Симбиотическая смесь бактерий для деструкции ксантана Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и касается новой симбиотической смеси бактерий, продуцирующей ксантаназный комплекс ферментов. Изобретение может найти применение в области нефтедобычи, пищевой и фармакологической (медицинской) промышленности.

Большой объем полисахарида ксантана используется в процессах интенсификации работы нефтяных и газовых скважин в качестве расклинивающего агента, что обусловлено способностью ксантана повышать вязкость буровых растворов. Продукты на основе ксантановой камеди выпускаются под такими торговыми марками, как Rhodopol-23P, Zibozan, Flowzan, Flo-Vis и др.: Журнал СФУ. Техника и технологии. 2013. Т. 6(1). С. 95-106 [1]. С точки зрения экологии и природопользования важно, чтобы по завершению работ вязкость растворов бурения (расклинивающего агента) была существенно снижена, для чего необходимо провести их деструкцию.

Существуют способы химической деструкции сложного полимера ксантана, требующие воздействия сильных кислот и высоких температур: Macromolecules. 1993. Т. 26, №22, С. 6111-6120 [2]. Более экологичными и менее энергозатратными способами признаны биологические способы деструкции ксантановых смол посредством ферментов, синтезируемых микроорганизмами.

Ксантан представляет собой внеклеточный полисахарид, продуцируемый микроорганизмами Xanthamonas campestris. Основная цепь ксантана состоит из остатков D-глюкопиранозы, соединенных между собой Р~1,4-гликозидной связью. Боковые цепи образованы D-маннозой (β-1,4), D-глюкуроновой кислотой (β-1,2) и D-маннозой, которая связана с молекулой глюкозы а-1,3-связью: Биополимеры растений. 2021. №4. С. 95-104 [3]; J. Environ. Manage. 2014. T. 144. С. 1-25 [4]. Боковые цепи ксантана модифицированы пируватными и/или ацетильными группами, их количество в структуре связано с вязкостью и стабильностью биополимера: Biotechnol. Res. Innov. 2022, T. 6, №1. С.e202204 [5].

Ферменты, используемые при деструкции ксантана, объединяют единым термином «ксантаназы» или «ксантаназный комплекс». Термин «ксантаназа» применяется для обозначения всего комплекса ксантанолитических ферментов, катализирующих реакции деградации ксантана. Недостаток информации об использовании индивидуальных ферментов, входящих в этот комплекс, их характеристиках и вкладе в процесс деградации ксантана, а также о продуцентах таких ферментов ограничивает создание эффективного инструмента для полной деструкции основных и боковых цепей ксантана. Исходя из структуры молекулы ксантана, для его полной деградации, включая его боковые цепи, необходимы, как минимум, следующие ферменты: эндо-глюканаза, ксантан-лиаза, бета-глюкозидаза или глюкуронидаза, маннозидаза (альфа- и/или бета-): Дисс. на соискание уч. степени канд. биол. наук, Москва, 2022 [6].

Известны методики деструкции ксантана с использованием ферментов, продуцируемых бактериями рода Paenibacillus: Iran J Biotechnol. 2017. T. 15, №2. С. 120-127 [7], а также посредством ксантаназы из бактериального штамма Corynebacterium 20/122: Патент ЕР 0030393 В1, 1983 [8]. В патенте RU2754795 был зарегистрирован штамм бактерий Paenibacillus taichungensis 15, обладающий способностью разлагать ксантан и использовать его в качестве единственного источника углерода: Патент RU 2754795 [9]. При культивировании штамма в течение 96 часов, он способен продуцировать кулыуральную жидкость с активностью 26 ед/мл по отношению к ксантану. В патенте WO 9839397 «Методы и материалы для деградации ксантана», описано использование смешанной бактериальной культуры, депонированной в коллекции микроорганизмов под номером АТСС №55941, демонстрирующей общую ксантаназную активность 10,4 ед/г [10].

Общим недостатком перечисленных изобретений является ограниченность информации о составе ферментов, обозначенных общим термином «ксантаназы», что приводит к неопределенности в оценке ксантаназной активности, в том числе из-за различных методик измерения.

Наиболее близким аналогом (прототипом) является консорциум бактерий NRRL В-18445, который продуцирует ферментный комплекс ксантаназ. В ходе культивирования смеси бактерий в течении 8 дней в культуральной жидкости была детектирована общая ксантаназная активность 195 ед/мг по ксантану: патент US 4996153 [11]. Основными недостатками данного изобретения, как и выше приведенных аналогов, являются отсутствие информации о продуцируемых ферментах, катализирующих деструкцию основных и боковых цепей ксантана, что не позволяет выявить новые специфичные ферменты как инструменты для деградации ксантана.

Технический результат достигается идентификацией симбиотической смеси бактерий, содержащей, согласно данным метагеномного анализа, микроорганизмы Paenibacillus sp.- 83% и Cellulosimicrobium cellulans - 17%, обладающей свойством деградировать ксантан.

Экспериментальным путем определено, что заявляемая симбиотическая смесь содержащая микроорганизмы Paenibacillus sp., Cellulosimicrobium cellulans, которые при ее культивировании в среде, содержащей 0,3% (вес/об.) ксантана при температуре 28°С, продуцирует ферменты: бета-глюкозидаза, альфа-маннозидаза, бета- маннозидаза, эндоглюканаза и ксантан-лиаза, катализирующие деструкцию основных и боковых цепей ксантана.

Конкретная реализация состоит в следующем:

1. На жидкой питательной среде состава, % (вес/об.): ксантан, 0,3; пептон, 0,1; YNB, 0,34 при температуре 28°С был обнаружен рост симбиотической смеси бактерий для деструкции ксантана.

2. Индентификация смеси бактерий была выполнена методом метагеномного анализа последовательностей общей ДНК, выделенной из смешанной бактериальной культуры. Выделение общей метагеномной ДНК, подготовка библиотек и секвенирование на приборе MiSeq® System (Illumina, USA) с использованием MiSeq Reagent kit v2 (Illumina; США) проводили по протоколу, детально описанному ранее [12]. Секвенирование проводилось на платформе Hiseq 2500 (Illumina) в режиме парноконцевого чтения с длиной прочтения 160 пар оснований. Метагеномный анализ проводился с помощью программного пакета Kaiju (https://github.com/bioinformatics-centre/kaiju) на основе баз данных NCBI BLAST, с отсеиванием последовательностей, у которых длина классификации менее 50 пар оснований. Для сравнения полученных данных использовался сервис JSpeciesWS (https://jspecies.ribohost.eom/jspeciesws/#home).

Идентификация бактериальных культур в смеси, выделенной на среде, содержащей ксантан, была осуществлена методом метагеномного shotgun секвенирования по содержанию маркерных генов, специфичных для организмов, идентифицированных из 100000 эталонных геномов (99 500 бактерий и архей и 500 эукариот) и сравнительного анализа. Совпадение геномов на не менее, чем 85% позволило говорить о родовой идентичности.

Результаты метагеномного анализа позволяют предположить возможные доли следующих бактерий, гомологичных Paenibacillus sp.- 83%, Cellulosimicrobium cellulans - 17%. Проценты, указанные на таксономических уровнях, являются процентами только для соотнесенных прочтений. Метагеномные прочтения были депонированы в базе данных Sequence Read Archive (SRA) NCBI (номер в базе данных BioProject PRJNA849974).

3. Морфологический анализ бактерий, входящих в состав симбиотической смеси, выявил следующие особенности каждого из выделенных микроорганизмов:

- Paenibacillus spp.

Вегетативные клетки представляют собой палочки, 0,5-1,0 (3,0-4,0 мкм, встречаются поодиночке или короткими цепочками. Клетки продуцируют овальные споры, расположенные терминально в набухающих спорангиях, и являются грамотрицательными. Колонии при 30°С на среде TSA кремового цвета, гладкие, с правильными целыми краями. На средах, содержащих 2% глюкозы, колонии образуют слизи.

- Cellulosimicrobium cellulans

Грамположительные подвижные палочки неправильной формы 0,5-0,6 (2,0-5,0 мкм, прямые или слегка изогнутые, некоторые в парах V-образной конфигурации. После 24 ч. инкубации при 37°С на 5%-м агаре с добавлением конской крови колонии чуть желтые, выпуклые и гладкие, при дальнейшей инкубации проникали в агар, образуя субстратный мицелий. Клетки, выросшие на среде с кровяным агаром, представляют собой длинные и тонкие грамположительные палочки, которые при дальнейшем инкубировании становятся коккобациллярными.

4. Проверка общей ксантаназной активности симбиотической смеси бактерий осуществлена при глубинном культивировании при температуре 28°С в течение 36-38 ч на питательной среде следующего состава, % (вес./об.): ксантан, 0,3; пептон, 0,1; ΥΝΒ, 0,34, с последующим измерением вязкости и количества редуцирующих сахаров (см. Пример 1).

Стандартная температура роста бактерий в лабораторных условиях составляет 37°С. Однако, как показали эксперименты, при росте при температуре 37°С симбиотической смеси бактерий, содержащей Paenibacillus sp., Cellulosimicrobium cellulans, ксантаназная активность не проявляется, что подтверждено данными по отсутствию снижения вязкости ксанатана. Надежный результат проявляется при температуре 28°С.

5. Хранение симбиотической смеси бактерий осуществлялось в холодильнике при температуре 4-8°С на чашках Петри на LB-агаре (рН 6,5-7,0). Длительное хранение симбиотической смеси проводилось в лиофильно высушенном состоянии, в качестве криопротектора использованы сахароза 10% и желатин 1%, ампулы хранят при 4-8°С. Заявленная симбиотическая смесь ксантанолитических бактерий находится на хранении в коллекции микроорганизмов лаборатории биотехнологии НИЦ «КИ» ПИЯФ.

Экспериментально показано, что бактериальная смесь демонстрировала наличие как индивидуальных ферментативных активностей, так и общей ксантаназной активности, приводящих к деградации основных и боковых цепей ксантана. Смесь бактерий, искусственно составленная из индивидуально выделенных из исходной смеси микроорганизмов, не приводит к проявлению ксантаназной активности.

Изобретение проиллюстрировано следующими примерами, не ограничивающими его применение:

Пример 1. Определение общей ксантаназной активности симбиотической смеси бактерий на среде с концентрацией ксантана 0,3%.

Для получения кулыуральной жидкости готовили жидкую среду следующего состава, % (вес./об.): ксантан, 0,3; пептон, 0,1; YNB, 0,34. Среду разливали по 100 мл в колбы объемом 500 мл и стерилизовали. После 36-38 часов культивирования смеси бактерий при 28°С на шейкере (120 об/мин) в отобранных образцах кулыуральной жидкости были оценены значения удельной активности ксантаназного комплекса. За единицу активности принимали такое количество ферментного препарата, которое в течение 1 минуты при 40°С и рН 6,5 высвобождает 1 мкмоль восстанавливающих сахаров, эквивалентных 1 мкмоль глюкозы. Общее количество восстанавливающих сахаров определяли тестом с использованием реактива иора-хлоргидробензойная кислота согласно описанной методике: J. Biol. Eng. 2017, T. 11, №1 [13]. Удельная ксантаназная активность в конечной точке культивирования после 36-38 ч составила 19,6 ед/г.

После 36-38 часов культивирования вязкость кулыуральных жидкостей составила 1,05 сП (1 rpm), вязкость контрольного раствора - 230 сП (1 rpm). В ходе культивирования вязкость жидкой питательной среды, содержащей ксантан, уменьшилась в 230 раз по сравнению с контрольным раствором. Различие с прототипом в оценке величины общей ксантаназной активности связано с разными подходами измерения активностей ферментов. Определение активности в настоящем изобретении выполнено в соответствии с международными стандартами расчета удельной ферментативной активности: Досон Р., Эллиот Д., и др. Справочник биохимика. 1991. М.: Мир. 544 с. [14].

Пример 2. Проверка общей ксантаназной активности симбиотической смеси бактерий при росте на среде с концентрацией ксантана 1% (вес/об.).

Клетки симбиотической смеси были внесены в стерильную жидкую среду как описано в примере 1. Исходная концентрация ксантана в среде составила 1% (вес./об.). После 74 часов культивирования при 28°С на шейкере (120 об/мин) вязкость жидкой питательной среды, содержащей 1% (вес./об.) ксантан, снижалась с 6,0 до 1,2 сП (0,1 rpm).

Пример 3. Определение активностей ферментов ксантаназного комплекса симбиотической смеси бактерий, способных к полной деградации основной и боковых цепей ксантана.

Клетки симбиотической смеси культивировали в той же жидкой среде и при тех же условиях как описано в Примере 1. После 36-38 часов культивирования симбиотической смеси в отобранных образцах культуральной жидкости были оценены значения удельных активностей бета-глюкозидазы, альфа-маннозидазы, бета-маннозидазы и эндоглюканазы. Реакционную смесь, содержащую 100 мкл культуральной жидкости, 5 ммоль соответствующего субстрата (иара-нитрофенил-β-D-глюкопиранозида, пара-нитрофенил-α-L-маннопиранозида, пара-нитрофенил-β-D-маннопиранозида, пара-нитрофенил-β-D-целлопиранозида) и 50 ммоль фосфат-цитратного буфера (рН 6,5) инкубировали в течение 120 минут при 40°С. Реакцию останавливали добавлением 0,5 мл 10% раствора соды. Поглощение свободного пара-нитрофенола измеряли при длине волны 400 нм на спектрофотометре JascoV-560 UV/Vis (Jasco, Analytical Instruments, Япония) относительно контроля. Одну единицу активности определяли как активность, необходимую для получения 1 мкмоль пара-нитрофенола за 1 минуту при данных условиях.

Ксантан-лиазную активность определяли в 1 мл реакционной смеси, содержащей 0,05% ксантана и 50 ммоль фосфат-цитратного буфера, рН 6,5, контролируя увеличение поглощения при 235 нм. Одну единицу активности фермента определяли как количество фермента, необходимое для увеличения оптической плотности при 235 нм 1,0 в минуту.

Содержание белка в образцах определяли по методу Лоури (калибровочный стандарт - бычий сывороточный альбумин, фотоколориметрирование - при 750 нм): J. Biol. Chem. 1951. T. 1, С. 265-275 [15].

Результаты измерений удельных активностей ферментов, входящих в ксантаназный комплекс симбиотической смеси, приведены в Таблице 1.

В сравнении с прототипом решена задача по определению основных ферментативных активностей, необходимых для деградации основной и боковых цепей ксантана.

Выводы: выявлена симбиотическая смесь бактерий для деструкции ксантана, содержащая, по результатам метагеномного анализа, микроорганизмы Paenibacillus spp., Cellulosimicrobium celluloliticum, которые при ее культивировании в среде, содержащей 0,3% (вес./об.) ксантана при температуре 28°С, продуцирует ферменты: бета-глюкозидаза, альфа-маннозидаза, бета-маннозидаза, эндоглюканаза, ксантан-лиаза, катализирующие деструкцию основных и боковых цепей ксантана. Симбиотическая смесь ксантанолитических бактерий обладает общей ксантаназной активностью 19,6 ед/г при культивировании в течение 36 часов при 28°С в среде с содержанием 0,3% (вес/об.) ксантана. Удельные активности заявляемого ксантаназного комплекса оставляют: бета-глюкозидаза 27,5 ед/г, альфа-маннозидаза 25,2 ед/г, бета-маннозидаза 6,3 ед/г, эндоглюканаза 7,9 ед/г, ксантан-лиаза 183 ед/г.

Таким образом, доказана возможность расширения ассортимента ферментов, таких как бета-глюкозидаза, альфа-маннозидаза, бета-маннозидаза, эндоглюканаза и ксантан-лиаза, катализирующих деструкцию основных и боковых цепей ксантана.

Финансирование: Работа выполнена при финансовой поддержке «Курчатовского геномного центра - ПИЯФ» программой развития центров генетических исследований мирового уровня, Соглашение No. 075-15-2019-1663.

Список литературы

1. Неверов А.Л., Гусев А.В., Минеев А.В., Рожков В.П. Буровые растворы с низким содержанием твердой фазы для бурения комплексами сек на основе бентонитов таганского месторождения. Журнал СФУ. Техника и технологии. 2013, Т. 6, №1, С. 95-106.

2. Christensen В.Е., Smidsroed О., Elgsaeter A., Stokke В.Т. Depolymerization of double-stranded xanthan by acid hydrolysis: characterization of partially degraded double strands and single-stranded oligomers released from the ordered structures. Macromolecules. 1993, T. 26, №22, C. 6111-6120.

3. Осовская И.И., Бородина A.M., Курзин A.B., Рощин В.И. Синтез и свойства модифицированной ксантановой камеди. Биополимеры растений. 2021, №4, С. 95-104.

4. More Т.Т., Yadav J.S.S., Yan S., Tyagi R.D., Surampalli R.Y. Extracellular polymeric substances of bacteria and their potential environmental applications. J. Environ. Manage. 2014. T. 144, C. 1-25.

5. Furtadoa I.F.S.P.C., Sydneya E.B., Rodriguesa S.A., Sydney A.C.N. Xanthan gum: applications, challenges, and advantages of this asset of biotechnological origin. Biotechnol. Res. Innov. 2022, T. 6, №1. C. e202204.

6. Ельченинов А.Г. Метаболизм представителей филума Planctomycetes, обитающих в термальных экосистемах. Дисертация на соискание уч. степени канд. биол. наук: ФИЦ Фунд. осн. биотех. РАН, Москва, 2022,116 с.

7. Ashraf S., Soudi M.R., Ghadam P. Production of Xanthanases by Paenibacillus spp.: Complete Xanthan Degradation and Possible Applications. Iran J Biotechnol. 2017. T. 15, №2. C. 120-127.

8. Патент ЕР 0030393 В1. Cripps R.E., Sommerville H.J., Holt M.S. Xanthanase enzyme and its production, заявл. 29.10.1979, опубл. 15.06.1983.

9. Патент RU 2754795C1. Денисенко Ю.А., Рожкова A.M., Зоров И.Н., Синицын А.П., Рыков С.В., Березина О.В., Бровкин А.Н. Штамм Paenibacillus taichungensis ВКМ В-3510D для деструкции ксантана, заявл. 18.12.2020, опубл. 07.09.2021.

10. Патент W09839397al. Tjon-Joe-Pin R.M., Carr M.A., Yang В. Methods and materials for degrading xanthan, заявл. 07.03.1997, принято 06.03.1998, опубл. 11.09.1998.

11. Патент US4996153A. Cadmus М.С., Slodki M.E. Heat-stable, salt-tolerant microbial xanthanase, опубл. 26.02.1991.

12. Korzhenkov A.A., Tepliuk A.V., Sidoruk K.V., Voyushin K.E., Patrushev M.V., Kublanov I.V., Toshchakov S.V. A dataset of four probiotic Bifidobacterium strains genome assemblies. 2020. T. 34, C. 106710.

13. M., Kunze M., Ribeiro J., Geinitz В., Lehmann C, Schwaneberg U., et al. Cellulolytic RoboLector-towards an automated high-throughput screening platform for recombinant cellulase expression. J. Biol. Eng. 2017. T. 11, №1.

14. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. 1991. М.: Мир. 544 с.

15. Lowry О., Rosebrough N., Farr A. L., Randall R. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 1951. Т. 1, C. 265-275.

Изобретение относится к области биотехнологии и касается новой симбиотической смеси бактерий, продуцирующей ксантаназный комплекс ферментов. Основу симбиотической смеси составляют штаммы, идентифицированные в результате метагеномного анализа: Paenibacillus sp.FSL R7-277 - 83%, Cellulosimicrobium cellulans - 17%. Проценты, указанные на таксономических уровнях, являются процентами только для соотнесенных прочтений. Метагеномные прочтения были депонированы в базе данных Sequence Read Archive (SRA) NCBI (номер в базе данных BioProject PRJNA849974). Состав заявляемого ксантаназного комплекса определен путем измерения удельных активностей ферментов: бета-глюкозидаза 27,5 ед./г, альфа-маннозидаза 25,2 ед./г, бета-маннозидаза 6,3 ед/г, эндоглюканаза 7,9 ед./г, ксантан-лиаза 183 ед./г. Изобретение позволяет расширить ассортимент микроорганизмов-продуцентов ферментов, деградирующих ксантан, а также может использоваться в биотехнологии для получения новых высокоспецифичных ферментов, способных к полной деструкции основной и боковых цепей ксантана. 1 табл., 3 пр.

Симбиотическая смесь бактерий, содержащая штаммы микроорганизмов Paenibacillus sp. - 83%, Cellulosimicrobium cellulans - 17%, обладающая свойством деградировать ксантан.