СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ СПЕРМАТОЗОИДОВ ИЗ ТЕСТИКУЛЯРНОГО БИОПТАТА У ПАЦИЕНТОВ С ДИАГНОЗОМ НЕОБСТРУКТИВНАЯ АЗООСПЕРМИЯ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ НАЛИЧИЯ ЗРЕЛЫХ ФОРМ СПЕРМАТОГЕНЕЗА И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРИ ОПЛОДОТВОРЕНИИ В ПРОГРАММЕ ЭКО/ИКСИ В СУПРУЖЕСКИХ ПАРАХ С РАЗЛИЧНЫМИ ФОРМАМИ БЕСПЛОДИЯ Российский патент 2023 года по МПК A61B17/435 G01N33/483 

Изобретение относится к медицине и касается способа выделения сперматозоидов из тестикулярного биоптата полученных микрохирургическим способом у пациентов с диагнозом необструктивная азооспермия для диагностики наличия зрелых форм сперматогенеза и их использования при оплодотворении в программе ЭКО/ИКСИ в супружеских парах с различными формами бесплодия.

Необструктивная азооспермия является серьезным фактором в преодолении бесплодия супружеских пар. Учитывая, что спермиогенез и сперматогенез проходит в структурных единицах яичек - тестикулах, где процессы протекают в двух направлениях: от герминативного эпителия в сторону просвета канальца и периодически, многократно повторяясь на протяжении всей длины.

При определенной патологии, например гипогонадотропном гипогонадизме, сперматогенез может носить локальный характер и выяснить это можно, получив биоптат для исследования. Гистологическое заключение выносит окончательный вердикт, ориентируя в дальнейшем на шаги по лечению данного пациента. В ходе микрохирургической операции можно параллельно исследовать материал биоптата на наличие зрелых форм сперматогенеза. Предлагаемый методический подход позволяет приблизиться по информативности к результату гистологии, обрабатывая до 20-30 кусочков тестикулярного биоптата.

Основная задача в ходе операции выяснить наличие сперматогенеза, его количественные и качественные характеристики, с целью выявлению наличия сперматозоидов со зрелыми формами, пригодными к использованию в программе ЭКО/ИКСИ.

После предварительного обследования мужчины (гормональный статус, объем и плотность яичек) принимается решение об операции. При решении данного вопроса прибегают к хирургическому вмешательству с разной степенью объема.

Различают несколько способов по степени инвазивности. Первый, это пункция через кожу обоих яичек с разных полюсов иглой с вакуум аспирацией отдельных тестикул (PESA) (см. https://ncagp.ru/index.php?_t8=464).

Все полученные тестикулы механически при помощи стерильных игл препарируется и их содержимое исследуется под микроскопом, после чего составляется диагностическая карта сперматогенеза или его отсутствия для каждого яичка.

К сожалению, данный метод носит вероятностный характер и весьма приблизительно ориентирует о сперматогенезе, учитывая небольшой объем получаемого материала (0,2-0,3 см³)и введение биопсийной иглы по сути в слепую .

Второй способ, это открытая биопсия (TESE) (см. https://nova-clinic.ru/micro-tese/) с извлечением большего объема для исследования (0.5-1,0 см³ ), содержащий тестикулы в количестве от нескольких десятков до нескольких сотен.

Третий способ, это модификация второго (TESE), где используется в процессе выполнения оперативного вмешательства высоко разрешающая оптика. В данном случае это позволяет выбрать тестикулы с характеристиками соответствующими тестикулам с нормальной морфологией. Объём забранного материала такой же как и во втором способе или меньше .

Два последних способа увеличивают вероятность нахождения сперматозоидов в связи с увеличением получаемого объема биоптата, однако это замедляет процедуру анализа и в такой ситуации прибегают к механическому выдавливанию содержимого кусочков биоптата при помощи стекол.

В настоящее время хирургами андрологами используется в подавляющем случае TESE c высокоразрешающей оптикой с механическим извлечением.

К сожалению, при данном методе обработки содержимое тестикул отчасти доступно для анализа и часть материала остается вне доступа, что подтверждается в ряде случаев гистологическими исследованиями оставшегося биоптата после препарирования.

Наиболее близким аналогом является способ выделения сперматозоидов из материала аспирации и/или биопсии из придатка и/или яичка для использования в программах экстракорпорального оплодотворения и/или криоконсервации (RU2762489, опубл.: 21.12.2021), включающий отделение сперматозоидов от других клеточных элементов полученного материала путем по меньшей мере двух циклов центрифугирования с отбором для каждого последующего цикла центрифугирования полученного в результате предыдущего цикла центрифугирования супернатанта, причем центрифугирование проводят при 200-350 g в течение 1-2 мин, циклы центрифугирования супернатанта проводят до отсутствия видимого осадка.

Технической проблемой прототипа является то, что данный способ ферментативной деструкции предложен для самой тяжелой формы мужского бесплодия - необструктивная азооспермия.

Основным недостатком прототипа является лишь упоминание о ферментативной деструкции ткани без методических ссылок и уточнений. В способе по прототипу берется некий полученный объем биоптата, причем в качестве основного метода извлечения сперматозоидов описан именно механический метод выделения, который носит вероятностный характер получаемого результата, т.е. останутся не исследованы участки с возможным, локальным сперматогенезом.

Техническим результатом изобретения является уменьшение временных затрат в программе ЭКО/ИКСИ, повышение вероятности в программе ЭКО/ИКСИ нормального оплодотворения и развития эмбрионов человека до стадии бластоциста. Кроме того, способ позволяет работать со всем объемом биоптата полученным в ходе микрохирургической операции и при наличии единичных зрелых сперматозоидов получать материал для оплодотворения, что особенно ценно при локальном сперматогенезе. Также, заявленный способ более информативный и быстрый в диагностическом плане для принятия решения о фертильности супруга в программе ЭКО/ИКСИ.

Указанный технический результат достигается за счет того, что заявлен способ выделения сперматозоидов из тестикулярного биоптата у пациентов с диагнозом необструктивная азооспермия, характеризующийся ферментативной деструкцией биоптата, отличающийся тем, что накануне операции делают навеску коллагеназы VI типа (Collagen Type VI (COL6)) в концентрации 3 мг/мл из расчета объема получаемого биоптата, навеску разводят в буфере PBS непосредственно при получении биоптата в лабораторию, транспортировку осуществляют в среде Ооклин, транспортную среду отмывают физическим раствором, весь объем биоптата помещают в коническую пробирку с градуировкой в мл, замеряют полученный объем в соотношении 1:1, соединяют объем измеренного биоптата с раствором коллагеназы в буфере PBS, перемешивают и ставят на 30 минут при 37°С в инкубатор, через 30 минут пробирку встряхивают и контролируют образование гомогенной взвеси клеток в растворе; при получении гомогенной взвеси, ее сразу центрифугируют 3 минуты при 300g, удаляют супернатант, полученный осадок разводят средой Ооклин до 5 мл и тщательно перемешивают, взвесь клеток центрифугируют 3 минуты при 300g, удаляют супернатант, разводят осадок 2-3 мл среды Ооклин, перемешивают используя пипетку-дозатор с носиком на 1.0 мл, забирают аликвоту суспензии для микроскопирования зрелых форм сперматогенеза, при обнаружении сперматозоидов, проводят их фотографирование и оценку возможности использования в программе ЭКО, неподвижные сперматозоиды подвергают воздействию препарата Пентоксифилин для оценки их пригодности к использованию в программе ЭКО, подвижные сперматозоиды замораживают и/или используют в программе ЭКО/ИКСИ.

Осуществление изобретения

Сущность заявленного способа выделения сперматозоидов из тестикулярного биоптата у пациентов с диагнозом необструктивная азооспермия основана на полной ферментативной деструкцией всего биоптата.

Накануне операции делают навеску коллагеназы VI типа (Collagen Type VI (COL6)) в концентрации 3 мг/мл (из расчета объема получаемого биоптата). Навеску разводят в буфере PBS непосредственно при получении биоптата в лабораторию.

Транспортировку осуществляют в среде Ооклин. Транспортную среду отмывают физическим раствором, весь объем биоптата помещают в коническую пробирку с градуировкой в мл, замеряют полученный объем.

Затем, в соотношении 1:1 соединяют объем измеренного биоптата с раствором коллагеназы в буфере PBS, перемешивают и ставят на 30 минут при 37°С в инкубатор. Через 30 минут пробирку встряхивают и контролируют образование гомогенной взвеси клеток в растворе, при получении гомогенной взвеси, ее сразу центрифугируют 3 минуты при 300g, удаляют супернатант, полученный осадок разводят средой Ооклин до 5 мл и тщательно перемешивают (этап инактивации фермента).

Взвесь клеток центрифугируют 3 минуты при 300g, удаляют супернатант, разводят осадок 2-3 мл среды Ооклин, перемешивают используя пипетку - дозатор с носиком на 1.0 мл, забирают аликвоту суспензии для микроскопирования зрелых форм сперматогенеза, при обнаружении сперматозоидов, проводят их фотографирование и оценку возможности использования в программе ЭКО, причем неподвижные сперматозоиды подвергают воздействию препарата Пентоксифилин для оценки их пригодности к использованию в программе ЭКО, а лучшие по морфологическим признакам подвижные сперматозоиды замораживают и/или используют в программе ЭКО/ИКСИ.

Получаемые сперматозоиды из тестикулярной ткани изначально это единственный шанс иметь генетически собственного ребенка, поскольку в сданном эякуляте сперматозоиды отсутствуют полностью.

При нахождении единичных сперматозоидов в биопсийной ткани оценивается потенциал их использования. Одним из основных критериев является жизнеспособность, которая напрямую связана с подвижностью сперматозоида. Все сперматозоиды полученные после ферментации ткани неподвижны и наиболее информативным методом определения их потенциала к оплодотворению это использование Пентоксифиллина, вызывающий активацию двигательной способности у сперматозоидов. Морфологические критерии оценки применяются на следующем этапе отбора.

Критерии отбора сперматозоидов для последующего использования показаны в таблице 1 и на Фиг.1.

Таблица 1

Подвижность Морфология сперматозоида норма
1 патология головки
2 патология шейки и середины тела
3 патология хвоста
4 отсутствие акросомы
5 выявлена + +/- +/- + - отсутствует подвергнуть воздействию пентоксифилина подвергнуть воздействию пентоксифилина подвергнуть воздействию пентоксифилина подвергнуть воздействию пентоксифилина -

Таблица иллюстрирующая вероятность использования сперматозоидов из биоптата, где (+) использование в программе ЭКО/ИКСИ в лучшем случае, (+/-) - в крайнем случае, а (-) - отказ от использования.

После получения оценки (+), (+/-) или (-) по критериям принимается решение о криоконсервации сперматозоидов и / или их использованию в оплодотворении.

Отсутствие акросомы 5 - полный критерий отбраковки. Иные патологии головки 2, патологии шейки и середины тела 3 - критерий отбраковки (+/-) лишь при наличии нормальных сперматозоидов 1 или с патологией хвоста 4. Т.е. патологии 2 и 3 используют в крайнем случае, когда совсем нет нормальных 1 или с патологией только хвоста 4.

Преимущество выбора отдают подвижным нормальным сперматозоидам 1 или подвижным с патологией хвоста 4. Например, на Фиг.2 показан сперматозоид (пациент Г.) использованный для оплодотворения по критериям оценки морф. норма (+) подвижность (+).

Неподвижные сперматозоиды необходимо подвергнуть воздействию пентоксифилина для оценки их пригодности к использованию в программе ЭКО.

Способ поясняется следующим примером.

Этапы ферментативной обработки тестикулярного биоптата:

1. Накануне операции делается навеска Коллагеназы VI типа (Фиг.3, Фиг.4) в концентрации 3 мг/мл (из расчета объема получаемого биоптата).

2. Навеска разводится в буфере PBS непосредственно при получении биоптата в лабораторию.

3. Транспортировка осуществляется в стерильной пробирке со средой Ооклин.

4. Весь объем биоптата помещается в коническую пробирку с градуировкой в мл (Фиг.5). На Фиг. 6 показан кусочек тестикулярного биоптата.

5. Транспортная среда отмывается физическим раствором (см. Фиг.7, Фиг.8).

6. Замеряется полученный объем (см. Фиг.9 (А, Б, В)).

7. В соотношении 1:1 соединяют объем измеренного биоптата с раствором коллагеназы VI в буфере PBS.

8. Этапы ферментации: биоптат (Фиг.10(А)) перемешивают до видимого растворения (см. Фиг.10(Б)) и ставят на 30 минут при 37°C в инкубатор (см. Фиг.10(В)).

9. Через 30 минут пробирку встряхивают и контролируют образование гомогенной взвеси клеток в растворе (см. Фиг.11, где показана гомогенная взвесь клеток тестикулярного биоптата).

10. При получении гомогенной взвеси, ее сразу центрифугируют 3 минуты при 0,3g и осаждают в центрифуге (см. Фиг.12).

11. Удаляют супернатант.

12. Полученный осадок разводят средой Ооклин 5 мл и тщательно перемешивают (этап инактивации фермента) (см. Фиг.13, где показан разведенный осадок в среде Ооклин).

13. Взвесь клеток центрифугируют 3 минуты при 0,3g.

14. Удаляют супернатант.

15. Разводят осадок 2-3 мл среды Ооклин.

16. Перемешивают используя пипетку -дозатор с носиком на 1.0 мл (см. Фиг.14).

17. Забирают аликвоту суспензии для микроскопирования зрелых форм сперматогенеза.

18. При обнаружении сперматозоидов, проводят их фотографирование и оценку возможности использования в программе ЭКО. (см. примеры на Фиг.15, Фиг.16, Фиг.17). На Фиг.15 показан пример найденного сперматозоида (патология головки, шейки, хвоста). На Фиг.16 показан пример найденного сперматозоида (патология шейки). На Фиг. 17 показан пример найденного сперматозоида (патология шейки, хвоста).

19. Неподвижные сперматозоиды подвергают воздействию препарата Пентоксифилин для оценки их пригодности к использованию в программе ЭКО.

20. Подвижные сперматозоиды могут быть заморожены для дальнейшего использования в последующих программах ЭКО/ИКСИ.

Пример клинической практики.

Пациент Г. (34 года). Необструктивная Азооспермия, отсутствие сперматозодов при обработке биоптата механическим способом, но заявленным способом получены подвижные сперматозоиды после ферментативной деструкции ткани, которые успешно использованы при оплодотворении ооцитов супруги. Процент оплодотворения 2PN 2 PB (Фиг.18, Фиг.19, где показаны зиготы 1 сутки развития) составил 57%.

Процент выросших бластоцист (см. Фиг.20, где показаны бластоцисты 5-го дня развития) 5-го дня развития равнялся 50%, что составляет приемлемый выход для данной категории бесплодия.

Самый результативный из известных методов TESE + высокоразрешающая оптика не дает такого процента оплодотворения.

Сравнение механического и ферментативного способов выделения сперматозодов показано в таблице 2.

Таблица 2

№ Характеристики Механическая обработка Ферментная обработка Чрез кожная биопсия PESE Открытая биопсия TESE TESE+ высокоразрешающая
оптика TESE+ высокоразрешающая
оптика 1 Объем биоптата см³ 0,2-0,3 0,5 -3,0 см 0,3-2,0 см 0,3-2,0 см 2 Суммарное время обработки (операционная + лаборатория) 1 час 1 час 30 мин 1 час 40 мин до 2 часов 1 час 40 мин 3 Эффективность при локальном сперматогенезе частичная средняя выше средней полная 4 Объем исследуемого материала частичный частичный частичный полный 5 Диагностическая ценность низкая средняя выше средней высокая

Таким образом, из таблицы 1 видно, что ферментативная деструкция всего полученного объема биоптата после операции позволяет увеличить информативность, скорость, качество исследования, сократить время операции.

По результатам ферментативной деструкции можно уточнить первоначальный диагноз пациента, т.к. в работу будет объемно взят весь биоптат, что позволяет обеспечить более информативный и быстрый в диагностическом плане метод для принятия решения о фертильности супруга в программе ЭКО/ИКСИ. Время от получения биоптата до результата - от 1 часа. Количество циклов центрифугирования как минимум в 4 раза меньше, соответственно меньший расход сред и износ оборудования. Повторяемость метода стабильна и не требует специального подбора условий по сравнению с дифференциальным центрифугированием.

Сравнение традиционного механического выделения сперматозоидов и ферментативного позволяет использовать последний как более информативный для принятия решения о фертильности супруга в программе ЭКО/ИКСИ. Данное изобретение становится экономически эффективным поскольку используются дробные навески коллагеназы 4 типа непосредственно перед исследованием биоптата с максимальной активностью фермента, в противном случае активность фермента исчезает через 7 дней.

Изобретение относится к области медицины, а именно к способу выделения сперматозоидов из тестикулярного биоптата у пациентов с диагнозом необструктивная азооспермия. Способ выделения сперматозоидов из тестикулярного биоптата у пациентов с диагнозом необструктивная азооспермия, характеризующийся ферментативной деструкцией биоптата, отличается тем, что накануне операции делают навеску коллагеназы VI типа (Collagen Type VI (COL6)) в концентрации 3 мг/мл из расчета объема получаемого биоптата, навеску разводят в буфере PBS непосредственно при получении биоптата в лабораторию, транспортировку осуществляют в среде Ооклин, транспортную среду отмывают физическим раствором, весь объем биоптата помещают в коническую пробирку с градуировкой в мл, замеряют полученный объем в соотношении 1:1, соединяют объем измеренного биоптата с раствором коллагеназы в буфере PBS, перемешивают и ставят на 30 минут при 37°С в инкубатор, через 30 минут пробирку встряхивают и контролируют образование гомогенной взвеси клеток в растворе; при получении гомогенной взвеси ее сразу центрифугируют 3 минуты при 300g, удаляют супернатант, полученный осадок разводят средой Ооклин до 5 мл и тщательно перемешивают, взвесь клеток центрифугируют 3 минуты при 300g, удаляют супернатант, разводят осадок 2-3 мл среды Ооклин, перемешивают, используя пипетку-дозатор с носиком на 1.0 мл, забирают аликвоту суспензии для микроскопирования зрелых форм сперматогенеза, при обнаружении сперматозоидов проводят их фотографирование и оценку возможности использования в программе ЭКО, неподвижные сперматозоиды подвергают воздействию препарата Пентоксифилин для оценки их пригодности к использованию в программе ЭКО, подвижные сперматозоиды замораживают и/или используют в программе ЭКО/ИКСИ. Вышеуказанный способ позволяет обрабатывать биоптат во всем объеме, тем самым увеличивая скорость и качество исследования, уменьшая временные затраты в программе ЭКО/ИКСИ. 20 ил., 2 табл., 1 пр.

Способ выделения сперматозоидов из тестикулярного биоптата у пациентов с диагнозом необструктивная азооспермия, характеризующийся ферментативной деструкцией биоптата, отличающийся тем, что накануне операции делают навеску коллагеназы VI типа (Collagen Type VI (COL6)) в концентрации 3 мг/мл из расчета объема получаемого биоптата, навеску разводят в буфере PBS непосредственно при получении биоптата в лабораторию, транспортировку осуществляют в среде Ооклин, транспортную среду отмывают физическим раствором, весь объем биоптата помещают в коническую пробирку с градуировкой в мл, замеряют полученный объем в соотношении 1:1, соединяют объем измеренного биоптата с раствором коллагеназы в буфере PBS, перемешивают и ставят на 30 минут при 37°С в инкубатор, через 30 минут пробирку встряхивают и контролируют образование гомогенной взвеси клеток в растворе; при получении гомогенной взвеси ее сразу центрифугируют 3 минуты при 300g, удаляют супернатант, полученный осадок разводят средой Ооклин до 5 мл и тщательно перемешивают, взвесь клеток центрифугируют 3 минуты при 300g, удаляют супернатант, разводят осадок 2-3 мл среды Ооклин, перемешивают, используя пипетку-дозатор с носиком на 1.0 мл, забирают аликвоту суспензии для микроскопирования зрелых форм сперматогенеза, при обнаружении сперматозоидов проводят их фотографирование и оценку возможности использования в программе ЭКО, неподвижные сперматозоиды подвергают воздействию препарата Пентоксифилин для оценки их пригодности к использованию в программе ЭКО, подвижные сперматозоиды замораживают и/или используют в программе ЭКО/ИКСИ.