СПОСОБ ОЦЕНКИ АНТИМИКРОБНОГО ПРОЛОНГИРОВАННОГО ДЕЙСТВИЯ ДЕЗИНФЕКТАНТОВ НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРОВ Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/02 A61L2/16 C11D3/48 

Изобретение относится к области профилактической медицины, а именно к санитарии, в частности к определению эффективности дезинфицирующих средств, применяемых для санации объектов внутрибольничной среды, и может быть использовано в качестве дополнительного метода оценки пролонгированного действия дезинфицирующего средства, что предоставляет возможность усовершенствования санитарных и противоэпидемических мероприятий.

Загрязнение абиотических поверхностей патогенными и условно-патогенными микроорганизмами представляет существенную проблему для различных областей жизнедеятельности человека. Наиболее остро проблема микробной контаминации - непреднамеренного или случайного попадания инфекционных агентов на объекты среды, стоит в медицинских организациях [Khan Н.А., Baig F.K., Mehboob R. Nosocomial infections. Epidemiology, prevention, control and surveillance. Asian Pacific J. Trop. Biomedicine. 2017. 7 (5):478-482. doi: 10.1016±j.apjtb.2017.01.019; Robakowska M., Bronk M., Tyrańska-Fobke A., Ślęzak D., Kraszewski J., Balwicki Ł. Patient safety related to microbiological contamination of the environment of a multi-profile clinical hospital. Int. J. Environ. Res. Public Health. 2021. 18(7):3844. doi: 10.3390±ijerph18073844].

Профилактика внутри больничного инфицирования, связанного с циркуляцией и персистированием возбудителей на объектах хозяйственной среды и оборудовании, осуществляется с помощью дезинфицирующих средств различной природы (спирты, фенолы, хлорсодержащие и др.). Дезинфекция не всегда успешно позволяет устранить микробное загрязнение, что, по-видимому, может быть связано с неравномерным распределением средства по поверхности, не обеспечивающим оптимальную концентрацию при его контакте с бактериальным агентом [Otter J.A., Yezli S., Salkeld J.A., French G.L. Evidence that contaminated surfaces contribute to the transmission of hospital pathogens and an overview of strategies to addess contaminated surfaces in hospital settings. Am. J. Infect. Control. 2013. 41(5):6-11. doi: 10.1016±j.ajic.2012.12.004]. Кроме того, большинство традиционных и современных дезинфектантов и биоцидных композиций действуют непосредственно в момент нанесения препарата, либо в течение очень непродолжительного времени, в связи с чем требуется частая обработка поверхности.

Перспективной стратегией для борьбы с микробной адгезией и колонизацией может быть нанесение на поверхность тонкой полимерной пленки, содержащей антибактериальные вещества. Повышение эффективности таких дезинфектантов обусловлено пролонгированием их действия, благодаря полимерной основе материала, выступающего в качестве депо биоцида и обеспечивающего его длительную сохранность на поверхности. Так, например, дезинфектанты, на основе полигексаметиленгуанидина гидрохлорид (ПГМГХ, полимерные гуанидины) имеют пролонгированный эффект на обработанных поверхностях.

Стандартная оценка антимикробной активности биоцидов в отношении различных объектов, в том числе с белковым загрязнением, проводится согласно ГОСТ Р 56990-2016 «Национальный стандарт Российской Федерации. Химические дезинфицирующие средства и антисептики. Дезинфицирующие средства», а также ГОСТ Р 58151.4-2018 «Национальный стандарт Российской Федерации. Средства дезинфицирующие». Согласно методике, тестируемая поверхность с нанесенной бактериальной суспензией помещается на дно стерильной чашки Петри для непосредственного контакта с дезинфицирующим раствором в заданной экспозиции. Смыв с тест-поверхности производится после обработки нейтрализатором. После высева на твердую питательную среду и экспозиции чашек с высевами в термостате подсчитывают количество колониеобразующих единиц (КОЕ) и оценивают эффективность дезинфектанта. Критерий эффективности - гибель не менее 99,99% клеток тест-микроорганизмов от контроля (без дезинфектанта).

Согласно Р 4.2.2643-10 «Методы лабораторных исследований и испытаний дезинфекционных средств для оценки их эффективности и безопасности» определение антибактериальной активности препарата осуществляется суспензионным методом. Результаты оценивают по наличию или отсутствию роста микроорганизмов в жидкой или на твердой питательной среде. Критерий эффективности обеззараживания - 100% гибель тест-штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий. Кроме того, одобрены методические рекомендации «Способ определения чувствительности к дезинфектантам», Н. Новгород, 2010. Согласно данным рекомендациям, на поверхность наносят бактериальную суспензию тест-штаммов, обрабатывают дезинфектантом и нейтрализатором. После высева на твердую питательную среду и подсчета КОЕ, проводят определение чувствительности микроорганизмов к дезинфицирующим средствам по следующим критериям. Штамм считают чувствительным при отсутствии роста или при росте не более 300 КОЕ/мл, что соответствует требуемой эффективности дезинфицирующего средства (гибель 99,99% микроорганизмов). При росте менее 300 КОЕ/мл штамм оценивают по степени чувствительности: 1. Полная чувствительность при отсутствии роста; 2. Неполная чувствительность - при наличии роста: 100-299 КОЕ/мл дезинфектант оказывает суббактерицидное действие; от 1 до 99 КОЕ/мл неполное бактерицидное действие. Штамм считают устойчивым к данному дезинфектанту при росте 300 КОЕ/мл и более.

Недостаток всех аналогов заключается в том, что эффективность дезинфектанта оценивается в момент обработки поверхности, сразу после его нанесения на микробную суспензию. Такая постановка не дает представления о том, будет ли сохраняться антибактериальный эффект биоцида на поверхности на протяжении длительного времени.

Технический результат, достигаемый при осуществлении заявляемого изобретения, заключается в получении комплексной оценки эффективности дезинфектанта при его использовании как для обеззараживания поверхности (немедленное действие), так и с целью профилактики загрязнения поверхности (пролонгированное действие).

Предложенный способ позволяет оценить, как немедленное, так и пролонгированное действие дезинфектанта, состоящего из полимерного и антибактериального компонентов, обеспечивающего меньшую обсемененность поверхности на протяжении всего периода обработки. Период обработки время экспозиции биоцида на поверхности - в заявляемом изобретении увеличен по сравнению с аналогами, и может составлять неделю, месяц и более. В других известных способах оценивается только эффективность биоцида на момент обработки поверхности, то есть на поверхность наносится бактериальная суспензия, затем биоцид, который действует 10 мин - 2 ч.

В заявляемом изобретении увеличение периода обработки достигается благодаря способности полимерной матрицы выступать в качестве депо антибактериального компонента, а также создавать эффект экранирования микрорельефа поверхности, локальные неровности которого могут служить местами прикрепления и сохранения микроорганизмов.

Сущность заявляемого способа оценки антимикробного действия дезинфектантов на основе полимерных композиций заключается в изменении способа тестирования дезинфектанта. Указанные изменения заключаются в следующем:

- дезинфицирующее средство наносят на тестируемую поверхность, оставляют до полного высыхания и образования пленки, и только после этого наносят бактериальную суспензию тест-микроорганизмов;

- время выдерживания дезинфицирующего средства на тестируемой поверхности может варьироваться в зависимости от целей оценки эффективности антимикробного действия, и при оценке эффективности профилактической обработки поверхности, продолжительность такого выдерживания составляет более суток, без ограничения максимальной длительности.

Осуществляют способ оценки антимикробного действия дезинфектантов на основе полимерных композиций следующим образом.

Перед осуществлением заявляемого способа культуры тест-микроорганизмов выращивают на плотной или жидкой питательной среде в течение 18-24 часов при 37°С, готовят бактериальную суспензию плотностью 10⁸ КОЕ/мл в физиологическом растворе.

Исследуемые поверхности предварительно очищают от загрязнений с помощью мыльного раствора, после чего обрабатывают 96% этанолом.

В варианте «немедленное действие» на поверхность (10×10 см²) наносят 0,9 мл раствора дезинфицирующего средства и равномерно распределяют стерильным шпателем, оставляют на 1,5 часа до полного высыхания дезинфицирующего средства. Затем, добавляют 0,1 мл бактериальной суспензии и равномерно распределяют стерильным шпателем, выдерживают необходимое время (до 2 часов).

В варианте «пролонгированное действие» на поверхность (10×10 см²) наносят 0,9 мл раствора дезинфицирующего средства и равномерно распределяют стерильным шпателем, оставляют на 1,5 часа до полного высыхания дезинфицирующего средства. Далее образцы поверхности с нанесенной пленкой дезинфектанта выдерживают заданное время (сутки-неделя-месяц). После экспозиции добавляют 0,1 мл бактериальной суспензии и равномерно распределяют стерильным шпателем, выдерживают на поверхности (до 2 часов).

Время выдерживания дезинфектанта до нанесения бактериальной суспензии можно варьировать в зависимости от цели. Если оценивают немедленную дезинфекцию - то стандартное время 5 мин - 2 ч, если профилактику, то сколь угодно долго. В описании изобретения рассмотрены периоды неделя, месяц, но на практике могут быть установлены и иные временные интервалы.

В обоих вариантах после выдержки пленки дезинфектанта с бактериальной суспензией на поверхность наносят 0,5 мл нейтрализатора для дезинфектанта, распределяют шпателем, далее собирают жидкость с поверхности стерильным тампоном и делают высев на плотную питательную среду в чашках Петри (диаметр 9 см). Параллельно контролируют контаминацию поверхности, полноту действия нейтрализатора, чистоту растворов дезинфицирующих средств и нейтрализаторов (согласно ГОСТ Р 58151.4-2018).

Чашки инкубируют при 37°С в течение 24-48 часов.

Учет результатов проводят путем подсчета количества выросших колоний на чашках Петри. Эффективность дезинфектанта оценивают по числу колониеобразующих единиц (КОЕ/100 см² поверхности: более 300 КОЕ раствор дезинфектанта не эффективен, 99-299 раствор оказывает суббактерицидное действие, 1-99 раствор оказывает неполное бактерицидное действие, нет роста - раствор эффективен, оказывает бактерицидное действие.

Изобретение поясняется следующими примерами практического применения. В примерах в качестве тест-объектов использовали культуры штаммов: Escherichia coli АТСС®25922 и Staphylococcus aureus АТСС®25923 (получены из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича (сейчас ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России, г. Москва).

Пример 1. Оценено влияние дезинфицирующей композиции, в составе которой присутствуют 5% раствор ZnSO₄ и 0,75% полиакриламид (ПАА) Праестол 2530 (изготовитель «Институт технической химии УрО РАН», Пермь), на бактерии Е. coli и S. aureus с помощью предлагаемого способа в варианте «немедленное действие» на поверхности «кафельная плитка» и «пластик». Время экспозиции 10 и 30 минут для обеих тест-поверхностей.

Культуры микроорганизмов выращивали на плотной питательной среде в течение 18-24 часов при 37°С, готовили суспензию 10⁸ КОЕ/мл в 0,9% растворе NaCl. Исследуемые поверхности предварительно очищали от загрязнений с помощью мыльного раствора, после чего обрабатывали 96% этанолом. На поверхность (10×10 см²) наносили 0,9 мл раствора дезинфицирующего средства и равномерно распределяли стерильным шпателем, оставляли на 1,5 часа до полного высыхания дезинфицирующего средства (образования пленки). Затем добавляли 0,1 мл бактериальной суспензии и равномерно распределяли стерильным шпателем. Выдерживали 10 и 30 минут, после чего приливали 0,5 мл нейтрализатора и немедленно делали высев 0,1 мл смеси (все, что собиралось стерильным тампоном) на плотную питательную среду. Чашки инкубировали при 37°С в течение 24-48 часов. Эффективность дезинфектанта оценивали по числу КОЕ/100 см²: более 300 КОЕ - дезинфектант не эффективен (штамм устойчив к данному дезинфектанту), 99-299 - раствор оказывает суббактерицидное действие, 1-99 - раствор оказывает неполное бактерицидное действие, нет роста - раствор оказывает бактерицидное действие (штамм чувствительный).

Как видно из таблицы на поверхности «кафельная плитка» ПАА-биоцид оказывает неполное и полное бактерицидное действие на клетки Е. coli через 10 и 30 минут соответственно. В отношении S. aureus раствор дезинфектанта проявил себя как неэффективный через 10 мин и оказал неполное бактерицидное действие в течение 30 минут. На поверхности «пластик» ПАА-биоцид оказывает суббактерицидное действие на клетки S. aureus через 10 и 30 минут. В отношение Е. coli раствор дезинфектанта оказывает суббактерицидное действие через 10 минут и неполное бактерицидное через 30 минут (таблица).

Пример 2. Оценено влияние композиции, в составе которой присутствуют 5% раствор ZnSO₄ и 0,75% полиакриламид (ПАА) Праестол 2530, на бактерии Е. coli и S. aureus с помощью предлагаемого способа на поверхности «кафельная плитка» и «пластик» с имитацией белкового загрязнения поверхности, для чего на поверхность одновременно с бактериальной суспензией (обозначали в таблицах как «белковое загрязнение») наносили 0,1 мл раствора бычьего альбумина в концентрации 30 мкг/мл.

На поверхности «кафельная плитка» ПАА-биоцид оказывает неполное и полное бактерицидное действие на клетки Е. coli через 10 и 30 минут соответственно. В отношении S. aureus раствор дезинфектанта оказывает суббактерицидное действие через 10 мин и неполное бактерицидное действие в течение 30 минут.На поверхности «пластик» ПАА-биоцид оказывает суббактерицидное действие на клетки S. aureus через 10 и 30 минут. В отношение Е. coli раствор дезинфектанта оказывает суббактерицидное действие через 10 минут и неполное бактерицидное через 30 минут (таблица).

Пример 3. Оценено действие дезинфектанта после 2-недельной экспозиции на поверхности «кафельная плитка» и «пластик» в отношении бактерий Е. coli и S. aureus. Оценку длительного действия биоцидных композиций осуществляли вышеописанным способом (вариант «пролонгированное действие»): после нанесения на поверхность раствора биоцида и формирования пленки, образец оставляли на 2 недели. После экспозиции проводили контаминацию поверхности бактериальной суспензией как описано выше.

На поверхности «кафельная плитка» ПАА-биоцид оказывает неполное бактерицидное действие на клетки Е. coli через 10 минут и полное бактерицидное через 30 минут. В отношении S. aureus раствор дезинфектанта проявил суббактерицидное действие через 10 минут и оказал полное бактерицидное действие в течение 30 минут (таблица). На поверхности «пластик» ПАА-биоцид оказывает суббактерицидное действие на клетки Е. coli через 10 минут и полное бактерицидное действие через 30 минут. В отношение S. aureus раствор дезинфектанта оказывает полное бактерицидное действие уже через 10 минут (таблица).

Пример 4. Оценено действие дезинфектанта после 4-недельной экспозиции на поверхности «кафельная плитка» и «пластик» в отношении Е. coli и S. aureus с помощью предлагаемого способа в варианте «пролонгированное действие».

После 4-х недель на поверхности «кафельная плитка» ПАА-биоцид оказывает полное бактерицидное действие на клетки Е. coli уже через 10 минут. В отношении S. aureus раствор дезинфектанта проявил суббактерицидное действие через 10 минут и оказал неполное бактерицидное действие в течение 30 и 60 минут. На поверхности «пластик» ПАА-биоцид оказывал неполное бактерицидное действие на клетки Е. coli через 10 минут и полное бактерицидное действие через 30 минут. В отношении S. aureus месячная пленка дезинфектанта оказалась неэффективной даже через 60 минут экспозиции с бактериями (таблица).

Таким образом, положительный эффект заявляемого способа состоит в том, что он позволяет оценить как немедленное, так и пролонгированное действие дезинфектанта, то есть определить эффективность применения средства для дезинфекции (удаление бактерий) и профилактики контаминации поверхности в течение длительного времени.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен способ оценки антимикробного действия дезинфектантов на основе полимерных композиций путем воздействия на бактериальные тест-культуры. Способ включает стадии нанесения дезинфектанта и бактериальной суспензии на тестируемую поверхность: выдерживание их на поверхности, нанесение 0,5 мл нейтрализатора для дезинфектанта, сбор жидкости с поверхности стерильным тампоном и высев на плотную питательную среду, инкубации 24-48 часов и оценки эффективности дезинфектанта. Изобретение позволяет дать комплексную оценку эффективности дезинфектанта при его использовании как для обеззараживания поверхности (немедленное действие), так и с целью профилактики загрязнения поверхности (пролонгированное действие). 4 з.п. ф-лы, 1 табл., 4 пр.

1. Способ оценки антимикробного действия дезинфектантов на основе полимерных композиций путем воздействия на бактериальные тест-культуры, при котором на тестируемую поверхность наносят дезинфектант и бактериальную суспензию, выдерживают их на поверхности, затем наносят 0,5 мл нейтрализатора для дезинфектанта, собирают жидкость с поверхности стерильным тампоном и делают высев на плотную питательную среду, инкубируют 24-48 часов, оценивают эффективность дезинфектанта,

отличающийся тем, что перед нанесением бактериальной суспензии на тестируемой поверхности сначала формируют пленку дезинфектанта, и бактериальную суспензию наносят непосредственно на пленку дезинфектанта.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что время формирования плёнки исследуемого дезинфектанта – 1,5 часа или до полного высыхания.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что бактериальную суспензию наносят на плёнку дезинфектанта сразу после формирования плёнки.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что для оценки пролонгированного действия дезинфектанта, бактериальную суспензию наносят на плёнку дезинфектанта через определённое время после формирования плёнки.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что эффективность дезинфектанта оценивают по числу колониеобразующих единиц в КОЕ/100 см² поверхности: более 300 – штамм устойчив, раствор дезинфектанта не эффективен, 99-299 – раствор оказывает суббактерицидное действие, 1-99 – раствор оказывает неполное бактерицидное действие, нет роста – раствор эффективен, оказывает бактерицидное действие.