Способ получения новых генотипов гречихи in vitro Российский патент 2023 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к биотехнологии и селекции растений, и может быть использовано для ускорения и повышения эффективности создания новых ценных генотипов гречихи с хозяйственно значимыми признаками, а также в исследованиях по генетике и физиологии растений.

Использование биотехнологических методов в выведении сортов является эффективным инструментом получения культур с улучшенными хозяйственно-полезными признаками. Перспективное направление селекции - использование селективного фактора в клеточно-тканевой культуре in vitro. Использование в качестве селективных фонов ионов тяжелых металлов in vitro может значительно расширить генетический базис и привести к появлению ценных генотипов с новыми признаками и свойствами и высоким потенциалом устойчивости к стрессорам.

Известен способ получения селекционно-ценных сомаклонов гречихи in vitro, включающий вычленение гипокотилей недельных асептических проростков гречихи, их культивирование с получением первичной каллусной ткани, индукцию органогенеза и получение качественно нового исходного селекционного материала гречихи (патент RU 2229219, МПК А01Н 4/00, C12N 5/00, А01Н 1/04, 27.05.2004 г.).

Недостатком данного способа является его большая трудоемкость, связанная с необходимостью получения каллусной культуры и дальнейшей работы с клетками и тканями.

Известен способ увеличения изменчивости и получения ценных генотипов гречихи с использованием селективных сред с высоким содержанием сульфата меди in vitro (Барсукова Е.Н., Клыков А.Г. Селекция гречихи на стрессоустойчивость в культуре in vitro. Дальневосточный аграрный вестник. 2021. №4(60). С. 7-14).

Согласно известного способа получают исходный материал с повышенной способностью к биосинтезу рутина и соответственно, способного к адаптации в стрессовых условиях, однако данные о других хозяйственно-полезных признаках не описаны.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ получения новых генотипов гречихи с использованием селективных сред с повышенными концентрациями ионов цинка (404 мг/л соли цинка в среде) и меди (184 мг/л соли меди в среде). Полученный таким способом селекционный материал характеризуется семенной продуктивностью растения 1,9-3,2 г, а наличие генетических изменений подтверждено молекулярно-генетическим анализом (Барсукова Е.Н., Клыков А.Г., Чайкина Е.Л. Использование метода культуры ткани для создания новых форм Fagopyrum esculentum Moench. Российская сельскохозяйственная наука. 2019. №5. С. 3-6.; Барсукова Е.Н., Клыков А.Г., Фисенко П.В., Боровая С.А., Чайкина Е.Л. Использование методов биотехнологии в селекции гречихи на Дальнем Востоке. Вестник ДВО РАН. 2020. №4. С. 58-66. DOI: 10.37102/08697698.2020.212.4.010).

Однако полученный данным способом селекционный материал обладает незначительным повышением семенной продуктивности растения, отсутствует исследование важнейших хозяйственно-полезных признаков.

Цель настоящего изобретения - расширить генетическое разнообразие исходного материала для селекции гречихи за счет применения высоких концентраций ионов цинка, ускорить процесс отбора новых генотипов в культуре in vitro.

Указанная цель достигается тем, что способ получения новых генотипов гречихи in vitro, включающий культивирование микрочеренков с пазушной почкой на среде Мурасиге и Скуга (далее МС), содержащей аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый семиводный, кальций хлористый двухводный, железо сернокислое семиводное, борную кислоту, марганец сернокислый четырехводный, кобальт хлористый шестиводный, медь сернокислую пятиводную, натрий молибденовокислый двухводный, калий йодистый, тиамин хлорид, пиридоксин хлорид, гидролизат казеина, сахарозу, агар и воду, получение пробирочных растений, их черенкование и субкультивирование на среде Мурасиге и Скуга, согласно изобретения черенки культивируют на среде Мурасиге и Скуга с добавлением цинка сернокислого семиводного в количестве 1010-1313 мг/л среды в течение 30-33 дней, проводят анализ генетической изменчивости полученных линий растений-регенерантов методом ПЦР и биометрический анализ высаженных в лизиметры растений-регенерантов, отбирают линии с наибольшим уровнем генетических различий и с улучшенными показателями хозяйственно-полезных признаков.

По сравнению с прототипом признаками изобретательского уровня предлагаемого способа получения новых генотипов гречихи in vitro являются:

1 «…черенки культивируют на среде Мурасиге и Скуга с добавлением цинка сернокислого семиводного в количестве 1010-1313 мг/л среды в течение 30-33 дней», что позволяет:

- индуцировать генетическую изменчивость в растительных клетках гречихи, что выражается в улучшении хозяйственно-полезных признаков, в т.ч. в повышении семенной продуктивности растения;

2 «…проводят анализ генетической изменчивости полученных линий растений-регенерантов методом ПЦР и биометрический анализ высаженных в лизиметры растений-регенерантов, отбирают линии с наибольшим уровнем генетических различий и с улучшенными показателями хозяйственно-полезных признаков», что позволяет:

- объединить два направления исследований (молекулярно-генетическое и полевое) с целью ускорения селекционного процесса гречихи;

- круглогодично в лабораторных условиях проводить скрининг среди растений in vitro и определять растения-регенеранты, отличающиеся от генотипа исходного сорта;

- повысить эффективность селекции, снизить трудоемкость процесса за счет изучения в полевых условиях ограниченной выборки растений с подтвержденными генетическими изменениями по результатам ПЦР анализа;

- отбирать in vitro толерантные к высоким дозам цинка регенеранты, адаптивные к стрессовым факторам среды;

- в лабораторных условиях in vitro проводить целенаправленную селекцию на улучшение хозяйственно-полезных признаков, в том числе на повышенную семенную продуктивность растения.

Признаки, указанные в отличительной части описания достижения цели, доказывают, что заявляемый способ получения новых генотипов гречихи in vitro обладает новизной. Совокупность признаков, приведенных в сравнении свойств заявляемого и известного решения, дает основание сделать вывод, что заявляемый способ имеет изобретательский уровень.

Предлагаемый способ размножения гречихи in vitro осуществляется следующим образом. Готовят питательную среду согласно прописи, представленной в таблице 1.

В питательную среду МС вносят соль цинка (ZnSO₄ х 7Н₂О) в следующих количествах по вариантам опыта: 808, 909, 1010, 1111 и 1313 мг/л. Асептические одноузловые черенки гречихи сорта Изумруд культивируют в течение 30-33 суток на среде МС со стандартным содержанием (8,6 мг/л) сульфата цинка (контроль) и селективных средах с цинком по вариантам опыта. Количество пробирок по каждому варианту - 20. Выжившие генотипы микроклонируют на питательные среды МС. Продолжительность каждого пассажа - 30-33 суток.

Изолированные in vitro объекты культивируют в пробирках с ватно-марлевыми пробками при освещенности 4 тыс.лк, температуре 22-25°С, фотопериоде 16 ч в условиях культуральной комнаты. Приготовление и стерилизация бокса, посуды, инструментов проводится по общепринятым методикам.

Для подтверждения наличия генетических изменений у полученных под действием высоких концентраций цинка растений-регенерантов проводят молекулярно-генетический анализ (ISSR). Генетические различия между отдельными организмами наиболее полно представлены на уровне ДНК. С помощью современных молекулярных методов эти различия можно обнаружить и использовать для идентификации отдельных линий, сортов и видов растений. Методы, основанные на использовании ДНК-маркеров, обладают рядом преимуществ по сравнению с другими методами идентификации. Они позволяют в значительно большей степени выявить объективные различия между исследуемыми образцами и, следовательно, существенно повысить разрешающую способность анализа.

Тотальную ДНК выделяют из свежих листьев солевым методом (Aljanabi S.M., Martinez I. Universal and rapid salt-extracion of high qualiny genomic DNA for PCR-based techniques // Nucleic Acid Research. 1997. Vol. 25, N 22. P. 4692-4693. DOI: 10.1093/nar/25.22.4692.) с дополнительным шагом очистки экстракта смесью хлороформ/изоамиловый спирт (24/1). Оценку качества ДНК осуществляют методом электрофореза в 1% агарозном геле, окрашенном 1% раствором бромистого этидия с последующим облучением ультрафиолетом, в качестве стандарта используют ДНК фага λ, известной концентрации. Концентрацию ДНК определяют на флуориметре MaxLife.

ПЦР проводят в 2-3 кратной повторности с использованием четырех ISSR-праймеров (табл. 2) (Кадырова Г.Д., Кадырова Ф.З., Мартиросян Е.В., Рыжова Н.Н. Анализ геномного разнообразия образцов и сортов гречихи посевной и татарской ISSR-методом // Сельскохозяйственная биология. 2010. №5. С. 42-48.) в 10 мкл, с использованием готовой 2Х реакционной смеси Био-Мастер HS-Taq ПЦР-Color (Биолабмикс).

В реакцию используют 10-50 нг. ДНК матрицы. Амплификцию проводят по программе: начальная денатурация 95°С - 5 мин; денатурация 94°С - 45 с; отжиг праймеров 49-60°С (в зависимости от праймера) - 45 с; элонгация 72°С - 1 мин; 40 циклов в амплификаторе Т100 (Биорад). Продукты реакции разделяют методом электрофореза в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, в 0.5Х ТВЕ буфере. Визуализацию проводят облучением геля ультрафиолетом с использованием гель-документирующей системы Gel Doc XR+ (Биорад).

Для каждого праймера составляют бинарные матрицы, где наличие или отсутствие фрагмента одинаковой молекулярной массы обозначали 1 или 0 соответственно. Расчет генетических дистанций Нея (Dn) (Nei, М. 1972. Genetic distance between populations. American Naturalist 106(949): 283-292.) и построение дендрограмм методом UPGMA проводят с использованием пакетов программ POPGENE и TFPGA (Backeljau Т., L. De Bruyn, Н. De Wolfe, K. Jordaens, S. Van Dongen, and B. Winnepenninckx. Multiple UPGMA and Neighbor-joining trees and the performance of some computer packages. Molecular Biology and Evolution 1996. Vol. 13, N 2. P. 309-313. DOI: 10.1093/oxfordjournals.mol-bev.a025590.).

Генетическая дистанция (Dn) - мера генетического различия между видами, подвидами, или популяциями одного вида. Малое генетическое расстояние означает генетическое сходство, большее генетическое расстояние означает генетическое различие. Согласно полученным результатам, данные образуют два отдельных кластера (табл. 3) - 2 группы. В первую группу входят исходная форма сорта Изумруд (контроль) и регенерантные линии, полученные с помощью соли цинка в концентрациях Zn 808 - Zn 909 мг/л, во вторую группу - регенераты Zn 1010, Zn 1111 и Zn 1313. Регенерантные линии второй группы максимально дистанцируются от исходной формы - Dn 1793-2348.

На фиг.(UPGMA дендрограмма филогенетических взаимоотношений линий гречихи посевной сорт Изумруд после воздействия селективных сред с цинком) длина ветвей дерева отражает уровень отличий исследованных регенерантных линий. На дереве образовалось два кластера. В первый вошли растения регенерантных линий контрольного варианта - Изумруд in vitro (исходная форма), а также полученных на среде с более низкими концентрациями ZnSO₄ х 7Н₂О, равными 808 и 909 мг/л. Второй кластер образовали регенерантные линии, полученные с использованием высоких концентраций ZnSO₄ х 7Н₂О - 1010-1313 мг/л. Данные молекулярно-генетических исследований подтверждают, что применение селективных сред с высокими концентрациями ионов цинка приводит к индуцированию больших генетических различий по сравнению с исходным сортом и линиями, полученными на более низких концентрациях ионов цинка.

Результаты исследования биометрических показателей пробирочных растений-регенерантов гречихи, высаженных в лизиметры, показали, что регенеранты, полученные после воздействия высоких концентраций соли цинка (1010-1313 мг/л) характеризуются рядом преимуществ по сравнению с растениями из кластеризованной первой группы, в которую вошли исходная форма сорта Изумруд и линии, полученные с помощью соли цинка в более низких концентрациях Zn 808 - Zn 909 мг/л (табл. 4). Так, они более низкорослые (127,8-142,3 см, в среднем 135,4 см), разница с первой группой составила 10%. Заметные различия обнаружены по толщине 1 и 2 междоузлия: растения второй группы превзошли по данному показателю растения первой группы на 23%, что является показателем большей устойчивости к полеганию. Число боковых ветвей второго порядка у второй группы больше, чем у первой, в среднем в 3,3 раза. Отмечено также наличие боковых ветвей 3 порядка у растений 2 группы, в то время как у первой группы они отсутствуют. Соответственно, семенная продуктивность с растения у второй кластеризованной группы на 37% выше, чем у первой.

Преобладающая красно-зеленая окраска растений второй группы, в отличие от зелено-красной в первой группе, свидетельствует о повышенном содержании антоцианов, что является хорошим диагностическим показателем высокого содержания рутина в надземной массе гречихи (Клыков, А.Г., Моисеенко, Л.М., Горовой, П.Г. Биологические ресурсы видов рода Fagopyrum Mill. (Гречиха) на российском Дальнем Востоке. Владивосток. 2018. 360 с.).

Таким образом, высокие концентрации цинка сернокислого семиводного в питательной среде индуцируют генетические изменения и способствуют созданию новых генотипов гречихи с улучшенными хозяйственно-полезными признаками.

Применение предлагаемого изобретения позволит повысить и ускорить эффективность процесса селекции гречихи, начиная с культуры in vitro, расширит генетическое разнообразие гречихи за счет применения высоких концентраций ионов цинка и создания новых генотипов гречихи.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предлагаемый способ получения новых генотипов гречихи in vitro включает культивирование микрочеренков с пазушной почкой на среде Мурасига и Скуга, содержащей аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый семиводный, кальций хлористый двухводный, железо сернокислое семиводное, борную кислоту, марганец сернокислый четырехводный, кобальт хлористый шестиводный, медь сернокислую пятиводную, натрий молибденовокислый двухводный, калий йодистый, тиамин хлорид, пиридоксин хлорид, гидролизат казеина, сахарозу, агар и воду, получение пробирочных растений, их черенкование и субкультивирование на среде Мурасига и Скуга. Отличительной особенностью способа является то, что черенки культивируют на среде Мурасига и Скуга с добавлением цинка сернокислого семиводного в количестве 1010-1313 мг/л среды в течение 30-33 дней, проводят анализ генетической изменчивости полученных линий растений-регенерантов методом ПЦР и биометрический анализ высаженных в лизиметры растений-регенерантов, отбирают линии с наибольшим уровнем генетических различий и с улучшенными показателями хозяйственно-полезных признаков. Предлагаемое изобретение позволит расширить генетическое разнообразие исходного материала для селекции гречихи за счет применения высоких концентраций ионов цинка, ускорить процесс отбора новых генотипов в культуре in vitro. 1 ил., 4 табл.

Способ получения новых генотипов гречихи in vitro, включающий культивирование микрочеренков с пазушной почкой на среде Мурасиге и Скуга, содержащей аммоний азотнокислый, калий азотнокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый семиводный, кальций хлористый двухводный, железо сернокислое семиводное, борную кислоту, марганец сернокислый четырехводный, кобальт хлористый шестиводный, медь сернокислую пятиводную, натрий молибденовокислый двухводный, калий йодистый, тиамин хлорид, пиридоксин хлорид, гидролизат казеина, сахарозу, агар и воду, получение пробирочных растений, их черенкование и субкультивирование на среде Мурасиге и Скуга, отличающийся тем, что черенки культивируют на среде Мурасиге и Скуга с добавлением цинка сернокислого семиводного в количестве 1010-1313 мг/л среды в течение 30-33 дней, проводят анализ генетической изменчивости полученных линий растений-регенерантов методом ПЦР и биометрический анализ высаженных в лизиметры растений-регенерантов, отбирают линии с наибольшим уровнем генетических различий и с улучшенными показателями хозяйственно-полезных признаков.