Способ микроклонального размножения жимолости in vitro Российский патент 2023 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области сельского хозяйства и биотехнологии, и может быть использовано для микроклонального размножения жимолости (Lonicera caerulea L.) in vitro.

Жимолость (Lonicera caerulea L.) произрастает в Восточной Сибири и на Дальнем Востоке, а также в Корее и Китае. Это популярная плодово-ягодная культура с высоким содержанием биологически активных веществ в плодах. В отличие от традиционных способов размножения жимолости (черенкование и др.), размножение in vitro позволяет получить большое количество качественного посадочного материала в короткие сроки. По данным Н.А. Семеновой (2016) [Семенова Н.А. Совершенствование технологии размножения in vitro, условий адаптации и доращивания жимолости съедобной: автореф. дис. канд. с. -х. наук. - М., 2016. - 18 с], одна введенная в культуру меристема L. edulis продуцирует более тысячи растений в год, что в сотни раз больше, чем при использовании традиционных методов вегетативного размножения. При этом коэффициент размножения является одним из ключевых показателей при определении эффективности культивирования in vitro.

Известен способ микроразмножения жимолости (Lonicera caerulea L.), при котором в питательную среду с минеральной основой по Мурасиге-Скуга (МС) добавляют препарат Эпин в концентрации 0,1 мг/л либо смесь 6-бензи-ламинопурина (БАП) (1,0 мг/л) и Эпина (0,1 мг/л) [Макаров С.С, Калашникова Е.А. Влияние состава питательной среды на клональное микроразмножение жимолости съедобной // Плодоводство и ягодоводство России. - Т. XLIX. -2017. - С. 217-222].

Однако представленные методики микроразмножения показали слабую эффективность данного процесса.

Известно, что применение БАП в концентрации 1 мг/л в сочетании с комплексом витаминов (тиамин, пиридоксин, никотиновая кислота, рибофлавин, пантотенат кальция, фолиевая кислота, аскорбиновая кислота, рутин) приводило к высокому коэффициенту размножения жимолости in vitro и обеспечивало быстрый рост побегов [Макаров С.С, Калашникова Е.А. Влияние состава питательной среды на клональное микроразмножение жимолости съедобной // Плодоводство и ягодоводство России. - Т. XLIX. - 2017. - С. 217-222].

Недостаток способа - увеличение дороговизны микроклонального размножения вследствие повышения концентрации БАП и дополнительного введения комплекса дорогостоящих витаминов.

Известен способ микроклонального размножения жимолости (Lonicera caerulea L.), при котором используют среду МС с 0,5 мг/л БАП и удвоенной концентрацией хелата железа [Китапбаева А.А., Шарипханова А.С., Игисинова Ж..Т., Карменова Б.К., Кабатаева Ж..К. Введение в культуру in vitro и микроклональное размножение двух видов жимолости // Science and world. - 2017. -№9-2 (49). - С. 16-18.].

Однако при использовании данного метода отмечен невысокий коэффициент размножения - 1,4-3,0.

По мнению I. Mihaljevic и др. (Mihaljevic I., Tomas V., Vukovic D., Dugalic K. Propagation of three Blue Honeysuckle (L. caerulea) cultivars in in vitro culture // Pomologia croatica. - 2019. - Vol. 23. - P. 41-48.), использование питательной среды DKW с добавлением 4 мг/л БАП и 1 мг/л индол-3-масляной кислоты, а также DKW с 2 мг/л БАП и 0,5 мг/л индол-3-масляной кислоты для разных сортов жимолости является оптимальным способом повышения коэффициента размножения, который составил в среднем 3,0.

Данный коэффициент размножения можно считать невысоким, что свидетельствует о низкой эффективности метода на фоне удорожания питательной среды за счет применения повышенных содержаний БАП и использования ИМК.

Наиболее близким по технической сущности к предполагаемому изобретению является способ микроклонального размножения жимолости (Lonicera caerulea L.), при котором для увеличения коэффициента размножения микроклоны культивируют на питательной среде Мурасиге и Скуга с добавлением 1,0 мг/л БАП [Дунаева С.Е., Пендинен Г.И., Антонова О.Ю., Швачко Н.А., Ухватова Ю.В., Шувалова Л.Е., Волкова Н.Н., Гавриленко Т.А. Сохранение вегетативно размножаемых культур в in vitro и крио коллекциях: метод, указания. 2-е изд, расширенное и доп. - Спб., 2017. - 71 с].

Указанный способ имеет недостатки. Повышение концентрации БАП в среде до 1 мг/л ведет к удорожанию процесса и повышению себестоимости полученных растений-регенерантов. Кроме этого, здесь наблюдается невысокий коэффициент размножения растений.

Целью изобретения является увеличение коэффициента размножения жимолости и снижение себестоимости получаемых регенерантов.

Указанная цель достигается тем, что предлагаемый способ микроклонального размножения жимолости in vitro, включает культивирование микроклонов на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, 20 г/л сахарозы, 6 г/л агар-агара и 0,5 мг/л БАП. Согласно изобретения в состав питательной среды дополнительно вводят смесь деалкоголизированных экстрактов гречихи посевной (Fagopyrum esculentum) и рейнутрии японской (Reynoutria japonica) (1:1) в количестве 1-8 мл/л.

По сравнению с прототипом, признаками изобретательского уровня предлагаемого способа микроклонального размножения жимолости in vitro является:

1. «… в состав питательной среды дополнительно вводят смесь деалкоголизированных экстрактов гречихи посевной (Fagopyrum esculentum) и рейнутрии японской (Reynoutria japonica) (1: 1)...», что позволяет:

- улучшить морфобиологические показатели жимолости, культивируемой in vitro, и повысить коэффициент размножения растений;

- использовать дешевое, доступное растительное сырье F. esculentum и R. japonica, произрастающих повсеместно и дающих большую вегетативную массу, что уменьшает стоимость питательной среды и, соответственно, себестоимость получаемых микроклонов.

2. «… в количестве 1-8 мл/л», что позволяет:

- рационально и экономно использовать экстракты F. esculentum и R. japonica и избежать перерасхода препарата.

Признаки, указанные в отличительной части описания достижения цели, доказывают, что заявляемый способ микроклонального размножения жимолости in vitro обладает новизной. Совокупность признаков, приведенных в сравнении свойств заявляемого и известного решений, дает основание сделать вывод, что заявляемый способ имеет изобретательский уровень.

Техническим результатом изобретения является использование в качестве стимулятора развития микроклонов жимолости смеси деалкоголизированных экстрактов F. esculentum и R. japonica в количестве 1-8 мл/л среды, полученных из дешевого, доступного сырья.

Предлагаемый способ микроклонального размножения жимолости in vitro иллюстрируется приведенным ниже примером его осуществления.

Жидкие концентрированные экстракты гречихи посевной (Fagopyrum esculentum Moench) и рейнутрии японской (Reynoutria japonica Houtt.) получают следующим образом. Листья растений высушивают воздушно-теневым методом до уровня влажности 12%, измельчают на мельнице марки ЛЗМ для размола сухих проб до фракции 1 мм, экстракция производится С₂Н₅ОН 70% с использованием емкости с кипящей водой (t около 100°С), проводят вакуум-фильтрацию и переносят полученные извлечения в мерные колбы (100 мл). В результате получают экстракты темно-зеленого цвета с коричневатым оттенком и травяным ароматом. Готовые препараты хранят в герметически закрывающихся емкостях из темного стекла в холодильнике. Перед обработкой необходимое количество экстракта деалкоголизируют выпариванием до исчезновения запаха спирта и доводят дистиллированной водой до начального объема.

Пример. В качестве объектов исследований использовали регенеранты жимолости сорта «Подарок амурчанам». Неодревесневшие зеленые асептические одноузловые черенки жимолости длиной 15-20 мм с 1-2 междоузлиями пассировали на питательную среду с минеральной основой по Мурасиге-Скуга, содержащую 20 г/л сахарозы, 6 г/л агара, 0,5 г/л БАП и смесь деалкоголизированных экстрактов Fagopyrum esculentum и Reynoutria japonica (1:1) в количестве 1-8 мл/л по вариантам опыта (табл. 1). Контрольный вариант - прототип - способ культивирования микроклонов на питательной среде без добавления смеси экстракта. Повторность опыта - трехкратная. Изолированные in vitro объекты культивировались в пробирках с ватно-марлевыми пробками при освещенности 4 тыс. лк, температуре 22-25°С, фотопериоде 16 ч в условиях культуральной комнаты. Продолжительность пассажа составила 35 суток.

Приготовление и стерилизация бокса, посуды, инструментов проводились по общепринятым методикам.

Результаты исследований приведены в табл.2, 3, фиг 1, 2.

Как свидетельствуют полученные данные, на 14 сутки культивирования in vitro на средах с добавлением фитоэкстрактов наблюдается стимулирование роста и развития микроклонов жимолости, что выражается в превышении значений морфобиологических показателей пробирочных растений над контрольными показателями. Максимальные значения характерны для варианта со смесью экстрактов в концентрации 1 мл/л (табл. 2). Так, длина побега здесь составила 23,5 мм в среднем, что в 4,43 раза выше контрольного показателя. Аналогично, количество междоузлий, количество листьев, длина и ширина листьев больше, чем на контроле, в 2,13; 2,16; 2,54 и 2,35 раза соответственно. По количеству побегов выделился вариант 6 мл/л, где данный показатель достиг 2,2 шт.

На 35 сутки выращивания микрорастений жимолости регенерационная способность на средах с фитоэкстрактами была значительно выше, чем на контрольном варианте (табл. 3). По количеству побегов, высоте растений, количеству междоузлий, количеству листьев, длине и ширине листьев разница с контролем составила 12,5-50,0%, 23,0-53,3%, 18,2-34,5%, 29,2-42,9%, 38,0-50,4% и 35,2-51,4% соответственно. Коэффициент размножения превзошел контрольные показатели в 1,8-2,4 раза, варьируя в пределах 7,80-10,62 с максимумом в вариантах 1 и 6 мл/л.

Таким образом, способ микроклонального размножения жимолости in vitro, предусматривающего культивирование микроклонов на питательной среде с добавлением смеси деалкоголизированных экстракто гречихи посевной (Fagopyrum esculentum) и рейнутрии японской (Reynoutria japonica) (1:1) в количестве 1-8 мл/л, позволяет существенно повысить уровень регенерационной способности пробирочных растений жимолости и увеличить коэффициент размножения культуры. Использование дешевого, доступного сырья для приготовления экстракта снижает себестоимость получаемых микроклонов.

Изобретение относится к области биотехнологии, для микроклонального размножения жимолости (Lonicera caerulea L.) in vitro. Предлагаемый способ микроклонального размножения жимолости in vitro включает культивирование микроклонов на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, 20 г/л сахарозы, 6 г/л агар-агара и 0,5 мг/л БАП. Отличительной особенностью способа является то, что в состав питательной среды дополнительно вводят смесь деалкоголизированных экстрактов гречихи посевной (Fagopyrum esculentum) и рейнутрии японской (Reynoutria japonica) (1:1) в количестве 1-8 мл/л. Предлагаемое изобретение позволит увеличить коэффициент размножения жимолости. 2 ил., 3 табл.

Способ микроклонального размножения жимолости in vitro, включающий культивирование микроклонов на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, 20 г/л сахарозы, 6 г/л агар-агара и 0,5 мг/л БАП, отличающийся тем, что в состав питательной среды дополнительно вводят смесь деалкоголизированных экстрактов гречихи посевной (Fagopyrum esculentum) и рейнутрии японской (Reynoutria japonica) (1:1) в количестве 1-8 мл/л.