Способ микроклонального размножения гречихи in vitro Российский патент 2022 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к области сельского хозяйства и биотехнологии, для микроклонального размножения гречихи in vitro.

Известны способы микроклонального размножения гречихи, при которых для повышения эффективности регенерации и коэффициента размножения микроклоны культивируют на средах, содержащих различные цитокинины (стимуляторы роста): 6-бензиламинопурин (6-БАП), 2-изопентениладенин (2ip), мета-тополин (ТОР), кинетин (KIN) и др. (Dobránszki J. (2009). Role of cytokinins and explant type in shoot multiplication of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) in vitro. Eur. J. Plant Sci. Biotechnol. 3 (1), 66-70; Klocová L., Gubišová M. (2008). Evaluation of different approaches to buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) micropropagation. Czech Journal of Plant Breeding 44, 66-72; Romchatngoen S., Kachonpadungkitti Y., Hisajima S. (1998). Micropropagation of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) plant in vitro. Journal of the Society of High Technology in Agriculture 10, 231-236; Neškovic V., Vinterhalter В., Miljuš-Djuki J., Ghalawenji N. (1990). Micropropagation of recessive determinate genotypes of buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench.) as an alternate approach to uniform seed production. Plant Breeding. 105, 337-340).

Недостатками этих способов являются невысокие темпы роста и развития эксплантов и коэффициента размножения, низкое качество получаемых микроклонов (появление розеток, отсутствие корней), дороговизна применяемых стимуляторов роста.

Известны способы микроклонального размножения гречихи, при которых для повышения эффективности регенерации и усиления ризогенеза в питательные среды для микроклонального размножения вносят ауксины (стимуляторы роста): β-индолилмасляную кислоту (ИМК), α-нафтилуксусную кислоту (НУК), индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) (Румянцева Н.И., Сергеева Н.В., Хакимова Л.Э. и др. Органогенез и соматический эмбриогенез в культуре двух видов гречихи. Физиология растений (1989), 36 (1), 187-194; Румянцева Н.И. Морфогенез в культуре тканей гречихи: теоретические и прикладные аспекты. Дис. … канд. биол. наук. Казань, 1990. 217 с.; Takahata Y. Plant regeneration from cultured immature inflorescence of Common Buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) and Perennial Buckwheat (F. cymosum Meisn.). Japan J. Breed. (1988), 38 (4), 409-413).

Недостатками этих способов являются дороговизна применяемых препаратов для стимуляции роста, а также низкие темпы роста и развития регенерантов и невысокий коэффициент размножения, что ведет к удлинению технологического процесса получения полноценных микроклонов.

Известен способ размножения гречихи in vitro с получением селекционно-ценных сомаклонов (патент RU 2229219, МПК А01Н 4/00, C12N 5/00, А01Н 1/04, 2002 г.), при котором культивируют каллусную ткань, проводят индукцию органогенеза и получают растения-регенеранты.

Однако данный способ не экономичен, поскольку получение каллусной ткани требует дополнительных затрат средств, реактивов и времени.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому изобретению является способ микроклонального размножения гречихи, при котором используется питательная среда с минеральной основой по Мурасиге-Скуга (далее - МС) (Murashige, Т., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tussue cultures. Physiol. Plant. (1962), 15, 473-497. DOI 10.1098/rstb.2000.0713), дополненная рекомендуемым соотношением компонентов согласно исследованиям Н.И. Румянцевой и др. (Румянцева Н.И. Морфогенез в культуре тканей гречихи: теоретические и прикладные аспекты. Дис. … канд. биол. наук. Казань, 1990. 217 с.; Румянцева Н.И., Сергеева Н.В., Хакимова Л.Э. и др. Органогенез и соматический эмбриогенез в культуре двух видов гречихи. Физиология растений (1989), 36 (1), 187-194) и использованная в работе Е.Н. Барсуковой (Барсукова Е.Н. Использование метода культуры ткани в селекции гречихи. Дисс. … канд. с.-х. наук, Благовещенск, 2000. 160 с.).

Компоненты, которые входят в состав питательной среды в данном способе микроклонального размножения, представлены в табл. 1.

Однако представленный способ имеет некоторые недостатки. Растения, культивируемые таким способом, могут отставать в росте, корнеобразование замедляется, что в совокупности снижает коэффициент размножения и возможность оптимальной приживаемости микроклонов, а также увеличивает длительность технологического процесса.

Введение в среду регуляторов роста в виде кинетинов или ауксинов увеличивает эффективность регенерации, но при этом повышается стоимость питательной среды, что приводит к возрастанию себестоимости получаемых растений-регенерантов. К тому же, для приготовления среды используют гидролизат казеина, что также ведет к дополнительным затратам.

Целью изобретения является уменьшение сроков получения нормально развитых микроклонов и снижение себестоимости получаемых регенерантов.

Указанная цель достигается тем, что в предлагаемый способ микроклонального размножения гречихи in vitro, включающий культивирование микроклонов на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, 20 г/л сахарозы и 6 г/л агар-агара, согласно изобретения в состав питательной среды дополнительно вводят деалкоголизированный экстракт Fagopyrum esculentum в количестве 1-5 мл/л.

По сравнению с прототипом, признаками изобретательского уровня предлагаемого способа микроклонального размножения гречихи in vitro является:

1. «… в состав среды дополнительно вводят деалкоголизированный экстракт Fagopyrum esculentum…», что позволяет:

- сократить срок получения нормально развитых регенерантов, увеличить морфологические показатели культивируемых in vitro растений и повысить коэффициент их размножения;

- усилить ризогенез, что значительно повысит способность микроклонов лучше приживаться и быстрее адаптироваться к новым питательным субстратам;

- не добавлять в питательную среду гидролизат казеина, что снижает себестоимость получаемых микроклонов;

- использовать дешевое, доступное растительное сырье F. esculentum, произрастающего повсеместно и дающего большую вегетативную массу, что уменьшает стоимость питательной среды и, соответственно, себестоимость получаемых микроклонов.

2. «… в количестве 1-5 мл/л среды», что позволяет:

- рационально и экономно использовать экстракт F. esculentum и избежать перерасхода препарата.

Признаки, указанные в отличительной части описания достижения цели, доказывают, что заявляемый способ микроклонального размножения гречихи in vitro обладает новизной. Совокупность признаков, приведенных в сравнении свойств заявляемого и известного решений, дает основание сделать вывод, что заявляемый способ имеет изобретательский уровень.

Техническим результатом изобретения является использование в качестве стимулятора роста микроклонов деалкоголизированного экстракта F. esculentum в количестве 1-5 мл/л среды, полученного из дешевого, доступного сырья при одновременном снижении расхода препарата.

Предлагаемый способ микроклонального размножения гречихи in vitro иллюстрируется приведенным ниже примером ее осуществления. Жидкий концентрированный экстракт гречихи посевной получают следующим образом. Листья растений высушивают воздушно-теневым методом до уровня влажности 12%, измельчают на мельнице марки ЛЗМ для размола сухих проб до фракции 1 мм, экстракция производится С₂Н₅ОН 70% (EtOH 70%) с использованием емкости с кипящей водой (t около 100°С), проводят вакуум-фильтрацию и переносят полученные извлечения в мерные колбы (100 мл). В результате получают экстракт темно-зеленого цвета с коричневатым оттенком и травяным ароматом. Готовый препарат хранят в герметически закрывающейся емкости из темного стекла в холодильнике. Перед обработкой необходимое количество экстракта деалкоголизируют выпариванием до исчезновения запаха спирта и доводят дистиллированной водой до начального объема.

Пример. В качестве объектов исследований использовали регенераты гречихи посевной двух сортов - Изумруд (индетерминантного типа) селекции ФНЦ агробиотехнологий Дальнего Востока им. А.К. Чайки, и Дикуль (детер-минантного типа) селекции ВНИИ зернобобовых культур, введенных в культуру in vitro. Асептические одноузловые черенки длиной 15-20 мм с пазушной почкой пассировали на питательную среду с минеральной основой по Мурасиге-Скуга, содержащую 20 г/л сахарозы, 6 г/л агара и деалкоголизированные экстракты F. esculentum из расчета 1 мл, 5 мл и 10 мл по вариантам опыта (табл. 2). Контрольный вариант - прототип - способ культивирования микроклонов на питательной среде без добавления экстракта. Повторность опыта - трехкратная. Изолированные in vitro объекты культивировались в пробирках с ватно-марлевыми пробками при освещенности 4 тыс. лк, температуре 22-25°С, фотопериоде 16 ч в условиях культуральной комнаты. Продолжительность пассажа составила 21 сутки.

Приготовление и стерилизация бокса, посуды, инструментов проводились по общепринятым методикам. Результаты приведены в табл. 3.

Согласно проведенным исследованиям, при использовании экстракта достигается значительный положительный эффект, заключающийся в уменьшении срока получения нормально развитых регенерантов (до 21 суток) и увеличении морфологических показателей, культивируемых in vitro растений, в том числе количества междоузлий и соответственно, коэффициента размножения микрорастений. Так, по сравнению с прототипом (контролем), высота регенерантов по вариантам возросла в 1,2-6,0 раза, количество междоузлий и листьев - в 1,2-1,8 раза, длина листовой пластинки - в 1,2-2,3 раза. Коэффициент размножения превзошел контрольные показатели в два и более раза.

В вариантах с использованием экстракта ризогенез многократно усилился, что значительно повышает способность микроклонов лучше приживаться и быстрее адаптироваться к новым питательным субстратам. Следует отметить, что увеличение концентрации экстракта в питательной среде до 10 мл/л не ведет к усилению эффективности экстракта.

Таким образом, способ микроклонального размножения гречихи in vitro, предусматривающего культивирование микроклонов на питательной среде с добавлением деалкоголизированного водного раствора EtOH 70% экстракта F. esculentum в диапазоне концентраций 1-5 мл/л среды, позволяет значительно стимулировать рост пробирочных растений гречихи, быстрее размножать посадочный материал и увеличивать коэффициент их размножения, а также способствует значительному улучшению корневой системы микрорастений, что, соответственно, увеличивает степень приживаемости микроклонов на новых питательных субстратах, в результате чего существенно увеличивается эффективность микроклонального размножения. При этом использование дешевого, доступного сырья для приготовления экстракта снижает себестоимость получаемых микроклонов.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предлагаемый способ микроклонального размножения гречихи in vitro включает культивирование микроклонов на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, 20 г/л сахарозы и 6 г/л агар-агара. Отличительной особенностью способа является то, что в состав питательной среды дополнительно вводят диалкоголизированный экстракт Fag-opyrum esculentum в количестве 1-5 мл/л. Предлагаемое изобретение позволит уменьшить сроки получения нормально развитых микроклонов и снизить себестоимость получаемых регенерантов. 3 табл.

Способ микроклонального размножения гречихи in vitro, включающий культивирование микроклонов на питательной среде, содержащей макро- и микроэлементы по прописи Мурасиге-Скуга, 20 г/л сахарозы и 6 г/л агар-агара, отличающийся тем, что в состав питательной среды дополнительно вводят диалкоголизированный экстракт Fagopyrum esculentum в количестве 1-5 мл/л.