Энзимный способ получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы человека Российский патент 2023 года по МПК A61B10/02 C12N5/71 A61F9/07 

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, может найти применение в клинической практике для замещения дефектов эндотелиального слоя роговицы.

В настоящее время патология эндотелиального слоя роговицы различного генеза, включая как первичную генетически детерминированную эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса, так и вторичную буллезную кератопатию, является одной из основных и наиболее часто встречающейся патологией роговицы, требующей проведения оптической кератопластики. Единственным вариантом лечения данных пациентов до сих пор остается только выполнение трансплантации роговицы, с заменой всей роговицы или ее части на донорскую. В практике офтальмохирургов у пациентов с эндотелиальной недостаточностью роговицы по-прежнему преобладает метод сквозной кератопластики. Однако стоит также отметить, что в последние 2 десятилетия активно внедряется в клиническую практику более патогенетически обоснованная методика селективной замены эндотелия, а именно задняя послойная кератопластика (ЗПК). В ходе ЗПК у реципиента удаляется дефектный монослой эндотелия с подлежащей Десцеметовой мембраной (ДМ), после чего на подготовленное ложе трансплантируется предварительно заготовленный донорский послойный трансплантат, состоящий из слоя стромы роговицы, ДМ и эндотелиальных клеток. Толщина заднего послойного трансплантата в среднем составляет 120 мкм. Данная технология имеет массу преимуществ в сравнении со сквозной кератопластикой, одним из основных является исключение необходимости проведения операции по типу «открытого неба», когда глазное яблоко реципиента полностью разгерметизировано. Соответственно, минимизируется вероятность сопряженных с этим операционных осложнений. Также при ЗПК трансплантируется меньшее количество донорской ткани, что, в свою очередь, снижает риск развития реакции отторжения.

Дальнейшие разработки метода ЗПК привели к ее усовершенствованию и созданию метода эндотелиальной кератопластики (ЭК), при которой трансплантируется изолированная ДМ с монослоем эндотелия без стромального слоя роговицы донора (ТЭДМ). Метод ТЭДМ имеет ряд существенных преимуществ в сравнении с ЗПК, а именно: трансплантируется еще меньший объем донорской ткани, получается более предсказуемый оптический результат операции по причине минимального влияния тончайшего трансплантата (порядка 20 мкм) на послеоперационную рефракцию, улучшаются оптические свойства зоны интерфейса (между подлежащей стромой реципиента и адаптированной трансплантированной ДМ донора). Несмотря на высокую технологичность и результативность метода ТЭДМ, она несет ряд специфических интра- и послеоперационных осложнений: повреждение ДМ в ходе заготовки трансплантата (при отсепаровке от стромы роговицы донора), скручивание мембраны в передней камере глаза реципиента после имплантации, возможность инверсной фиксации трансплантата (эндотелием к строме реципиента), отслойка мембраны в послеоперационном периоде.

В связи с вышесказанным существуют предпосылки для дальнейшего усовершенствования ЭК, при этом одним из путей является трансплантация суспензии эндотелиальных клеток непосредственно в переднюю камеру глаза реципиента.

Заявителю не известны способы получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы человека.

Задачей изобретения является разработка способа получения суспензии нативных эндотелиальных клеток из кадаверных роговиц человека.

Технический результат состоит в получении суспензии эндотелиальных клеток из кадаверного глазного яблока человека путем инсталляции раствором фермента эндотелиальной поверхности роговицы, аспирации и центрифугирования полученного раствора, что является доступной и легко воспроизводимой процедурой при наличии стандартного лабораторного оборудования, что упрощает возможности ее применения.

Способ осуществляется следующим образом:

В качестве донорского материала используют кадаверное глазное яблоко человека, с поверхности которого полностью удаляют эпителий роговицы микрохирургическим скребком. Из кадаверного глазного яблока формируют корнеосклеральный диск (КСД) в стерильных условиях при помощи многоразового трепана. Затем при помощи пинцета колибри КСД удерживают за край склерального ободка КСД. Далее КСД располагают параллельно стерильной чашке Петри эндотелиальной поверхностью роговицы кверху. Следующим этапом производится инстилляция раствора фермента объемом 1 мл на эндотелиальную поверхность роговицы. В качестве ферментов могут быть использованы: 2,5% раствор протеолитического фермента Трипсин-Версен (ПанЭко; Россия), 0,075% раствор коллагенолитического фермента Аккутазы (Thermo scientific, США), или 0,25% раствор рекомбинантного фермента TrypLE (Invitrogen, США) время воздействия 3, 20, 15 мин соответственно. Затем производят атравматическую аспирацию полученного раствора, состоящего из эндотелиальных клеток роговицы и раствора фермента, канюлей 27G. Затем этот раствор переливают в стерильную пробирку, добавляют 5 мл раствора для хранения роговицы и производят центрифугирование при 800 об/мин в течение 5 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После центрифугирования надосадочная жидкость убирается аспиратором со стерильным наконечником. К осадку добавляется добавляют 5 мл раствор для хранения роговицы и с помощью механического дозатора со стерильным наконечником производится забор полученной суспензии в пробирку. Суспензия хранится при температуре +4 градуса Цельсия.

Пример 1.

В качестве донорского материала использовали кадаверное глазное яблоко человека, с поверхности которого полностью удалили эпителий роговицы микрохирургическим скребком. Из кадаверного глазного яблока сформировали корнеосклеральный диск (КСД) в стерильных условиях при помощи многоразового трепана. Затем при помощи пинцета колибри КСД удерживая за край склерального ободка КСД расположили параллельно стерильной чашке Петри эндотелиальной поверхностью роговицы кверху. Следующим этапом произвели инсталляцию 2,5% раствора Трипсин-Версен (ПанЭко; Россия) объемом 1 мл на 3 мин на эндотелиальную поверхность роговицы. Затем произвели атравматическую аспирацию полученного раствора, состоящего из эндотелиальных клеток роговицы и раствора фермента, канюлей 27G. Затем этот раствор перелили в стерильную пробирку, добавили 5 мл раствора для хранения роговицы и произвели центрифугирование при 800 об/мин в течение 5 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После центрифугирования надосадочную жидкость убрали аспиратором со стерильным наконечником. К осадку добавили 5 мл раствора для хранения роговицы и с помощью механического дозатора со стерильным наконечником произвели забор полученной суспензии в пробирку.

Пример 2.

В качестве донорского материала использовали кадаверное глазное яблоко человека, с поверхности которого полностью удалили эпителий роговицы микрохирургическим скребком. Из кадаверного глазного яблока сформировали корнеосклеральный диск (КСД) в стерильных условиях при помощи многоразового трепана. Затем при помощи пинцета колибри КСД удерживая за край склерального ободка КСД расположили параллельно стерильной чашке Петри эндотелиальной поверхностью роговицы кверху.

Следующим этапом произвели инсталляцию 0,075% раствора Аккутазы (Thermo scientific, США) объемом 1 мл на 20 мин на эндотелиальную поверхность роговицы. Затем произвели аналогичные действия примеру 1.

Пример 3.

В качестве донорского материала использовали кадаверное глазное яблоко человека, с поверхности которого полностью удалили эпителий роговицы микрохирургическим скребком. Из кадаверного глазного яблока сформировали корнеосклеральный диск (КСД) в стерильных условиях при помощи многоразового трепана. Затем при помощи пинцета колибри КСД удерживая за край склерального ободка КСД расположили параллельно стерильной чашке Петри эндотелиальной поверхностью роговицы кверху. Следующим этапом произвели инсталляцию 0,25% раствора TrypLE (Invitrogen, США) объемом 1 мл на 15 мин на эндотелиальную поверхность роговицы. Затем произвели аналогичные действия примеру 1.

Таким образом, предложенный способ позволяет получить суспензию эндотелиальных клеток, которые могут найти применение в лечении эндотелиальной недостаточности роговицы.

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии. С поверхности кадаверного глаза человека полностью удаляют эпителий роговицы и из него в стерильных условиях при помощи трепана формируют корнеосклеральный диск (КСД). Затем при помощи пинцета КСД удерживают за край склерального ободка, располагают параллельно стерильной чашке Петри эндотелиальной поверхностью роговицы кверху и производят на нее инсталляцию протеолитического, коллагенолитического или рекомбинантного раствора фермента объемом 1 мл, время воздействия 3, 20, 15 мин соответственно. Затем производят атравматическую аспирацию полученного раствора, состоящего из эндотелиальных клеток роговицы и раствора фермента, после этого полученный раствор переливают в стерильную пробирку, добавляют 5 мл раствора для хранения роговицы и производят центрифугирование при 800 об/мин в течение 5 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После центрифугирования надосадочную жидкость убирают аспиратором со стерильным наконечником, к осадку добавляют 5 мл раствора для хранения роговицы и с помощью механического дозатора со стерильным наконечником производят забор полученной суспензии в пробирку, которую хранят при температуре 4 градуса Цельсия. Способ позволят получить суспензию эндотелиальных клеток из кадаверного глазного яблока человека путем инстилляции раствором фермента эндотелиальной поверхности роговицы, аспирации и центрифугирования полученного раствора. 3 пр.

Способ получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы человека, характеризующийся тем, что с поверхности кадаверного глаза человека полностью удаляют эпителий роговицы и из него в стерильных условиях при помощи трепана формируют корнеосклеральный диск (КСД), затем при помощи пинцета КСД удерживают за край склерального ободка, располагают параллельно стерильной чашке Петри эндотелиальной поверхностью роговицы кверху и производят на нее инсталляцию протеолитического, коллагенолитического или рекомбинантного раствора фермента объемом 1 мл, время воздействия 3, 20, 15 мин соответственно; производят атравматическую аспирацию полученного раствора, состоящего из эндотелиальных клеток роговицы и раствора фермента, затем полученный раствор переливают в стерильную пробирку, добавляют 5 мл раствора для хранения роговицы и производят центрифугирование при 800 об/мин в течение 5 минут при температуре 37 градусов Цельсия; после центрифугирования надосадочную жидкость убирают аспиратором со стерильным наконечником, к осадку добавляют 5 мл раствора для хранения роговицы и с помощью механического дозатора со стерильным наконечником производят забор полученной суспензии в пробирку, которую хранят при температуре 4 градуса Цельсия.