Механический способ получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы из кадаверного глаза человека Российский патент 2023 года по МПК G01N33/50 A61F9/07 C12N5/71 

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, может найти применение в клинической практике для замещения дефектов эндотелиального слоя роговицы.

В настоящее время патология эндотелиального слоя роговицы различного генеза, включая как первичную генетически детерминированную эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса, так и вторичную буллезную кератопатию, является одной из основных и наиболее часто встречающейся патологией роговицы, требующей проведения оптической кератопластики. Единственным вариантом лечения данных пациентов до сих пор остается только выполнение трансплантации роговицы, с заменой всей роговицы или ее части на донорскую. В практике офтальмохирургов у пациентов с эндотелиальной недостаточностью роговицы по-прежнему преобладает метод сквозной кератопластики. Однако стоит также отметить, что в последние 2 десятилетия активно внедряется в клиническую практику более патогенетически обоснованная методика селективной замены эндотелия, а именно задняя послойная кератопластика (ЗГОС). В ходе ЗПК у реципиента удаляется дефектный монослой эндотелия с подлежащей Десцеметовой мембраной (ДМ), после чего на подготовленное ложе трансплантируется предварительно заготовленный донорский послойный трансплантат, состоящий из слоя стромы роговицы, ДМ и эндотелиальных клеток. Толщина заднего послойного трансплантата в среднем составляет 120 мкм. Данная технология имеет массу преимуществ в сравнении со сквозной кератопластикой, одним из основных является исключение необходимости проведения операции по типу «открытого неба», когда глазное яблоко реципиента полностью разгерметизировано. Соответственно, минимизируется вероятность сопряженных с этим операционных осложнений. Также при ЗПК трансплантируется меньшее количество донорской ткани, что, в свою очередь, снижает риск развития реакции отторжения.

Дальнейшие разработки метода ЗПК привели к ее усовершенствованию и созданию метода эндотелиальной кератопластики (ЭК), при которой трансплантируется изолированная ДМ с монослоем эндотелия без стромального слоя роговицы донора (ТЭДМ). Метод ТЭДМ имеет ряд существенных преимуществ в сравнении с ЗПК, а именно: трансплантируется еще меньший объем донорской ткани, получается более предсказуемый оптический результат операции по причине минимального влияния тончайшего трансплантата (порядка 20 мкм) на послеоперационную рефракцию, улучшаются оптические свойства зоны интерфейса (между подлежащей стромой реципиента и адаптированной трансплантированной ДМ донора). Несмотря на высокую технологичность и результативность метода ТЭДМ, она несет ряд специфических интра- и послеоперационных осложнений: повреждение ДМ в ходе заготовки трансплантата (при отсепаровке от стромы роговицы донора), скручивание мембраны в передней камере глаза реципиента после имплантации, возможность инверсной фиксации трансплантата (эндотелием к строме реципиента), отслойка мембраны в послеоперационном периоде.

В связи с вышесказанным существуют предпосылки для дальнейшего усовершенствования ЭК, при этом одним из путей является трансплантация суспензии эндотелиальных клеток непосредственно в переднюю камеру глаза реципиента.

Заявителю не известны способы получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы человека.

Задачей изобретения является разработка способа получения суспензии нативных эндотелиальных клеток из кадаверных роговиц человека.

Технический результат состоит в получении суспензии эндотелиальных клеток из кадаверного глазного яблока человека путем механического смыва эндотелиальной поверхности роговицы и центрифугирования, что является доступной и легко воспроизводимой процедурой при наличии стандартного лабораторного оборудования, что упрощает возможности ее применения.

Способ осуществляется следующим образом:

В качестве донорского материала используют кадаверное глазное яблоко человека, с поверхности которого полностью удаляют эпителий роговицы микрохирургическим скребком. Из кадаверного глаза формируют корнеосклеральный диск (КСД) или роговичный диск (РД) диаметром 8,5 мм в стерильных условиях при помощи многоразового трепана. Затем при помощи пинцета колибри КСД или РД удерживают за край склерального ободка КСД или за край РД. Далее КСД или РД наклоняют перпендикулярно к стерильной чашке Петри. Затем при помощи канюли 30 G, подсоединенной к шприцу, заполненным интактным раствором для хранения роговицы, проводят смыв с эндотелиальной поверхности КСД или РД потоком указанного выше раствора над стерильной чашкой Петри. Затем проводится забор полученного раствора из чашки Петри этим же шприцем. Далее этим раствором проводится второй смыв эндотелиальных клеток, аналогично первому. Так же, после второго смыва, проводится забор полученного раствора из чашки Петри этим же шприцем и проводится третий смыв эндотелиальных клеток, аналогичный второму смыву. Полученный раствор помещают в пробирку и проводят центрифугирование при 800 об/мин в течение 5 минут при температуре 37°С. После центрифугирования надосадочная жидкость убирается аспиратором со стерильным наконечником. К осадку добавляется раствор для хранения роговицы и с помощью механического дозатора со стерильным наконечником производится забор суспензии в пробирку. Суспензия хранится при температуре +4°С.

Пример 1

С поверхности роговицы кадаверного глазного яблока человека полностью удалили эпителий микрохирургическим скребком. Далее из кадаверного глаза человека сформировали КСД при помощи многоразового трепана. Удерживая КСД за край склерального ободка пинцетом колибри, КСД наклонили перпендикулярно к стерильной чашке Петри. Затем при помощи канюли 30 G, подсоединенной к шприцу, заполненной интактным раствором для хранения роговицы, полученный по ТУ №9398-013-29039336-2008, ООО «НЭП Микрохирургия глаза», Москва, провели смыв с эндотелиальной поверхности КСД потоком раствора над стерильной чашкой Петри, согласно изобретению. Полученный раствор поместили в пробирку и провели центрифугирование при 800 об/мин в течение 5 минут при температуре 37°С. После центрифугирования надосадочную жидкость убрали аспиратором с стерильным наконечником. К осадку добавили раствор для хранения роговицы полученный по ТУ №9398-013-29039336-2008, ООО «НЭП Микрохирургия глаза», и с помощью механического дозатора с стерильным наконечником произвели забор суспензии. Суспензия сохранили в пробирке при температуре +4°С.

Пример 2.

С поверхности роговицы кадаверного глазного яблока человека полностью удалили эпителий микрохирургическим скребком. Далее из кадаверного глаза человека сформировали РД при помощи многоразового трепана. Удерживая роговичный диск пинцетом колибри, диск наклонили перпендикулярно к стерильной чашке Петри. Затем произвели действия, аналогичные Примеру 1.

Таким образом, предложенный способ позволяет получить эндотелиальные клетки, которые могут найти применение в лечении эндотелиальной недостаточности роговицы.

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, может найти применение в клинической практике для замещения дефектов эндотелиального слоя роговицы и касается способа получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы из кадаверного глаза человека. C поверхности кадаверного глаза человека полностью удаляют эпителий роговицы микрохирургическим скребком и из него в стерильных условиях при помощи трепана формируют корнеосклеральный диск (КСД) или роговичный диск (РД). При помощи пинцета удерживают за край КСД или РД и наклоняют перпендикулярно к стерильной чашке Петри, после этого при помощи канюли 30 G, подсоединенной к шприцу, заполненному интактным раствором для хранения роговицы, проводят смыв с эндотелиальной поверхности КСД или РД потоком указанного выше раствора над стерильной чашкой Петри. Затем проводят забор полученного раствора из чашки Петри этим же шприцем. Далее этим раствором проводят второй смыв эндотелиальных клеток аналогично первому. Третий смыв эндотелиальных клеток проводят аналогично второму смыву; полученный раствор помещают в пробирку. Проводят центрифугирование при 800 об/мин в течение 5 минут при температуре 37°С. Надосадочную жидкость убирают аспиратором со стерильным наконечником, к осадку добавляют раствор для хранения роговицы и производят забор суспензии в пробирку, суспензию хранят при температуре +4°С. Изобретение обеспечивает получение суспензии эндотелиальных клеток из кадаверного глазного яблока человека доступной и легко воспроизводимой процедурой при наличии стандартного лабораторного оборудования, что упрощает возможности ее применения. 2 пр.

Способ получения суспензии эндотелиальных клеток роговицы из кадаверного глаза человека, заключающийся в том, что с поверхности кадаверного глаза человека полностью удаляют эпителий роговицы и из него в стерильных условиях при помощи трепана формируют корнеосклеральный диск (КСД) или роговичный диск (РД), при помощи пинцета удерживают за край КСД или РД и наклоняют перпендикулярно к стерильной чашке Петри, после этого при помощи канюли 30 G, подсоединенной к шприцу, заполненному интактным раствором для хранения роговицы, проводят смыв с эндотелиальной поверхности КСД или РД потоком указанного выше раствора над стерильной чашкой Петри, затем проводят забор полученного раствора из чашки Петри этим же шприцем, далее этим раствором проводят второй смыв эндотелиальных клеток аналогично первому, третий смыв эндотелиальных клеток проводят аналогично второму смыву; полученный раствор помещают в пробирку, проводят центрифугирование при 800 об/мин в течение 5 минут при температуре 37°С, надосадочную жидкость убирают аспиратором со стерильным наконечником, к осадку добавляют раствор для хранения роговицы и производят забор суспензии в пробирку, суспензию хранят при температуре +4°С.