой по Мурасиге-Скугу (MS) [6], содержащую 6% сахарозы, 0,6% агар-агара. В качестве регуляторов роста используются ауксины - индолилуксусная кислота (ИУК) и нафтилуксусная кислота (НУК) в концентрации 1 мг/л, цитокинин - 6-бензиладенин (6-БАП) в концентрации 1 мг/л. Также в среду добавляют витамины - пиридоксин, тиамин и никотиновая кислота в концентрации 1 мг/л.

Так же на основе среды MS, дополненной только 6-БАП (0,4 мг/л) размножали некоторые сорта лилий [7].

О.А. Суркова [8] в своей работе указала, что при выращивании лилий на среде Мурасиге-Скуга с добавлением 1 мг/л 6-БАП коэффициент размножения составил в зависимости от сорта 1,3 до 7,9 шт. /на эксплант.

A.M. Мазур и Е.А. Калашникова [9] для размножения ценных гибридов лилий использовали среду Мурасиге и Скуга, дополненную сахарозой 20-60 г/л и регуляторами роста 6-БАП 1,5 мг/л и НУК 1,5 мг/л, и культивировали в световой комнате при температуре 25±1°С, 24-часовом освещении белыми люминесцентными лампами с интенсивностью света 3000 лк. Процесс ризогенеза индуцировали добавлением в питательную среду α-нафтилуксусной кислоты в концентрации от 0,2 мг/л до 0,5 мг/л.

Получен патент РФ «Способ размножения лилий in vitro» [10]. Авторы разработанного способа отделяли экспланты, обрабатывали их в течении часа раствором препарата эпибрассинолид в концентрации 0,1 мг/л и подвергали стерилизации. Затем высаживали экспланты на агаризованную питательную среду Мурасиге-Скуга с содержанием регуляторов роста 6-БАП 1,5 мг/л и ИУК 0,5 мг/л. После культивирования на среде размножения отделяли микролуковицы от эксплантов и укореняли на питательной среде Мурасиге-Скуга с добавлением 10^-11 моль/л тидиазурона и 0,5 мг/л НУК в темноте при температуре 14°С. Изобретение позволяет повысить выход размножаемого материала за счет увеличения количества образующихся микролуковиц при положительном влиянии оптимальных концентраций регуляторов роста. Образуется максимальное число микролуковиц - 8 штук/эксплант.

Предложена схема массового размножения in vitro азиатских гибридных лилий [11]. При данном способе культивирования чешуй размером 1,0×1,0 см² через 17 дней в среднем образовывалось 7 луковиц. Для этого использовали питательную среду Мурасиге-Скуга (MS) с 3% сахарозы и 0,5 мМ НУК. На среде MS, содержащей 0,5 мМ НУК и 6-9% сахарозы, в зависимости от сорта, формировались луковицы большого размера, но их было меньше по количеству. Количество луковичек не превышало 4 шт.

Наиболее близким по своей сущности к заявленному изобретению является способ размножения лилий in vitro [5]. Экспланты высаживаются на твердую питательную среду с минеральной основой по Мурасиге-Скугу (MS), содержащую 6% сахарозы, 0,6% агар-агара, ИУК 1 мг/л, НУК 1 мг/л, 6-БАП 1 мг/л, пиридоксин 1 мг/л., тиамин 1 мг/л, никотиновая кислота 1 мг/л.

Недостатком прототипа является невысокий коэффициент размножения. Максимальные значения коэффициента размножения не превышали 8,7±3,2 (сорт Самур), несмотря на то, что отдельные экспланты могут продуцировать до 14 луковичек [5].

Целью изобретения является повышение эффективности клонального микроразмножения лилий в культуре in vitro за счет повышения процента регенерации и коэффициента размножения.

Цель достигается за счет того, что стерильные чешуи лилий высаживают на питательную среду на основе среды Кворина-Лепуавра [12], содержащую половинный набор макросолей (NH₄NO₃ - 200,0 мг/л; KNO₃ -900,0 мг/л; Ca(NO₃)₂ - 600,0 мг/л; MgSO₄ × 7Н₂O - 180,0 мг/л; КН₂РO₄ - 135,0 мг/л; Н₃ВО₃ - 6,2 мг/л; MnSO₄ × 4Н₂O - 1,0 мг/л; ZnSO₄ × 7Н₂O - 8,6 мг/л; KI - 0,08 мг/л; Na₂MoO₄ × 2Н₂O - 0,25 мг/л; CuSO₄ х ⋅ 5Н₂O - 0,025 мг/л; СоСl₂ × 6Н₂O - 0,025 мг/л; FeSO₄ × 7Н₂O - 27,8 мг/л) с добавлением ЭДТА - 37,3 мг/л; мезоинозит - 100,0 мг/л; тиамин хлорид - 0,4 мг/л; пиридоксин хлорид - 0,5 мг/л; 6-БАП - 0,25 мг/л; ИМК - 0,1 мг/л, глюкозу - 20000,0 мг/л; агар - 8000,0 мг/л и воду до 1 литра среды.

Пример конкретного применения.

Пример 1.

Биологическим объектом исследования служил сорт лилии Фиалковая.

Стерильные чешуи лилий высаживали на питательные среды:

1 вариант - среда Мурасиге-Скуга с НУК 0,1 мг/л (контроль);

2 вариант - среда Дравер-Кунжуки с НУК 0,1 мг/л;

3 вариант - среда Дравер-Кунжуки [13] (1/2 макросолей) с глюкозой - 20 г/л и 6-БАП 0,25 мг/л;

4 вариант - среда Мурасиге-Скуга с 6-БАП 0,25 мг/л;

5 вариант - среда Мурасиге-Скуга (1/2 макросолей) с глюкозой 20 г/л и 6-БАП 0,25 мг/л;

6 вариант - среда Кворина- Лепуавра с НУК 0,1 мг/л;

7 вариант - среда Кворина- Лепуавра с 6-БАП 0,25 мг/л, ИМК - 0,1 мг/л.;

8 вариант - среда Кворина- Лепуавра (1/2 макросолей) с глюкозой 20 г/л и 6-БАП 0,25 мг/л, ИМК - 0,1 мг/л.

Субкультивирование эксплантов осуществляли в широкогорлых конических колбах емкостью 250 мл со 100 мл среды. Колбы закрывали тонкой алюминиевой фольгой и герметизировали липкой лентой.

Культивирование чешуй осуществляли в специально оборудованной культуральной комнате при 16-часовом световом дне с освещенностью 2400 люкс (люминесцентные лампы Osram L36W Cool Daylight), температуре воздуха 24±2°С и влажности воздуха 55-60%.

Контролем служили чешуи, культивируемые на стандартной среде Мурасиге-Скуга с НУК 0,1 мг/л в тех же условиях.

Эффективность микроразмножения оценивали через 45 дней культивирования по проценту регенерации, количеству и размеру образовавшихся луковичек.

Опыт имел четырехкратную повторность. Статистическую обработку данных проводили в программной среде Microsoft Excel.

Применение разных питательных сред позволило определить наиболее эффективную для клонального микроразмножения лилий (табл. 1).

Так, один из ключевых показателей, процент регенерации, в контрольном варианте не превышает 63,5%, что соответствует в целом литературным данным для большинства сортов.

Использование питательной среды Дравер-Кунжуки с НУК 0,1 мг/л (2 вариант) не влияет положительно на интенсивность регенерации, по сравнению с контролем (1 вариант). Эффективность регенерации несколько повышается при уменьшении вдвое концентрации макросолей среды Дравер-Кунжуки, добавлении 6-БАП (0,25 мг/л) в качестве стимулятора морфогенеза и замене углевода на глюкозу в концентрации 20 г/л (3 вариант).

Среда Мурасиге-Скуга при наличии в ней 6-БАП (0,25 мг/л) улучшает регенерацию лилий (вариант 4), при этом уменьшение вдвое концентрации макросолей и использование глюкозы в качестве источника углеводного питания еще больше способствует регенерации (вариант 5).

Наилучшие результаты по регенерации лилии in vitro получены на питательной среде QL (6-8 варианты). Снижение концентрации макросолей и использование глюкозы (20 г/л), 6-БАП (0,25 мг/л), ИМК (0,1 мг/л) позволило достичь регенерации всех эксплантов (8 вариант).

Анализ регенерационной способности эксплантов показал в последующем, зависимость интенсивности формирования микролуковичек на чешуях лилии от данного показателя. Высокий процент регенерирующих эксплантов, полученный в результате оптимизации питательной среды, коррелировал и с более активным формированием меристемных очагов из которых образуются микролуковички на каждом экспланте. Так, максимальный коэффициент размножения 10,1±0,7 шт/эксплант зафиксирован в 8 варианте (рис. 1). По сравнению традиционной средой Мурасиге-Скуга (контроль - 4,8±0,3 шт/эксплант) (рис. 2) этот показатель улучшен более чем в два раза. По нашему мнению, данный результат обеспечивается в основном за счет комбинирования снижения концентраций макросолей с добавлением 6-БАП, ИМК и заменой сахарозы на глюкозу.

Анализ параметров микролуковичек выявил незначительное увеличение их линейных размеров по сравнению с контролем. Наибольшие размеры микролуковичек получены в 5 варианте (среда Мурасиге-Скуга (1/2 макросолей) с глюкозой 20 г/л и 6-БАП 0,25 мг/л) и 8 варианте (Кворина-Лепуавра (1/2 макросолей) с глюкозой 20 г/л и 6-БАП 0,25 мг/л, ИМК - 0,1 мг/л).

В результате вышеизложенного, использование питательной среды Кворина-Лепуавра (QL) с половинной концентрацией макросолей (NH₄NO₃ - 200,0 мг/л; KNO₃ - 900,0 мг/л; Ca(NO₃)₂ - 600,0 мг/л; MgSO₄ × 7Н₂O - 180,0 мг/л; КН₂РО₄ - 135,0 мг/л; Н₃ВO₃ - 6,2 мг/л; MnSO₄ × 4Н₂O - 1,0 мг/л; ZnSO₄ × 7Н₂O - 8,6 мг/л; KI - 0,08 мг/л; Na₂MoO₄ × 2Н₂O - 0,25 мг/л; CuSO₄ ×⋅5Н₂O - 0,025 мг/л; СоСl₂ × 6Н₂O - 0,025 мг/л; FeSO₄ × 7Н₂O - 27,8 мг/л), содержащая ЭДТА - 37,3 мг/л; мезоинозит - 100,0 мг/л; тиамин хлорид - 0,4 мг/л; пиридоксин хлорид - 0,5 мг/л; 6-БАП - 0,25 мг/л; ИМК - 0,1 мг/л, глюкозу - 20000,0 мг/л; агар - 8000,0 мг/л и воду до 1 литра среды позволяет получить 100% регенерацию эксплантов чешуй лилий и по сравнению традиционной средой, повысить коэффициент размножения более чем в два раза.

Таким образом, изложенные выше сведения свидетельствуют о том, что представленное изобретение обладает заявленными свойствами, и совокупность отличительных признаков описываемого способа обеспечивает достижение указанного результата.

Для заявленного способа, в том виде, как он охарактеризован в изложенной формуле изобретения, нет препятствий его осуществления на практике с использованием современных технических средств. Таким образом, заявленное изобретение соответствует условию "промышленная применимость".

Данное изобретение расширяет разнообразие возможностей клонального микроразмножения лилий.

Список литературы

1. Robb S.M. The culture of excised tissue from bulb scales of Lilium speciosum Thunb. // J. of Experimental Botany. - 1957. - V. 8. №24. - P. 348-352.

2. Tribulato, A. Somatic embryogenesis from flower pedicels of oriental lilies / A. Tribulato, F. Branca // Acta Hort. - 2011. - V. 900. - P. 369-376.

3. Kim S.K. Utilization of embryogenic cell cultures for the mass production of bulblets in lilies / S.K. Kim, В J. Ahn // Acta Hort. - 2005. - V. 673. - P. 731-736.

4. Соколова M.A. Особенности введения лилий в культуру in vitro // Плодоводство и ягодоводство России. - 2016. - Том 46. - С. 368-371.

5. Шибанова Н.Л. Микроклональное размножение некоторых сортогрупп лилий / Н.Л. Шибанова, А.С. Попкова // Вестник пермского университета. Серия биология. - 2020. - №4. - С. 280-285.

6. Murashige Т., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. Plant. - 1962. - Vol. 5, №95. - P. 473-497.

7. Филиппова Г.В., Дарханова В.Г., Строева Н.С., Николаева О.А., Андросова Д.Н. Размножение in vitro, рост и развитие ex situ редкого вида Lilium pensylvanicum Ker.-Gawl. (Liliaceae) / Г.В. Филиппова, В.Г. Дарханова, Н.С. Строева, О.А. Николаева, Д.Н. Андросова // Вестн. моек, ун-та. сер. 16. Биология. - 2020. - Т. 75, №2. - С. 87-92.

8. Суркова О.А. Сравнительная оценка сортов лилии по коэффициенту размножения в культуре in vitro // Вестник КрасГАУ. - 2020. - №6 (159). URL: https://cyberleninka.ru/article/n/sravnitelnaya-otsenka-sortov-lilii-po-koeffitsientu-razmnozheniya-v-kulture-in-vitro (дата обращения: 28.02.2021).

9. Мазур A.M., Калашникова Е.А. Клональное микроразмножение ценных гибридов лилий // Сельскохозяйственная биотехнология. Избранные работы / Под ред. В.С. Шевелухи. - М.: Евразия, 2000. - 264 с.

10. Патент №2384050 на способ «Способ размножения лилий in vitro» / Авторы: Мокшин Е.В., Лукаткин А.С.Зарегистрирован в госреестре полезных моделей РФ 08.12.2008. Заявка №2008148463/12 от 08.12.2008. Опубликовано: 20.03.2010 Бюл. №8. Патентообладатель: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарева".

11. Varshney A. A protocol for in vitro mass propagation of asiatic hybrids of lily through liquid stationary culture / A. Varshney, V. Dhawan, P.S. Srivastava // In Vitro Cell. Dev. Biol. D. Plant. - 2000. - V. 36. - P. 383-391.

12. Quoirin M. Etude de milieux adaptes aux cultures in vitro de Prunus / M. Quoirin, P. Lepoivre // Acta Hortic-1977. - V. 78. - P. 437-442.

13. Driver J. In vitro propagation of Paradox walnut rootstock. / J. Driver, A. Kuniyuki // Hortscience. - 1984. - V. 19. - P. 507-509.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой оригинальную питательную среду для эффективного клонального микроразмножения лилий на основе среды Кворина-Лепуавра (QL) с половинной концентрацией макросолей (NH₄NO₃ - 200,0 мг/л; KNO₃ - 900,0 мг/л; Ca(NO₃)₂ - 600,0 мг/л; MgSO₄×7H₂O - 180,0 мг/л; KH₂PO₄ - 135,0 мг/л; H₃BO₃ - 6,2 мг/л; MnSO₄×4H₂O - 1,0 мг/л; ZnSO₄×7H₂O - 8,6 мг/л; KI - 0,08 мг/л; Na₂MoO₄×2H₂O - 0,25 мг/л; CuSO₄×5H₂O - 0,025 мг/л; CoCl₂×6H₂O - 0,025 мг/л; FeSO₄×7H₂O - 27,8 мг/л), содержащую ЭДТА - 37,3 мг/л; мезоинозит - 100,0 мг/л; тиамин хлорид - 0,4 мг/л; пиридоксин хлорид - 0,5 мг/л; 6-БАП - 0,25 мг/л; ИМК - 0,1 мг/л, глюкозу - 20000,0 мг/л; агар - 8000,0 мг/л и дистиллированную воду до 1 литра среды. Изобретение позволяет получить 100% регенерацию эксплантов чешуй лилий и как результат, по сравнению с традиционно используемой средой, повысить коэффициент размножения более чем в два раза. 2 ил., 1 пр.

Питательная среда для клонального микроразмножения лилий на основе среды Кворина-Лепуавра (QL) с половинной концентрацией макросолей (NH₄NO₃ - 200,0 мг/л; KNO₃ - 900,0 мг/л; Ca(NO₃)₂ - 600,0 мг/л; MgSO₄×7H₂O - 180,0 мг/л; KH₂PO₄ - 135,0 мг/л; H₃BO₃ - 6,2 мг/л; MnSO₄×4H₂O - 1,0 мг/л; ZnSO₄×7H₂O - 8,6 мг/л; KI - 0,08 мг/л; Na₂MoO₄×2H₂O - 0,25 мг/л; CuSO₄×5H₂O - 0,025 мг/л; CoCl₂×6H₂O- 0,025 мг/л; FeSO₄×7H₂O - 27,8 мг/л), содержащая ЭДТА - 37,3 мг/л; мезоинозит - 100,0 мг/л; тиамин хлорид - 0,4 мг/л; пиридоксин хлорид - 0,5 мг/л; 6-БАП - 0,25 мг/л; ИМК - 0,1 мг/л, глюкозу - 20000,0 мг/л; агар - 8000,0 мг/л, дистиллированную воду до 1 литра среды.