ШТАММ КЛУБЕНЬКОВЫХ БАКТЕРИЙ Bradyrhizobium japonicum ВКМ В-2456D ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ ПОД СОЮ Российский патент 2011 года по МПК C12N1/20 C05F11/08 C12R1/01 

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и может быть использовано для производства бактериального удобрения для сои.

Наиболее близким к изобретению является штамм Bradyrhizobium japonicum 648А, используемый для приготовления соевого нитрагина (а.с. СССР №1524432).

Известные штаммы обладают сравнительно низким уровнем вирулентности и активности и в качестве источника углеродного питания используют только маннит.

При создании изобретения ставилась задача получения штамма, обладающего более высокой эффективностью с высокими адаптационными возможностями.

Задача решается новым штаммом клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum БМ-85к, который выделен в 2003 году из клубеньков дикорастущей сои, произрастающей на пойменных почвах Благовещенского района Амурской области.

Полученный штамм депонирован и хранится во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) им. Г.К.Скрябина Российской академии наук под регистрационным номером ВКМ B-2456D и коллекции ГНУ Всероссийского научно-исследовательского института сои под номером БМ-85к.

Штамм Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2456D характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками.

Культурально-морфологические признаки

В молодом возрасте бактерии штамма Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2456D подвижные, представляют собой удлиненные палочки размером (2,3…2,5)×0,4 мк. Грамотрицательные. Быстрорастущая культура. В чашках Петри на маннитно-соевой твердой питательной среде указанные бактерии вырастают на 20 сутки после посева, образуя выпуклые, молочно-белые, слизистые колонии диаметром 1,0…3,1 мм. Бактерии Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2456D хорошо растут и на других питательных средах:

Среда Норриса, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; MgSO₄ - 0,8; NaCl - 0,2; FeCl₃ - 0,01; дрожжевой экстракт - 2,0; маннит - 10,0.

Соевая среда с маннитом, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; маннит - 20; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

Соевая среда с глюкозой, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; глюкоза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

Соевая среда с сахарозой, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; сахароза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

Соевая среда с мальтозой, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; мальтоза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

Соевая среда с лактозой, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; лактоза - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

Навеску соевой муки получают путем размола пророщенных соевых семян, заливают 1 литром воды и кипятят в течение 30 минут. В фильтрат, доведенный до 1 литра, вносят соли.

При выращивании штамма ВКМ B-2456D в пробирках на всех вышеперечисленных средах (при температуре 28°C в течение 480 часов) отмечен обильный рост штриха гелеобразной молочно-белой консистенции. При длительном хранении чистой культуры в холодильнике при температуре 4°C консистенция штриха штамма ВКМ B-2456D не изменяется.

Физиолого-биохимические признаки

Аэроб.

Температурный диапазон роста 27-30°C. Оптимальная температура роста 27-28°C.

Оптимум pH 7,0.

Отношение к источникам углерода. Хорошо усваивает и растет на сахарозе, глюкозе, мальтозе, лактозе, манните с образованием продуктов кислотного характера.

Признаки штамма устойчивые. Штамм не патогенен. Пересевается один раз в 6 месяцев. Хранится в пробирках на маннитно-соевом агаре при температуре 4-5°C.

Штамм ВКМ B-2456D идентифицирован по «Определителю» Берги (1980) как штамм вида Bradyrhizobium japonicum.

Штамм Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2456D отличается от ранее известных штаммов клубеньковых бактерий сои способностью использовать различные источники углеродного питания.

Изобретение поясняется следующим конкретным примером использования штамма Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2456D.

Пример

Посевной материал получают выращиванием штамма в пробирках с агаризованной питательной соевой средой с маннитом, г/л: K₂HPO₄ - 0,5; KH₂PO₄ - 0,5; NaCl - 0,1; MgSO₄ - 0,1; CaSO₄ - 0,1; соль молибдена - следы; маннит - 20,0; соевая мука - 10,0; агар-агар - 15,0.

После посева пробирки с бактериальной культурой выставляют в термостаты с температурой 27-28°C на 20 суток. За это время в пробирках на косячке плотной питательной среды отмечается обильное нарастание бактериальной массы испытываемого штамма.

Для инокуляции семян в день посева сои готовят бактериально-молибденовую смесь. Для этого в пробирки со штрихом испытываемого штамма клубеньковых бактерий сои вносят по 2,5 мл заранее приготовленного 1,25% раствора молибдена (25 г/л молибдата аммония). Штрих с косяка питательной среды смывают раствором молибдена. Путем встряхивания пробирки получают однородную бактериально-молибденовую смесь, которой сразу же обрабатывают семена сои. Полученный объем суспензии (2,5 мл) используют для предпосевной обработки 250 г семян сои. После нанесения суспензии семена сои тщательно перемешивают, подсушивают в тени и высевают в подготовленную почву.

В таблице приводятся данные об эффективности штамма ВКМ B-2456D в зависимости от условий года, полученные в результате проведения полевых экспериментов. Опыты проводили на лугово-черноземовидных почвах с сортом сои Соната. Бактеризованные семена высевают в день обработки. Штамм Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2456D по сравнению с контролем (штамм B.japonicum 648A) стабильно повышал урожайность семян сои в течение трех лет испытаний в среднем на 1,8 ц/га.

Эффективность штамма Bradyrhizobium japonicum ВКМ B-2456D Штамм Урожайность семян сои по годам, ц/га Средняя урожайность, ц/га 2004 г. 2006 г. 2007 г. Контроль (штамм 648A) 17,1 24,8 16,6 19,5 БМ-85к (ВКМ B-2456D) 18,5 27,4 18,0 21,3

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм клубеньковых бактерий Bradyrhizobium japonicum БМ-85к выделен из природной популяции клубеньковых бактерий, распространенной в почвах южной зоны Амурской области, и депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) им. Г.К.Скрябина Российской академии наук под регистрационным номером BKM B-2456D. Изобретение позволяет повысить урожай семян сои и улучшить его качество. 1 табл.

Штамм клубеньковых бактерий сои вида Bradyrhizobium japonicum BKM B-2456D для изготовления бактериального удобрения под сою.