Способ получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы человека с помощью фермента Российский патент 2023 года по МПК A61B10/02 C12N5/71 A61F9/07 

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, может найти применение в клинической практике для замещения дефектов эндотелиального слоя роговицы.

В настоящее время патология эндотелиального слоя роговицы различного генеза, включая как первичную генетически детерминированную эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса, так и вторичную буллезную кератопатию, является одной из основных и наиболее часто встречающейся патологией роговицы, требующей проведения оптической кератопластики. Единственным вариантом лечения данных пациентов до сих пор остается только выполнение трансплантации роговицы, с заменой всей роговицы или ее части на донорскую. В практике офтальмохирургов у пациентов с эндотелиальной недостаточностью роговицы по-прежнему преобладает метод сквозной кератопластики. Однако стоит также отметить, что в последние 2 десятилетия активно внедряется в клиническую практику более патогенетически обоснованная методика селективной замены эндотелия, а именно задняя послойная кератопластика (ЗПК). В ходе ЗПК у реципиента удаляется дефектный монослой эндотелия с подлежащей Десцеметовой мембраной (ДМ), после чего на подготовленное ложе трансплантируется предварительно заготовленный донорский послойный трансплантат, состоящий из слоя стромы роговицы, ДМ и эндотелиальных клеток. Толщина заднего послойного трансплантата в среднем составляет 120 мкм. Данная технология имеет массу преимуществ в сравнении со сквозной кератопластикой, одним из основных является исключение необходимости проведения операции по типу «открытого неба», когда глазное яблоко реципиента полностью разгерметизировано. Соответственно, минимизируется вероятность сопряженных с этим операционных осложнений. Также при ЗПК трансплантируется меньшее количество донорской ткани, что, в свою очередь, снижает риск развития реакции отторжения.

Дальнейшие разработки метода ЗПК привели к ее усовершенствованию и созданию метода эндотелиальной кератопластики (ЭК), при которой трансплантируется изолированная ДМ с монослоем эндотелия без стромального слоя роговицы донора (ТЭДМ). Метод ТЭДМ имеет ряд существенных преимуществ в сравнении с ЗПК, а именно: трансплантируется еще меньший объем донорской ткани, получается более предсказуемый оптический результат операции по причине минимального влияния тончайшего трансплантата (порядка 20 мкм) на послеоперационную рефракцию, улучшаются оптические свойства зоны интерфейса (между подлежащей стромой реципиента и адаптированной трансплантированной ДМ донора). Несмотря на высокую технологичность и результативность метода ТЭДМ, она несет ряд специфических интра- и послеоперационных осложнений: повреждение ДМ в ходе заготовки трансплантата (при отсепаровке от стромы роговицы донора), скручивание мембраны в передней камере глаза реципиента после имплантации, возможность инверсной фиксации трансплантата (эндотелием к строме реципиента), отслойка мембраны в послеоперационном периоде.

В связи с вышесказанным существуют предпосылки для дальнейшего усовершенствования ЭК, при этом одним из путей является трансплантация суспензии эндотелиальных клеток непосредственно в переднюю камеру глаза реципиента.

Заявителю не известны способы получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы человека.

Задачей изобретения является разработка способа получения суспензии нативных эндотелиальных клеток из кадаверных роговиц человека.

Технический результат состоит в получении суспензии эндотелиальных клеток из кадаверного глазного яблока человека путем отслаивания ДМ с эндотелием и переносом их в пробирку Эппендорф с добавлением раствора фермента, обработкой в термошейкере и центрифугированием содержимого пробирки, что является доступной и легко воспроизводимой процедурой при наличии стандартного лабораторного оборудования, что упрощает возможности ее применения.

Способ осуществляется следующим образом:

В качестве донорского материала используют кадаверное глазное яблоко человека, с поверхности которого полностью удаляют эпителий роговицы микрохирургическим скребком. Из кадаверного глазного яблока формируют корнеосклеральный диск (КСД) в стерильных условиях при помощи многоразового трепана. КСД кладут на стерильную поверхность эндотелием вверх. Далее производят отсепаровку краев ДМ от переднего кольца Швальбе на протяжении 180 градусов, пинцетом отслаивают ДМ к центру на половину ее площади, тем самым складывая задним эпителием друг к другу. Трепанационным лезвием производят разрез со стороны задней стромы роговицы, и окончательно отделяют пинцетом ДМ с эндотелием. ДМ с эндотелием переносят в пробирку типа Эппендорф, добавляют 0,3 мл рекомбинантного фермента TrypLE (Invitrogen, США) и помещают в термошейкер 300 об/мин, 37 градусах Цельсия, в течение 5 мин. Далее проводят инактивацию содержимого пробирки 10-кратным разбавлением при помощи раствора для хранения роговицы, с последующим центрифугированием в течение 5 мин, 900 об/мин при 37 градусах Цельсия. Готовая суспензия хранится при температуре 4 градуса Цельсия.

Способ поясняется следующим примером:

Пример 1

В качестве донорского материала использовали кадаверное глазное яблоко человека, с поверхности которого полностью удалили эпителий роговицы микрохирургическим скребком. Из кадаверного глазного яблока формируют КСД в стерильных условиях при помощи многоразового трепана. КСД кладут на стерильную поверхность эндотелием вверх. Далее произвели отсепаровку краев ДМ от переднего кольца Швальбе на протяжении 180 градусов, пинцетом отслоили ДМ к центру на половину ее площади, тем самым складывая задним эпителием друг другу. Трепанационным лезвием произвели разрез со стороны задней стромы, и окончательно отделили пинцетом ДМ с эндотелием. ДМ с эндотелием перенесли в пробирку Эппендорф, добавили 0,3 мл TrypLE (Invitrogen, США) и поместили в термошейкер в течение 5 мин 300 об/мин при 37 градусах Цельсия. Далее произвели инактивацию 10-кратным разбавлением содержимого пробирки раствором для хранения роговицы (ТУ №9398-013-29039336-2008, ООО «НЭП Микрохирургия глаза», Москва), с последующим центрифугированием в течение 5 мин, 900 об/мин при 37 градусах Цельсия. Готовая суспензия хранится при температуре 4 градуса Цельсия.

Таким образом, предложенный способ позволяет получить суспензию эндотелиальных клеток, которые могут найти применение в лечении эндотелиальной недостаточности роговицы.

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии. С поверхности кадаверного глаза человека полностью удаляют эпителий роговицы и из него в стерильных условиях при помощи трепана формируют корнеосклеральный диск (КСД), его кладут на стерильную поверхность эндотелием вверх, далее производят отсепаровку краев Десцеметовой мембраны (ДМ) от переднего кольца Швальбе на протяжении 180 градусов. Пинцетом отслаивают ДМ к центру на половину ее площади, складывая задним эпителием друг к другу. Трепанационным лезвием производят разрез со стороны задней стромы роговицы, отделяют пинцетом ДМ с эндотелием и переносят их в пробирку Эппендорф, добавляют 0,3 мл рекомбинантного фермента TrypLE, затем помещают в термошейкер в течение 5 мин, 300 об/мин при 37 градусах Цельсия. Далее проводят инактивацию содержимого пробирки 10-кратным разбавлением при помощи раствора для хранения роговицы с последующим центрифугированием в течение 5 мин, 900 об/мин при 37 градусах Цельсия. Способ позволяет получить суспензию эндотелиальных клеток из кадаверного глазного яблока человека, что является доступной и легко воспроизводимой процедурой при наличии стандартного лабораторного оборудования, что упрощает возможности ее применения. 1 пр.

Способ получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы человека, характеризующийся тем, что с поверхности кадаверного глаза человека полностью удаляют эпителий роговицы и из него в стерильных условиях при помощи трепана формируют корнеосклеральный диск (КСД), его кладут на стерильную поверхность эндотелием вверх, далее производят отсепаровку краев Десцеметовой мембраны (ДМ) от переднего кольца Швальбе на протяжении 180 градусов, пинцетом отслаивают ДМ к центру на половину ее площади, складывая задним эпителием друг к другу, трепанационным лезвием производят разрез со стороны задней стромы роговицы, отделяют пинцетом ДМ с эндотелием и переносят их в пробирку Эппендорф, добавляют 0,3 мл рекомбинантного фермента TrypLE, затем помещают в термошейкер в течение 5 мин, 300 об/мин при 37 градусах Цельсия; далее проводят инактивацию содержимого пробирки 10-кратным разбавлением при помощи раствора для хранения роговицы с последующим центрифугированием в течение 5 мин, 900 об/мин при 37 градусах Цельсия.