Способ выделения подвижных сперматозоидов из осадка эякулята при криптозооспермии для проведения процедуры оплодотворения ИКСИ при ЭКО Российский патент 2024 года по МПК G01N33/48 A01B5/00 

Изобретение относится к медицине из области экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и касается способа выделения сперматозоидов из эякулята при экстремально низких показателях спермы-криптозооспермии.

Криптозооспермия относится к тяжелой форме мужского бесплодия и характеризуется наличием единичных сперматозоидов во всем образце спермы. При данной патологии невозможно получить беременность самостоятельно в супружеской паре, но и даже в условиях специализированных отделений занимающихся вопросами ЭКО это крайне затруднительно.

Основная сложность при криптозооспермии связана с (выявлением) определением наличия зрелых форм сперматогенеза и исключением постановки диагноза азооспермия. При этом соотношение объемов единичного сперматозоида к объему эякулята в 1 мл достигает 1 : 10 000 , что затрудняет поиск половых клеток.

Изначально мужчине может ошибочно поставлен диагноз азооспермия. Для уточнения диагноза применяется центрифугирование всего полученного объема эякулята с дальнейшим микроскопированием, причем данное исследование повторяется несколько раз с различными интервалами в течение 1-2 месяцев. Исследуемый осадок содержит большое количество дебриса, в котором могут быть различные клеточные и внеклеточное компоненты, а именно: лейкоциты, эритроциты, эпителиальные клетки, бактерии, грибковое носительство, белковые гранулы, кристаллы оксалатов/уратов и т.д. Все это содержимое экранирует и не позволяет визуализировать сперматозоиды в содержимом осадка.

При этом, выделение единичных сперматозоидов из эякулята в тяжелых случаях криптозооспермии может быть крайне затруднено и представляет существенную проблему. Существующие методы обработки эякулята в данных случаях могут быть неэффективны из-за крайне малого количества сперматозоидов, часто неподвижных. При невозможности выделения сперматозоидов из эякулята пациентам может быть рекомендовано использование спермы донора или хирургическое получение сперматозоидов из придатка и/или яичка [Вспомогательные репродуктивные технологии и искусственная инсеминация. Клинические рекомендации (протокол лечения) МЗ РФ 05.03.2019 №15-4/и/2-1908].

Существуют следующие способы обработки эякулята в целях выделения из него сперматозоидов для ВРТ [Руководство ВОЗ по исследованию и обработке эякулята человека. Пятое издание. Всемирная организация здравоохранения. «Медико-генетический научный центр» РАН. Издательство «Капитал Принт», Москва, 2012].

1. Простое отмывание. Метод основан на центрифугировании эякулята в отмывочной среде. В результате осаждения эякулят отмывают от семенной плазмы, которую удаляют в виде супернатанта после центрифугирования, а все клеточные элементы (клетки эпителия и округлые клетки), неклеточные элементы (дебрис, желатиновые гранулы и т.п.), а также сперматозоиды, концентрируются в осадке. При достаточной концентрации сперматозоидов в сперме их выделение методом простого отмывания не представляет сложности и является рутинным методом. Однако в случаях тяжелой олигозооспермии или криптозооспермии единичные сперматозоиды могут залипать и теряться в объеме полученного осадка, а их последующий отбор для ВРТ может быть крайне затруднен или невозможен.

2. Прямой метод swim-up. Метод основан на способности сперматозоидов выплывать из семенной жидкости в отмывочную среду. Прямой метод swim-up может быть выполнен либо наслаиванием культуральной (отмывочной) среды на разжиженный эякулят, либо подслаиванием спермы под культуральную среду. Затем подвижные сперматозоиды перемещаются в культуральную среду. Эта процедура дает более низкое количество сперматозоидов, чем отмывание, но помогает отобрать их по подвижности. Метод применим к сперме с относительно нормальными характеристиками концентрации и подвижности сперматозоидов. В случаях выраженной олигозооспермии и криптозооспермии прямой метод swim-up неэффективен.

3. Отмывание в градиенте плотностей. При выполнении этого метода используют центрифугирование спермы в градиенте плотностей, содержащем коллоидные шарики, покрытые силаном, которые разделяют клетки по их плотности. Кроме того, подвижные сперматозоиды активно проникают через градиент и формируют небольшой осадок на дне пробирки. Полученный в результате центрифугирования в градиенте плотностей супернатант (надосадочную жидкость) удаляют, а из образовавшегося под коллоидным слоем осадка отбирают сперматозоиды, которые могут быть использованы при оплодотворении ооцитов или криоконсервированы. Метод не применим к выделению из спермы единичных сперматозоидов в случаях тяжелой олигозооспермии или криптозооспермии.

Таким образом, выбор способа выделения сперматозоидов из эякулята и его эффективность напрямую зависят от исходных параметров эякулята.

Известен способ удаления вируса иммунодефицита человека из спермы мужчины по патенту RU2526494 [МПК C12N 7/00, опубл. 20.08.2014 г.]. Способ предусматривает отделение подвижных сперматозоидов от спермоплазмы и сопутствующих клеток путем центрифугирования и последующей инкубации в специальных средах. Согласно изобретению сперму центрифигируют в градиенте плотности (Sil-Select Plus) при 300 g в растворах в течение 20 минут, затем удаляют супернатант. Осадок, содержащий сперматозоиды, аспирируют пипеткой, добавляют среду для промывки спермы FertiCult Flushing medium и центрифугируют при 300 g 10 минут, после чего удаляют супернатант до осадка. Далее осадок, содержащий сперматозоиды покрывают 2 мл среды FertiCult Flushing medium, пробирку помещают в инкубатор на 80-90 минут, наиболее подвижные сперматозоиды передвигаются в среду, их аспирируют в объеме 0,7 мл.

Данный способ применим к обработке спермы и выделению из нее сперматозоидов отмытых от вируса и включает в себя комбинацию общепринятых методов обработки спермы: центрифугирование в градиенте плотности и простую отмывку с последующим самостоятельным всплытием подвижных сперматозоидов из осадка. Способ используется при обработке спермы с относительно нормальными характеристиками: в которой содержатся подвижные сперматозоиды, способные к самостоятельному всплытию в достаточном для их выделения количестве. Способ не применим к сперме со сниженными показателями концентрации и подвижности.

Известен способ подготовки спермы для внутриматочной инсеминации [RU2317072 МПК А61К 31/02, А61Р 15/08, опубл. 20.02.2008 г.] путем забора спермы, добавления физиологического раствора и двухкратного центрифугирования по 10 минут при 1500 оборотах в минуту. После центрифугирования в полученную массу сперматозоидов вводят перфторан в соотношение 1:3, выдерживают в течение 3-5 минут, проводят процедуру инсеминации. В указанном способе использован метод простой отмывки спермы с последующим самостоятельным всплытием подвижных сперматозоидов из осадка.

Способ применим к обработке спермы с относительно нормальными характеристиками: в которой содержатся подвижные сперматозоиды, способные к самостоятельному всплытию в достаточном для их выделения количестве. Способ не применим к сперме со сниженными показателями концентрации и подвижности.

Наиболее близким аналогом является способ выделения сперматозоидов из эякулята при нарушении сперматогенеза для использования в программах экстракорпорального оплодотворения и/или криоконсервации (RU2770818, опубликовано: 22.04.2022), включающий отделение сперматозоидов от других элементов эякулята путем, по меньшей мере, двух циклов центрифугирования, с отбором для каждого последующего цикла центрифугирования полученного в результате предыдущего цикла центрифугирования супернатанта, причем центрифугирование проводят при 200-350 g в течение 1-2 минут, циклы центрифугирования супернатанта проводят до отсутствия видимого осадка.

В способе центрифугирование проводят при 300 g в течение 1 минуты при объеме материала 8-12 мл. Количество последовательных циклов центрифугирования составляет от 3 до 8. При каждом последующем цикле центрифугирования увеличивают относительно первого и/или предыдущего цикла центробежную силу в пределах 200-350 g и/или время в пределах 1-2 минут. Эякулят предварительно обрабатывают методом простого отмывания в течение 1-3 последовательных циклов центрифугирования при 300-600 g в течение 5-10 минут. Супернатант, отобранный после последнего цикла центрифугирования, концентрируют путем центрифугирования при 250-600 g в течение 5-15 минут.

Способ по прототипу позволяет проводить выделение только подвижных сперматозоидов, без оценки на предмет их качества. В прототипе нет возможности получить аликвоту незагрязнённых, свободных от дебриса сперматозоидов. Прототип не обеспечивает предотвращение засорения микроинструмента (очень важно при оплодотворении), а также не снижает риски бактериального заноса в культуру эмбрионов человека (разделение сперматозоидов и дебриса).

Прототип требует дорогостоящего оснащения лаборатории ЭКО, требует в итоге много времени на проведение процедуры оплодотворения ИКСИ, за счет временных затрат на поиск сперматозоидов.

Техническим результатом заявленного изобретения являются:

- возможность уточнить диагноз по спермограмме,

- определить возможность извлечения сперматозоидов с разной степенью подвижности для оплодотворения в программе ЭКО/ИКСИ.

- получить аликвоту незагрязнённых, свободных от дебриса сперматозоидов,

- предотвращает засорение микроинструмента,

- снижает вероятность бактериального заноса в культуру эмбрионов человека,

- возможность провести криоконсервацию минимально необходимого количества сперматозоидов для последующих программ ЭКО/ИКСИ,

- возможность избежать оперативного вмешательства для мужчины на яичках при изначальном диагнозе азооспермия, в случае выделения единичных сперматозоидов согласно заявленного способа,

- не требуется дорогостоящего оснащения лаборатории ЭКО,

- экономия времени на проведение процедуры оплодотворения ИКСИ,

- обеспечивается возможность комбинировать чашку для оплодотворения ИКСИ с заявленным способом выделения сперматозоидов, что повышает удобство при оплодотворении.

Указанный технический результат достигается за счет того, что заявлен способ выделения подвижных сперматозоидов из осадка эякулята при криптозооспермии для проведения процедуры оплодотворения ИКСИ при ЭКО, характеризующийся отделением сперматозоидов от других элементов эякулята путем двух циклов центрифугирования, с отбором для каждого последующего цикла центрифугирования полученного в результате предыдущего цикла центрифугирования супернатанта, отличающийся тем, что обработку эякулята осуществляют следующими этапами:

- сданный образец разжижают 20-30 минут при комнатной температуре,

- весь объем эякулята помещают в пробирку с коническим дном и смешивают с культуральной средой Ооклин в соотношении 1:3,

- затем смесь центрифугируют 10 минут при 300 g,

- далее удаляют супернатант,

- полученный осадок ресуспендируют средой Ооклин до 3 мл,

- после чего добавляют к суспензии 30 мкл Пентоксифиллина,

- затем смесь центрифугируют повторно 3 минуты при 300 g,

- далее снова удаляют супернатант,

- формируют в чашке Петри из питательной среды каплю под слоем минерального масла при температуре 37°С на 10-20 минут, причем из капли формируют каналы, направленные от центра на периферию,

- полученный осадок помещают в центральную часть капли,

- в сформированных тонких слоях каналов питательной среды визуализируют подвижные сперматозоиды не загрязненные дебрисом,

- полученные сперматозоиды анализируют по морфологии на возможность оплодотворения,

- осуществляют отлов пригодных к оплодотворению сперматозоидов иглой и далее используют для проведения процедуры ИКСИ.

Предпочтительно, в качестве минерального масла используют парафиновое масло.

Краткое описание чертежей

На Фиг.1 показан собранный эякулят.

На Фиг.2 показана пробирка с коническим дном, куда перемещен собранный эякулят.

На Фиг.3 показан пример центрифуги.

На Фиг.4 показан отобранный осадок.

На Фиг.5 показаны этапы создания капли (А - изначальная капля питательной среды, Б - сформированные от центральной части капли каналы, ориентированные на периферию).

На Фиг.6 показано под увеличением как полученный осадок помещен в центральную часть капли.

На Фиг.7 показан вид капли с тонкослойными лучами под бинокуляром, где стрелками показан направление выхода сперматозоидов в тонкослойное пространство из осадка.

На Фиг.8 показаны выявленные два сперматозоида среди множества эритроцитов.

На Фиг.9 показан участок чашки Петри под увеличением, где сперматозоиды сконцентрированные вдоль границы масло-среда тонкослойного канала.

На Фиг.10 показаны выбранные сперматозоиды перед процедурой ИКСИ (указаны стрелками).

На Фиг.11 показан пример отлова сперматозоидов в тонкослойной среде иглой в чашке для проведения процедуры ИКСИ.

На Фиг.12 показана концевая часть тонкослойного канала (А - среда, Б - парфиновое масло).

На Фиг.13 показана комбинированная чашка Петри на 60 мм с тонкослойной каплей (А) и каплями для ИКСИ (Б).

Осуществление изобретения

Сущностью заявленного изобретения является создание в чашке Петри капли со средой под парафиновым маслом в виде тонкослойных каналов, создающей свободный проход подвижным сперматозоидам и экранирующей попадание дебриса к местам сбора/отлова сперматозоидов. Эффект создается за счет прохождения сперматозоидами малой высоты тонких слоев среды, чуть больше самих спермиев.

Способ может быть реализован следующим примером.

Обработка эякулята для выделения подвижных сперматозоидов в тонкослойных средах осуществляется следующими этапами.

1) Сданный образец разжижается 20-30 минут при комнатной температуре.

2) Весь объем эякулята помещается в пробирку с коническим дном и смешивается с культуральной средой Ооклин в соотношении 1:3 (см.примеры на Фиг.1-Фиг.2).

3) Смесь центрифугируется 10 минут при 300 G (Фиг.3).

4) Удалятся супернатант.

5) Полученный осадок (Фиг.4) ресуспендируется средой Ооклин до 3 мл.

6) Добавляют к суспензии 30 мкл Пентоксифиллина для активации движения сперматозоидов.

7) Смесь центрифугируется повторно 3 минуты при 300 G.

8) Снова удаляется супернатант.

9) Формируют в чашке Петри из питательной среды каплю под слоем минерального масла при температуре 37°С на 10-20 минут (см. Фиг.5(А, Б)), причем из капли формируют каналы, направленные от центра на периферию, а полученный осадок (Фиг.4) помещают в центральную часть капли (см. пример на Фиг.6),

10) Под бинокуляром (см. Фиг.7) видно (показано стрелками), что направление выхода сперматозоидов идет в тонкослойное пространство из осадка.

Таким образом, удается в сформированных тонких слоях среды визуализировать подвижные сперматозоиды без загрязнения дебрисом (Фиг.8).

11) Полученные сперматозоиды анализируются по морфологии на возможность оплодотворения (Фиг.9, Фиг.10).

12) Осуществляют отлов пригодных к оплодотворению сперматозоидов иглой и далее используют сразу для проведения процедуры ИКСИ (см. Фиг.11) или для последующей криоконсервации под программу ЭКО.

Таким способом удается получить аликвоту незагрязнённых, свободных от дебриса сперматозоидов, поскольку среда А (Фиг.12) под парафиновым маслом Б (Фиг.12) формирует четкую границу между средами, что видно под увеличением концевой части тонкостенного канала (Фиг.12). Также, указанная граница между средами снижает вероятность бактериального заноса в культуру эмбрионов человека (разделение сперматозоидов и дебриса) и предотвращает засорение микроинструмента, что очень важно при оплодотворении. На Фиг.11 видно, что забор сперматозоидов происходит только внутри питательной среды.

Клинический пример применения способа.

Пациент С. 34-х лет, предварительный диагноз: азооспермия. После разжижения эякулята при микроскопировании, сперматозоиды не найдены. Центрифугирование с осаждением дало значительный осадок дебриса, в котором не были найдены сперматозоиды. Однако, при использовании выборки сперматозоидов в капле с тонкослойными каналами питательной среды согласно заявленного способа позволило через 20 минут визуализировать 12 подвижных сперматозоидов в концевых участках, что позволило снять диагноз азооспермия и поменять на криптозооспермия. В дальнейшем пациент был включен в программу ЭКО/ИКСИ с супругой без применения донорской спермы, а также избежал оперативного вмешательства на яичках.

Пример показывает, что удается провести криоконсервацию минимально необходимого количества сперматозоидов для последующих программ ЭКО/ИКСИ, избежать оперативного вмешательства для мужчины на яичках при изначальном диагнозе азооспермия, в случае выделения единичных сперматозоидов.

Заявленный способ не требует дорогостоящего оснащения лаборатории ЭКО, т.к. используются стандартные чашки Петри d=60 мм.

Способ позволяет экономить время на проведение процедуры оплодотворения ИКСИ, за счет сокращения времени поиска сперматозоидов.

Кроме того, обеспечивается возможность комбинировать чашку для оплодотворения ИКСИ с заявленным способом выделения (Фиг.13), что повышает удобство при оплодотворении.

Изобретение относится к медицине из области экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) и касается способа выделения сперматозоидов из эякулята при криптозооспермии для проведения процедуры оплодотворения ИКСИ при ЭКО. Отделяют сперматозоиды от других элементов эякулята путем двух циклов центрифугирования с отбором для каждого последующего цикла центрифугирования, полученного в результате предыдущего цикла центрифугирования супернатанта. Обработку эякулята осуществляют следующими этапами: сданный образец разжижают 20-30 минут при комнатной температуре; весь объем эякулята помещают в пробирку с коническим дном и смешивают с культуральной средой Ооклин в соотношении 1:3; затем смесь центрифугируют 10 минут при 300g; удаляют супернатант; полученный осадок ресуспендируют средой Ооклин до 3 мл; после чего добавляют к суспензии 30 мкл Пентоксифиллина; затем смесь центрифугируют повторно 3 минуты при 300g; далее снова удаляют супернатант; формируют в чашке Петри из питательной среды каплю под слоем минерального масла при температуре 37°С на 10-20 минут, причем из капли формируют каналы, направленные от центра на периферию; полученный осадок помещают в центральную часть капли; в сформированных тонких слоях каналов питательной среды визуализируют подвижные сперматозоиды не загрязненные дебрисом; полученные сперматозоиды анализируют по морфологии на возможность оплодотворения; осуществляют отлов пригодных к оплодотворению сперматозоидов иглой и далее используют для проведения процедуры ИКСИ. Изобретение обеспечивает: возможность уточнить диагноз по спермограмме; определить возможность извлечения сперматозоидов с разной степенью подвижности для оплодотворения в программе ЭКО/ИКСИ; получить аликвоту незагрязнённых, свободных от дебриса сперматозоидов; предотвращает засорение микроинструмента; снижает вероятность бактериального заноса в культуру эмбрионов человека; возможность провести криоконсервацию минимально необходимого количества сперматозоидов для последующих программ ЭКО/ИКСИ, возможность избежать оперативного вмешательства для мужчины на яичках при изначальном диагнозе азооспермия, в случае выделения единичных сперматозоидов согласно заявленному способу; не требуется дорогостоящего оснащения лаборатории ЭКО; экономия времени на проведение процедуры оплодотворения ИКСИ; обеспечивается возможность комбинировать чашку для оплодотворения ИКСИ с заявленным способом выделения сперматозоидов, что повышает удобство при оплодотворении. 1 з.п. ф-лы, 13 ил., 1 пр.

1. Способ выделения подвижных сперматозоидов из осадка эякулята при криптозооспермии для проведения процедуры оплодотворения ИКСИ при ЭКО, характеризующийся отделением сперматозоидов от других элементов эякулята путем двух циклов центрифугирования с отбором для каждого последующего цикла центрифугирования полученного в результате предыдущего цикла центрифугирования супернатанта, отличающийся тем, что обработку эякулята осуществляют следующими этапами:

- сданный образец разжижают 20-30 минут при комнатной температуре,

- весь объем эякулята помещают в пробирку с коническим дном и смешивают с культуральной средой Ооклин в соотношении 1:3,

- затем смесь центрифугируют 10 минут при 300g,

- далее удаляют супернатант,

- полученный осадок ресуспендируют средой Ооклин до 3 мл,

- после чего добавляют к суспензии 30 мкл Пентоксифиллина,

- затем смесь центрифугируют повторно 3 минуты при 300g,

- далее снова удаляют супернатант,

- формируют в чашке Петри из питательной среды каплю под слоем минерального масла при температуре 37°С на 10-20 минут, причем из капли формируют каналы, направленные от центра на периферию,

- полученный осадок помещают в центральную часть капли,

- в сформированных тонких слоях каналов питательной среды визуализируют подвижные сперматозоиды не загрязненные дебрисом,

- полученные сперматозоиды анализируют по морфологии на возможность оплодотворения,

- осуществляют отлов пригодных к оплодотворению сперматозоидов иглой и далее используют для проведения процедуры ИКСИ.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве минерального масла используют парафиновое масло.