Биокатализатор для деструкции ксантана на основе иммобилизованных клеток симбиотической смеси бактерий Российский патент 2023 года по МПК C12N11/02 

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой биокатализатор на основе клеток симбиотической смеси бактерий, иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта. Биокатализатор способен разлагать ксантан, что может найти применение в нефтедобывающей и пищевой промышленности.

Ксантан представляет собой внеклеточный гетерополисахарид, продуцируемый бактериями рода Xanthomonas campestris. Ввиду своих свойств он широко используется в различных сферах промышленности: пищевой, фармацевтической, косметической. Большой объем ксантана применяется при добыче нефти в качестве структурообразователя буровых растворов, где он повышает вязкость растворов, не давая скважине разрушиться: Журнал СФУ. Техника и технологии. 2013. Т. 6(1). С. 95-106 [1]. По окончании работ остро встает вопрос удаления ксантановой камеди. На практике используют методы химического гидролиза ксантана под действием сильных кислот и высоких температур. Помимо этого, производят захоронения или использование в качестве дорожно-строительного материала отработанных ксантансодержащих буровых растворов: Экология и промышленность России. 2016. Т 20(9), С. 12-15 [2].

В отличие от известных способов химической деградации ксантановой камеди путем обработки сильными кислотами, более экологичными и менее энергозатратными считаются биологические методы, где используются микроорганизмы либо смеси ферментов: Macromolecules. 1993. Т. 26(22), С. 6111-6120 [3].

Известен термин «биокатализатор», применяемый в отношении как микроорганизмов-продуцентов ферментов, так и ферментов или их смесей для ускорения широкого спектра реакций.

Известны способы биодеструкции ксантана, где в качестве биокатализатора используются отдельные бактериальные штаммы или их смеси, способные продуцировать ферменты, деградирующие ксантан (ксантанолитический комплекс). Зарегистрирован биокатализатор на основе штамма бактерии Paenibacillus taichungensis 15, обладающий способностью гидролизовать ксантановую камедь при его культивировании в течение 96 часов и продуцировать ксантанолитический комплекс с активностью 26 ед/мл: Патент №RU 2754795 C1 [4].

В патенте US4410625 описан биокатализатор на основе штамма Bacillus NRRL В-4529 с ксантаназной активностью 1000-3000 ед/мг [5].

Наиболее близким к заявленному изобретению относится биокатализатор на основе клеток консорциума (смеси) неидентифицированных бактерий NRRL В-18445. В ходе культивирования смеси бактерий в течение 8 дней в культуральной жидкости была детектирована общая ксантаназная активность 195 ед/мг: Патент US4996153A [6]. Основной недостаток всех упомянутых выше биокатализаторов состоит в невозможности их многократного использования для деструкции ксантана без потери ксантаназной активности.

Известен общий подход для многократного использования микробных биокатализаторов, заключающийся в иммобилизации микробных клеток в инертный носитель (матрицу). Это позволяет многократно применять биокатализаторы без потери их активности. Иммобилизацию клеток применяют для многих биопроцессов, например, RU 2636041 «Иммобилизованный биокатализатор для получения бактериальной целлюлозы» [7]; RU 2383618 «Иммобилизованный биокатализатор для микробиологического получения пектиназ» [8]; RU 2360967 «Биокатализатор на основе иммобилизованных клеток бактерий для разложения метилфосфоновой кислоты и ее эфиров» [9]; RU2 626528 «Иммобилизованный биокатализатор для получения фумаровой кислоты» [10]; RU 2524434 «Иммобилизованный биокатализатор для микробной биотрансформации стероидных соединений» [11]. Для каждого процесса создания биокатализатора необходим индивидуальный выбор биокатализатора, носителя (матрицы), условий иммобилизации, пространственное распределение в структуре матрицы, которые должны обеспечить длительность процесса, многократное его применение без потери активности и стабильности матрицы: Biotechnol. Lett. 2017. Т. 39(5). С. 667-683 [12].

Техническим эффектом данного изобретения является разработка биокатализатора, обладающего свойством многократного использования без потери активности и разрушения матрицы, который может быть применен в деградации ксантана.

Поставленная задача решается тем, что создан биокатализатор для деструкции ксантана, представляющий собой симбиотическую смесь бактерий: Paenibacillus spp.; Cellulosimicrobium cellulans, иммобилизованных в матрицу криогеля поливинилового спирта путем ресуспендирования микробных клеток (2 мас. %) в растворе 12 мас. % поливинилового спирта до их однородного распределения с последующим выдерживанием суспензии при -20°С в течение 24 часов с последующим хранением матрицы при температуре+4°С.

Заявляемая совокупность признаков в открытых литературных источниках не выявлена.

Заявляемое изобретение основано на том, что экспериментально было выявлено, что симбиотическая смесь бактерий способна разлагать ксантан и экспериментально подобраны условия иммобилизации клеток бактерий в матрицу поливинилового спирта.

На фиг. 1 представлены относительные скорости снижения вязкости ксантана, протестированные для концентраций клеток симбиотической смеси бактерий 6 мас. % (черные столбцы) и 2 мас. % (заштрихованные столбцы), иммобилизованных в матрицу поливинилового спирта с концентрацией 12 мас. %, свидетельствующие о том, что выбранная концентрация микробных клеток, составляющая 2 мас. %, является оптимальной.

На фиг. 2 представлены результаты тестирования биокатализатора на основе клеток симбиотической смеси бактерий, иммобилизованных в криогеле поливинилового спирта, в процессе деградации ксантана. А: Динамика снижения вязкости в течение 36-38 часов в контрольном образце без биокатализатора (кривая 1) и в образце с применением биокатализатора (кривая 2). Б: Количество циклов использования биокатализатора на основе смеси бактерий, свидетельствующее об устойчивой активности биокатализатора.

Сущность изобретения заключается в следующем:

Заявляемая симбиотическая смесь бактерий была обнаружена на селективной среде с содержанием 0,3% (вес/об.) ксантана. Методом метагеномного анализа была выполнена идентификация бактерий и показано, что исследуемая бактериальная смесь содержит бактерии: Paenibacillus sp., Cellulosimicrobium cellulans. Метагеномные прочтения были депонированы в базе данных Sequence Read Archive (SRA) NCBI (номер в базе данных BioProject PRJNA849974).

Пример 1. Определение общей ксанатаназной активности симбиотической смеси бактерий на среде с концентрацией ксантана 0,3% (вес./об.).

Для получения культуральной жидкости готовили жидкую среду следующего состава, % (вес/об.): ксантан, 0,3; пептон, 0,1; YNB, 0,34. Среду разливали по 100 мл в колбы объемом 500 мл и стерилизовали. В жидкую среду вносили симбиотическую смесь бактерий, параллельно ставили контрольную пробу без биокатализатора. После 36-38 часов культивирования смеси бактерий при 28°С на шейкере (120 об/мин) в отобранных образцах культуральной жидкости были оценены значения удельной активности ксантаназного комплекса. За единицу активности принимали такое количество ферментного препарата, которое в течение 1 минуты при 40°С и рН 6,5 высвобождает 1 мкмоль восстанавливающих Сахаров, эквивалентных 1 мкмоль глюкозы. Восстанавливающие сахара определяли тестом с использованием реактива иора-хлоргидробензойная кислота согласно описанной методике: J. Biol. Eng. 2017, Т. 11, №1 [13]. Удельная ксантаназная активность в конечной точке культивирования после 36-38 ч составила 19,6 ед/г.

После 36-38 часов культивирования вязкость культуральных жидкостей составила 1,05 сП (1 rpm), вязкость контрольного раствора - 230 сП (1 rpm). В ходе культивирования вязкость жидкой питательной среды, содержащей ксантан, уменьшилась в 230 раз по сравнению с контрольным раствором.

Пример 2. Подбор носителя для иммобилизации сиомбиотической смеси бактерий для деструкции ксантана.

Были протестированы три носителя для иммобилизации клеток: а. гранулы цеолита; б. альгинатные микрокапсулы; в. криогель поливинилового спирта.

а. Адсорбцию на поверхности гранул цеолита клеток симбиотической бактериальной культуры осуществляли путем добавления бактерий к носителю в растворе 0,9% хлорида натрия и инкубировании на шейкере в течение суток с последующим промыванием цеолитных гранул 0,9% раствором хлорида натрия до тех пор, пока в промывной жидкости не осталось бактериальных клеток. Для иммобилизации использовали гранулы цеолита с размерами 0-1 мм, 1-3 мм, 3-5 мм. Наибольшую активность проявил иммобилизованный биокатализатор с размером гранул 0-1 мм. Показано, что биокатализатор осуществлял не более 3 циклов реакции деградации ксантана ввиду слабого связывания клеток с носителем и вымыванием клеток из матрицы.

б. Для иммобилизации клеток симбиотической смеси бактерий с применением альгината натрия раствор альгината натрия 5% в 50 мМ Трис-HCl буфере рН 7,5 смешивают с клеточной суспензией смеси бактерий в соотношении 1:1. Суспензию при помощи шприца небольшими каплями прибавляли к 50 мл 2% раствора хлорида кальция при постоянном перемешивании, оставляли для формирования микрокапсул в течении 4 часов, а затем промывали дистиллированной водой. Иммобилизованный цельноклеточный биокатализатор хранили в Трис-HCl буфере рН 7,5 при температуре +4°С: Appl Biochem Biotechnol. 2018. Т. 184, №2. С. 538-552 [14].

После 6 циклов работы биокатализатора, полученного иммобилизацией в альгинатные капсулы, наблюдалось нарушение целостности гелевой оболочки в результате выпадения солей кальция в осадок и разрушения собственной ферментной системой бактерий.

в. Для иммобилизации в криогель поливинилового спирта клетки симбиотической смеси бактерий смешивали с раствором 12 мас. % поливинилового спирта. Суспензию фракционировали по ячейкам планшета объемом 200 мкл, оставляли при температуре -20°С на сутки. Иммобилизованный цельноклеточный биокатализатор хранили при температуре +4°С. Показано применение полученного биокатализатора в течение не менее 10 циклов без потери активности и стабильности матрицы в процессе деградации ксантана.

В результате подбора экспериментальным путем носителя для получения иммобилизованного биокатализатора было установлено, что криогель поливиниловго спирта обладает прочной структурой, стабильно удерживает клетки смеси, создавая благоприятные условия для их функционирования, что обеспечивает длительность процесса, многократное применение биокатализатора без потери каталитической активности и стабильности матрицы.

Пример 3. Иммобилизации клеток симбиотической смеси бактерий в матрице криогеля поливинилового спирта (ПВС). Клетки симбиотической смеси бактерий культивировали в жидкой среде LB (пептон-10 г/л, дрожжевой экстракт-5 г/л, NaCl - 10 г/л) в течение 24 часов, отделяли от среды центрифугированием в течение 15 минут при 10 тыс.об/мин. Осадок взвешивали и в концентрации 2 мас. % ресуспендировали в растворе 12 мас. % поливинилового спирта до однородного распределения клеток в растворе. Полученную суспензию равными частями вносили в 96-луночный планшет и выдерживали при -20°С в течение 24 часов, хранили при температуре +4°С.

Экспериментально было доказано, что оптимальная концентрация метаболически активных клеток для биокатализатора в настоящем изобретении составляет 2 мас. %. Данный выбор был основан при сравнении двух образцов криогеля с различающимися концентрациями клеток, заключенных в матрицу криогеля ПВС, в процессе разжижения полисахарида ксантана. Использование концентрации клеток, равной 2 мас. % на 75% более эффективно снижало вязкость ксантана на вторые сутки по сравнению с образцом биокатализатора, где концентрация клеток составила 6 мас. % (фиг. 1). На основании этих данных можно заключить, что пространственное расположение клеток консорциума в пористой структуре носителя в концентрации 2 мас. % обеспечило наиболее оптимальную длительность процесса, многократное применение без потери активности и стабильности.

В ходе экспериментов для создания стабильного криогеля были исследован диапазон значений концентрации ПВС от 6 до 14 мас. %, включая концентрацию ПВС, составляющую 12 мас. %, выбранную на основе протокола иммобилизации микробных клеток, описанных в работе: Catalysts. 2018. Т 8, №1. С. 33 [15]. Было показано, что при использовании концентраций ПВС ниже 12 мас. % не удается достичь рабочей консистенции криогеля. При повышении концентрации криогель становится хрупким. Полученные результаты показывают неудовлетворительное состояние криогеля при использовании концентраций ПВС ниже или выше 12 мас. %, что приводит к невозможности или существенным затруднениям работы с биокатализатором. На основании этих данных, был сделан вывод, что концентрация ПВС, составляющая 12 мас. %, является оптимальной для создания стабильного криогеля.

Таким образом, для создания заявляемого биокатализатора на основании экспериментальных данных были выбраны следующие условия: бактериальная суспензия из консорциума бактерий - 2 мас. %, поливиниловый спирт - 12 мас. %.

Пример 4. Опытная проверка работы многократного использования биокатализатора, иммобилизованного в матрицу поливинилового спирта, для деструкции ксантана.

Биокатализатор в матрице поливинилового спирта помещают в питательную среду следующего состава, % (вес./об.): ксантан, 0,3; пептон, 0,1; YNB, 0,34. Затем при 28°С осуществляют перемешивание смеси (120 об/мин) до необходимого снижения вязкости культуральной среды (вязкость исходного раствора составляла 230 сП). Изменение вязкости контролируют на ротационном вискозиметре. Вязкость была снижена до 1,05 сП (1 rpm) без потери формы матрицы. Общая каталитическая активность составила 19,6 ед/г (фиг. 2).

При достижении необходимого значения вязкости иммобилизованный биокатализатор извлекают из культуральной жидкости, промывают в 0,9% растворе NaCl и помещают в новую питательную среду того же состава для следующего цикла.

Заявленный биокатализатор был испытан в течение 40 циклов деградации ксантана от исходной вязкости 230 сП (1 rpm) (0,3% ксантан) до 1,05 сП (1 prm) без потери формы и общей ксантаназной активности (19,6 ед/г) (фиг. 2).

Заявленный биокатализатор сохраняет активность в течение не менее 40 циклов по 36-38 часов. Общая длительность эффективного использования достигает не менее 1440 часов. При сохранении удельной ксантаназной активности 19,6 ед/г.

Выводы: Выявлена симбиотическая смесь бактерий, способная осуществлять деструкцию ксантана, результаты метагеномного анализа бактериальной смеси депонированы в базе данных Sequence Read Archive под номером BioProject PRJNA849974. Заявляемый биокатализатор, иммобилизованный в матрице криогеля поливинилового спирта, полученный путем ресуспендирования 2 мас. % клеток симбиотической смеси бактерий в растворе 12 мас. % поливинилового спирта до их однородного распределения и выдерживания ее при -20°С в течение 24 часов с последующим хранением при температуре +4°С, сохраняет удельную ксантаназную активность в течение длительного времени (не менее 40 циклов по 36-38 часов). Общая длительность эффективного использования достигает не менее 1440 часов. Ксантаназная активность биокатализатора составляет 19,6 ед/г в конце каждого цикла.

Разработанный биокатализатор в матрице поливинилового спирта обладает возможностью длительного использования без потери каталитической активности и стабильности матрицы.

Финансирование: Работа выполнена при финансовой поддержке «Курчатовского геномного центра - ПИЯФ» программой развития центров генетических исследований мирового уровня, Соглашение No. 075-15-2019-1663.

Список использованной литературы

1. Неверов А.Л., Гусев А.В., Минеев А.В., Рожков В.П. Буровые растворы с низким содержанием твердой фазы для бурения комплексами ССК на основе бентонитов таганского месторождения. Журнал СФУ. Техника и технологии. 2013. Т. 6(1). С. 95-106.

2. Максина Е.В., Ермаков В.В. Биологическая деструкция отработанных полисахаридсодержащих буровых растворов. 2016. Экология и промышленность России. Т. 20, №9. С. 12-15.

3. Christensen В.Е., Smidsroed О., Elgsaeter A., Stokke В.Т. Depolymerization of double-stranded xanthan by acid hydrolysis: characterization of partially degraded double strands and single-stranded oligomers released from the ordered structures. 1993. Macromolecules. T. 26, №22. C. 6111-6120.

4. Денисенко Ю.А., Рожкова A.M., Зоров И.Н., Синицын А.П., Рыков С.В., Березина О.В., Бровкин А.Н. Патент №RU 2754795 C1: Штамм Paenibacillus taichungensis ВКМ B-3510D для деструкции ксантана. Заявл. 18.12.2020; Опубл. 07.09.2021.

5. Патент US4410625. Cadmus М.С., Silverstein М. Н., McConnell D.G., Ribando С.Р. Salt-tolerant microbial xanthanase and method of producing same. 18.10.1983.

6. Патент US 499615 3A. Cadmus M.C, Slodki M.E. Heat-stable, salt-tolerant microbial xanthanase, опубл. 26.02.1991.

7. RU 2636041 «Иммобилизованный биокатализатор для получения бактериальной целлюлозы».

8. RU 2383618 «Иммобилизованный биокатализатор для микробиологического получения пектиназ».

9. RU 2360967 «Биокатализатор на основе иммобилизованных клеток бактерий для разложения метилфосфоновой кислоты и ее эфиров».

10. RU 2626528 «Иммобилизованный биокатализатор для получения фумаровой кислоты».

11. RU 2524434 «Иммобилизованный биокатализатор для микробной биотрансформации стероидных соединений».

12. Polakovic М, Svitel J, Bucko М, Filip J, Nedela V, Ansorge-Schumacher MB, Gemeiner P. Progress in biocatalysis with immobilized viable whole cells: systems development, reaction engineering and applications. Biotechnol Lett. 2017. T. 39, №5. С 667-683.

13. M., Kunze М., Ribeiro J., Geinitz В., Lehmann С., Schwaneberg U., et al. Cellulolytic RoboLector-towards an automated high-throughput screening platform for recombinant cellulase expression. J. Biol. Eng. 2017. T. 11, №1.

14. Gtir S.D., idil N., Aksoz N. Optimization of Enzyme Co-Immobilization with Sodium Alginate and Glutaraldehyde-Activated Chitosan Beads. Appl Biochem Biotechnol. 2018. T. 184, №2. C. 538-552.

15. Stepanov N.A., Efremenko E. "Deceived" Concentrated Immobilized Cells as Biocatalyst for Intensive Bacterial Cellulose Production from Various Sources. Catalysts. 2018. T 8, №1. C. 33.

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой биокатализатор на основе симбиотической смеси бактерий, клетки которых иммобилизованы в криогеле поливинилового спирта, идентифицированных в результате метагеномного анализа: Paenibacillus spp., Cellulosimicrobium cellulans. Результат метагеномных прочтений был депонирован в базе данных Sequence Read Archive под номером BioProject PRJNA849974. Заявляемый биокатализатор сохраняет удельную ксантаназную активность в течение длительного времени (не менее 40 циклов по 36-38 часов). Общая длительность эффективного использования достигает не менее 1440 часов. Ксантаназная активность полиферментного комплекса составляет 19,6 ед/г в конце каждого цикла. 2 ил., 3 пр.

Биокатализатор для деструкции ксантана на основе иммобилизованных клеток симбиотической смеси, содержащей бактерии Paenibacillus sp. - 83% и Cellulosimicrobium cellulans - 17%, иммобилизованные в матрицу криогеля путем ресуспендирования микробных клеток - 2 мас. % в растворе 12 мас. % поливинилового спирта до их однородного распределения с последующим выдерживанием суспензии при -20°С в течение 24 часов с последующим хранением матрицы при температуре +4°С.