Тканесберегающий способ энзимного получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы человека Российский патент 2024 года по МПК A61F9/07 

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначено для тканесберегающего энзимного получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы человека.

В настоящее время патология эндотелиального слоя роговицы различного генеза, включая как первичную генетически детерминированную эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса, так и вторичную буллезнуюкератопатию, является одной из основных и наиболее часто встречающейся патологией роговицы, требующей проведения оптической кератопластики. Единственным вариантом лечения данных пациентов до сих пор остается только выполнение трансплантации роговицы, с заменой всей роговицы или ее части на донорскую. В практике офтальмохирургов у пациентов с эндотелиальной недостаточностью роговицы по-прежнему преобладает метод сквозной кератопластики. Однако стоит также отметить, что в последние 2 десятилетия активно внедряется в клиническую практику более патогенетически обоснованная методика селективной замены эндотелия, а именно задняя послойная кератопластика (ЗПК). В ходе ЗПК у реципиента удаляется дефектный монослой эндотелия с подлежащей Десцеметовой мембраной (ДМ), после чего на подготовленное ложе трансплантируется предварительно заготовленный донорский послойный трансплантат, состоящий из слоя стромы роговицы, ДМ и эндотелиальных клеток. Толщина заднего послойного трансплантата в среднем составляет 120 мкм. Данная технология имеет массу преимуществ в сравнении со сквозной кератопластикой, одним из основных является исключение необходимости проведения операции по типу «открытого неба», когда глазное яблоко реципиента полностью разгерметизировано. Соответственно, минимизируется вероятность сопряженных с этим операционных осложнений. Также при ЗПК трансплантируется меньшее количество донорской ткани, что, в свою очередь, снижает риск развития реакции отторжения.

Дальнейшие разработки метода ЗПК привели к ее усовершенствованию и созданию метода эндотелиальной кератопластики (ЭК), при которой трансплантируется изолированная ДМ с монослоем эндотелия без стромального слоя роговицы донора (ТЭДМ). Метод ТЭДМ имеет ряд существенных преимуществ в сравнении с ЗПК, а именно: трансплантируется еще меньший объем донорской ткани, получается более предсказуемый оптический результат операции по причине минимального влияния тончайшего трансплантата (порядка 20 мкм) на послеоперационную рефракцию, улучшаются оптические свойства зоны интерфейса (между подлежащей стромой реципиента и адаптированной трансплантированной ДМ донора). Несмотря на высокую технологичность и результативность метода ТЭДМ, она несет ряд специфических интра- и послеоперационных осложнений: повреждение ДМ в ходе заготовки трансплантата (при отсепаровке от стромы роговицы донора), скручивание мембраны в передней камере глаза реципиента после имплантации, возможность инверсной фиксации трансплантата (эндотелием к строме реципиента), отслойка мембраны в послеоперационном периоде.

В настоящее время наблюдается существенный дефицит донорского материала для трансплантации роговицы, поэтому является актуальным поиск тканесберегающего способа энзимного получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы человека.

В связи с вышесказанным существуют предпосылки для дальнейшего усовершенствования ЭК, при этом одним из путей является трансплантация суспензии эндотелиальных клеток непосредственно в переднюю камеру глаза реципиента.

Ближайшим аналогом предлагаемого изобретения является "‎Энзимный способ получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы человека "‎(Патент РФ на изобретение №2807085).

Способ заключается в том, что с поверхности кадаверного глаза человека полностью удаляют эпителий роговицы и из него в стерильных условиях при помощи трепана формируют корнеосклеральный диск (КСД). Затем при помощи пинцета КСД удерживают за край склерального ободка, располагают параллельно стерильной чашке Петри эндотелиальной поверхностью роговицы кверху и производят на нее инсталляцию протеолитического, коллагенолитического или рекомбинантного раствора фермента объемом 1 мл, время воздействия 3, 20, 15 мин соответственно. Затем производят атравматическую аспирацию полученного раствора, состоящего из эндотелиальных клеток роговицы и раствора фермента, после этого полученный раствор переливают в стерильную пробирку, добавляют 5 мл раствора для хранения роговицы и производят центрифугирование при 800 об/мин в течение 5 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После центрифугирования надосадочную жидкость убирают аспиратором со стерильным наконечником, к осадку добавляют 5 мл раствора для хранения роговицы и с помощью механического дозатора со стерильным наконечником производят забор полученной суспензии в пробирку, которую хранят при температуре 4 градуса Цельсия. Способ позволят получить суспензию эндотелиальных клеток из кадаверного глазного яблока человека путем инстилляции раствором фермента эндотелиальной поверхности роговицы, аспирации и центрифугирования полученного раствора. Однако, при использовании указанного способа, необходимо использовать целый корнеосклеральный диск, что в условиях дефицита донорской роговицы нецелесообразно.

Задачей изобретения является разработка тканесберегающего способа энзимного получения суспензии нативных эндотелиальных клеток из поверхности корнеосклерального ободка роговицы, оставшегося после удаления центральной зоны роговицы с целью кератопластики, что может найти применение в клинической практике для замещения дефектов эндотелиального слоя роговицы.

Технический результат достигается за счет тканесберегающего способа получения суспензии эндотелиальных клеток из донорской роговицы человека путем инстилляции раствором фермента эндотелиальной поверхности корнеосклерального ободка роговицы, оставшегося после удаления центральной зоны роговицы с целью кератопластики, аспирации и центрифугирования полученного раствора, что является доступной и легко воспроизводимой процедурой при наличии стандартного лабораторного оборудования, что упрощает возможности ее применения.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

В качестве донорского материала используют корнеосклеральный ободок корнеосклерального диска донорской роговицы человека, оставшийся после забора центральной части роговицы диаметром 8 мм с целью проведения кератопластики. Оставшийся корнеосклеральный ободокроговицы при помощи пинцета колибри удерживают за его край и отделяют десцеметову мембрану от стромы. В качестве ферментов могут быть использованы: 2,5% раствор протеолитического фермента Трипсин-Версен (ПанЭко; Россия), 0,075% раствор коллагенолитического фермента Аккутазы (Thermoscientific, США), или 0,25% раствор рекомбинантного фермента TrypLE (Invitrogen, США) время воздействия 3, 20, 15 мин соответственно. Затем производят атравматическую аспирацию полученного раствора, состоящего из эндотелиальных клеток роговицы и раствора фермента, канюлей 27G. Затем этот раствор переливают в стерильную пробирку, добавляют 5 мл раствора для хранения роговицы и производят центрифугирование при 800 об/мин в течение 5 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После центрифугирования надосадочная жидкость убирается аспиратором со стерильным наконечником. К осадку добавляют 5 мл раствора для хранения роговицы и с помощью механического дозатора со стерильным наконечником производится забор полученной суспензии в пробирку. Суспензия хранится при температуре+4 градуса Цельсия. Всего для получения 10 таких корнеосклеральных ободков используют 10 корнеосклеральных дисков роговицы человека.

Предложенный способ позволяет получить энзимную суспензию эндотелиальных клеток из корнеосклерального ободка, оставшегося после забора центральной части роговицы с целью проведения кератопластики, что может найти применение в лечении эндотелиальной недостаточности роговицы в условиях дефицита донорской роговицы.

Способ поясняется следующими клиническими примерами.

Пример 1.

Корнеосклеральный ободок роговицы человека, оставшийся после удаления центральной зоны роговицы с целью кератопластики, при помощи пинцета колибри удерживают за его край. Далее корнеосклеральный ободок располагают параллельно стерильной чашке Петри эндотелиальной поверхностью роговицы кверху. Следующим этапом произвели инстилляцию 2,5% раствора Трипсин-Версен (ПанЭко; Россия) объемом 1 мл на 3 мин на эндотелиальную поверхность роговицы. Затем произвели атравматическую аспирацию полученного раствора, состоящего из эндотелиальных клеток роговицы и раствора фермента, канюлей 27G. Затем этот раствор перелили в стерильную пробирку, добавили 5 мл раствора для хранения роговицы и произвели центрифугирование при 800 об/мин в течение 5 минут при температуре 37 градусов Цельсия. После центрифугирования надосадочную жидкость убрали аспиратором со стерильным наконечником. К осадку добавили 5 мл раствора для хранения роговицы и с помощью механического дозатора со стерильным наконечником произвели забор полученной суспензии в пробирку.

Пример 2.

Корнеосклеральный ободок роговицы человека, оставшийся после удаления центральной зоны роговицы с целью кератопластики, при помощи пинцета колибри удерживают за его край. Далее корнеосклеральный ободок располагают параллельно стерильной чашке Петри эндотелиальной поверхностью роговицы кверху. Следующим этапом произвели инстилляцию 0,075% раствора Аккутазы (Thermoscientific, США) объемом 1 мл на 20 мин на эндотелиальную поверхность роговицы. Затем произвели аналогичные действия примеру 1.

Пример 3.

Корнеосклеральный ободок роговицы человека, оставшийся после удаления центральной зоны роговицы с целью кератопластики, при помощи пинцета колибри удерживают за его край. Далее корнеосклеральный ободок располагают параллельно стерильной чашке Петри эндотелиальной поверхностью роговицы кверху. Следующим этапом произвели инстилляцию 0,25% раствора TrypLE (Invitrogen, США)объемом 1 мл на 15 мин на эндотелиальную поверхность роговицы. Затем произвели аналогичные действия примеру 1.

Настоящее изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу энзимного получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы человека из корнеосклерального ободка корнеосклерального диска донорской роговицы человека. Данный способ включает инстилляцию раствором фермента эндотелиальной поверхности корнеосклерального ободка роговицы, оставшегося после удаления центральной зоны роговицы с целью кератопластики, аспирацию и центрифугирование полученного раствора. Представленный способ эффективен для тканесберегающего получения эндотелиальных клеток роговицы человека. 3 пр.

Тканесберегающий способ энзимного получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы человека, характеризующийся тем, что на эндотелиальную поверхность донорской роговицы производят инстилляцию протеолитического, коллагенолитического или рекомбинантного раствора фермента объемом 1 мл, время воздействия 3, 20, 15 мин соответственно; производят атравматическую аспирацию полученного раствора, состоящего из эндотелиальных клеток роговицы и раствора фермента, затем полученный раствор переливают в стерильную пробирку, добавляют 5 мл раствора для хранения роговицы и производят центрифугирование при 800 об/мин в течение 5 минут при температуре 37 градусов Цельсия; после центрифугирования надосадочную жидкость убирают аспиратором со стерильным наконечником, к осадку добавляют 5 мл раствора для хранения роговицы и с помощью механического дозатора со стерильным наконечником производят забор полученной суспензии в пробирку, которую хранят при температуре 4 градуса Цельсия, отличающийся тем, что используют корнеосклеральный ободок корнеосклерального диска донорской роговицы человека, оставшийся после забора центральной части донорской роговицы с целью кератопластики.