Способ прогнозирования присутствия сперматозоидов в ткани яичек человека при биопсии у пациентов с азооспермией с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния семенной плазмы Российский патент 2024 года по МПК G01N33/487 G01N21/65 C12N5/76 G01N1/40 

Азооспермия, или отсутствие сперматозоидов в эякуляте у мужчин, является крайне серьезным заболеванием, которое препятствует наступлению беременности у женщины и является причиной бесплодного брака. При азоооспермии необходимо понимать, вызвано ли отсутствие сперматозоидов в эякуляте обструкцией (непроходимостью) семенных канальцев или остановкой сперматогенеза в ткани яичка, поскольку в последнем случае сперматозоиды не вырабатываются организмом мужчины и стать отцом генетически своего ребенка в программах лечения бесплодия методами ВРТ невозможно. При этом у пациентов с необструктивной азооспермией может быть шанс стать биологическим отцом при наличии очагового сперматогенеза в яичках с помощью современной хирургии - извлечение ткани яичка и поиск в ней мужских половых клеток, пригодных для оплодотворения [Гамидов и др., 2018]. Именно поэтому говорят о том, что эффективная диагностика азооспермии является важным первым шагом на пути к успешному лечению.

Несмотря на все технические достижения, такие как использование процедур микродиссекционной тестикулярной экстракции сперматозоидов (microTESE), и попытки отбора перспективных пациентов на основе клинических и лабораторных данных, частота успешного извлечения сперматозоидов у пациентов с необструктивной азооспермией остается относительно низкой. Это означает, что некоторые пациенты проходят дорогостоящую инвазивную процедуру без каких-либо гарантий [Бржозовский и др., 2021; Гамидов и др., 2023]. Кроме того, иногда бывает трудно идентифицировать пациентов, у которых повторная биопсия яичек может оказаться успешной или которым может быть показана адъювантная фармакологическая стимуляция сперматогенеза, поскольку даже результаты гистологического исследования ткани яичек имеют довольно низкую прогностическую ценность с точки зрения выявления пациентов с очаговым сперматогенезом. Наконец, психологические последствия неудачных попыток хирургической экстракции сперматозоидов могут быть разрушительными в некоторых случаях, поскольку некоторые пары после получения отрицательных результатов биопсии могут считать, что им изначально дали ложную надежду. Таким образом, неинвазивный тест для выявления мужчин с азооспермией с остаточным очаговым сперматогенезом может улучшить отбор пациентов для процедуры microTESE и стать полезным при консультировании пациентов.

Семенная плазма - жидкий неклеточный компонент спермы, состоящий из секрета клеток яичек, придатков яичек, предстательной железы, семенных пузырьков, бульбоуретральных и периуретральных желез. Яички вместе с придатками продуцируют около 2-5% семенной плазмы, 30% вырабатывается в предстательной железе, 65-75% вырабатывается в семенных пузырьках и 1% - в бульбоуретральных и периуретральных железах [Ješeta et al., 2023]. Семенная плазма выделяется при эякуляции у мужчин как с обструктивной, так и необструктивной азооспермией, именно поэтому может рассматриваться как биологическая жидкость, пригодная для диагностики наличия сперматозоидов в ткани яичка [Li et al., 2023].

Состав семенной плазмы включает органические соединения (белки, углеводы, липиды, клеточную ДНК и РНК, в том числе малые рекодирующие РНК, пивиРНК и др.) и неорганические ионы (например, кальций, магний, калий, натрий и цинк). Особенно обогащена семенная плазма белками, РНК и липидами, которые либо растворены в семенной плазме, либо инкапсулированы во внеклеточные везикулы [Candenas et al., 2020].

Семенная плазма богата внеклеточными везикулами (ВВ) различного происхождения. ВВ придатка яичка называются эпидидимосомы, а ВВ, высвобождаемые из клеток предстательной железы - простасомы. Также в семенной плазме могут быть обнаружены везикулы, высвобождаемые клетками яичка (клетками Сертоли и сперматогониальными стволовыми

клетками) и интерстициального пространства яичка (клетками Лейдига, эндотелиальными клетками сосудов яичка). ВВ семенной плазмы могут защищать сперматозоиды, влиять на их подвижность и морфологические характеристики, а также регулировать капацитацию и акросомную реакцию. Например, эпидидимосомы содержат ряд молекул, которые могут влиять на созревание сперматозоидов (CD52, GliPr1L1, MIF, P25b, P34h ATP2B4, SPAM1, AKR1B1, SLC27A2, EDDM3B, KRT19 и WFDC8), защищать их от окислительного стресса (ELSPBP1, BLVRA, GPX5 и глутатион-S-трансфераза), влиять на морфологию и подвижность сперматозоидов (ADAM7, ATP2B4). Также одним из компонентов груза эпидидимосом являются малые некодирующие РНК, которые могут модулировать экспрессию генов в сперматозоидах. Похожий эффект на сперматозоиды оказывают простасомы. Некоторые компоненты простасом могут усиливать подвижность сперматозоидов (рецепторы прогестерона, аминопептидаза N), предотвращать преждевременную капацитацию и акросомную реакцию (холестерин) и участвовать в последующей индукции капацитации (цАМФ, рецепторы прогестерона, гидролазы и липоксигеназы), защищать сперматозоиды от окислительного стресса (NOSs и ATP2B4), а также от агрессивной кислой среды влагалища и иммунного ответа женского репродуктивного тракта (PH, LGALS3 и CD48) [Ma et al., 2023].

У мужчин с необструктивной азооспермией, когда сперматозоидов в ткани яичка нет, молекулярный состав внеклеточных везикул, выделяемых железами вспомогательной репродукции, значимо отличается от пациентов с нормальным сперматогенезом.

В последнее время предпринимаются попытки диагностики азооспермии по семенной плазме с помощью омиксных технологий. Например, Бржозовский с коллегами [2021] говорят о протеомном анализе семенной плазмы как эффективном инструменте диагностики состояний мужского бесплодия. С помощью методов протеомики и последующего контролируемого многофакторного анализа OPLS-DA с использованием программного обеспечения SIMCA авторам удалось обнаружить в семенной плазме мужчин с азооспермией несколько белков-кандидатов, которые прогнозируют очаговый сперматогенез в ткани яичек. Главным недостатком предложенного авторами метода является его дороговизна и большие затраты по времени, чтоб делает рутинное применение разработанного метода неэффективным.

Другим подходом к прогнозированию очагового сперматогенеза является количественный кариологический анализ эякулята (ККА НПК), разработанный профессором Курило Л.Ф. [Сорокина и др., 2019; Курило, 2008]. Для проведения ККА НПК используют предварительно обработанные, фиксированные и окрашенные клетки из осадка эякулята. Подсчитывают ядра незрелых половых клеток на разных стадиях сперматогенеза и вычисляют долю клеток каждой стадии. Главным преимуществом метода ККА НПК является оценка клеточного состава осадка семенной плазмы и возможность прогнозировать остановку сперматогенеза на определенной стадии. Недостатком ККА НПК служит субъективность исследования (используемые красители и профессиональные навыки оператора) и сложная пробоподготовка. Также, в случае обструкции семявыносящих канальцев, клеточный состав может недостаточно точно интерпретировать наличие сперматозоидов в ткани яичек, поэтому следует с осторожностью интерпретировать результаты ККА НПК. При обструктивной азооспермии более точным методом диагностики является оценка малых некодирующих РНК в семенной плазме, поскольку внеклеточные везикулы обладают малым размером и могут проходить в семенную плазму сквозь обструкцию [Barcelo et al., 2018]. Технология, предложенная Barcelo с коллегами, является прогностически точной, однако требует сложного этапа пробоподготовки - ультрацентрифугирования в течение нескольких часов, что делает применение метода недостаточно эффективным.

В современном мире наиболее перспективными оказываются междисциплинарные подходы, когда в область клинической медицины приходят методы из физики, оптики и инженерии. Одной из таких технологий является спектроскопия комбинационного рассеивания, или рамановская спектроскопия. Достижения в методах спектроскопии обещают улучшить диагностику заболеваний. В частности, рамановская спектроскопия стала ценным инструментом для характеристики биомолекул на основе состава их химических связей и молекулярных структур. Используя чувствительность рамановской спектроскопии к структурам молекулярных связей, можно получить исчерпывающую информацию о сложных заболеваниях. Предыдущие исследования продемонстрировали потенциал рамановской спектроскопии в идентификации как полного, так и неполного сперматогенеза в семенных канальцах на моделях крыс, состоящих только из клеток Сертоли [Osterberg et al., 2014], а также при сканировании яичек человека [Liu et al., 2014].

В 2023 году китайскими учеными был предложен усовершенствованный метод оценки присутствия сперматозоидов в семенных канальцах с помощью применения искусственного интеллекта [Huang et al., 2023]. Авторы используют стимулированное комбинационное рассеяние и визуализацию с генерацией второй гармоники (SRASH), которая дает многомерную молекулярную и структурную информацию о тканях семенных канальцев. Платформа SRASH использует визуализацию стимулированного комбинационного рассеяния для обеспечения быстрой визуализации липидов и общих белков без использования меток, а также для отслеживания коллагеновых волокон. Этот метод использует внутренние сигналы от неповрежденных и неокрашенных срезов ткани, устраняя необходимость трудоемкой предварительной обработки образцов перед визуализацией. Несмотря на очень высокую точность прогнозирования присутствия сперматозоидов в семенных канальцах, метод имеет очень важный недостаток - инвазивность. Разработанный китайскими учеными метод может быть эффективно применен только на этапе работы клинического эмбриолога, когда микродиссекция у пациента уже выполнена.

Для разработки новых подходов к неинвазивной оценке семенной плазмы и прогнозированию наличия сперматозоидов были использованы полые волноводы, которые с успехом применяются авторами для анализа других биологических жидкостей [Ermatov et al., 2020]. Были использованы так называемые молекулярные отпечатки семенной плазмы [Gilany et al., 2018], которые существенным образом были усилены полым волноводом. На тестовой выборке пациентов в результате математической обработки полученных спектральных характеристик семенной плазмы был составлен алгоритм прогнозирования наличия сперматозоидов в ткани яичка. Было показано, что пациенты с наличием и отсутствием сперматозоидов в тестикулярной ткани различаются по двойной спектральной линии с плечом в области 2850-3000 см^-1, соответствующей, согласно литературным данным, -CH2- связи [Deng et al., 2022;]. На рисунке 1 показаны спектры образцов семенной плазмы пациентов тестовой выборки с положительным и отрицательным исходом тестикулярной биопсии. Как видно из рисунка 1, спектры стратифицируются на две группы по наличию и отсутствию мужских половых клеток.

После пилотных проектов на образцах семенной плазмы пациентов, проходящих лечения бесплодия путем экстракции сперматозоидов из ткани яичка, подписания информированного добровольного согласия и разрешения Комиссии по этике биомедицинских исследований ФГБУ НМИЦ АГП им. Кулакова МЗ РФ (выписка из протокола №10 от 20.10.2022) был разработан следующий протокол неинвазивного тестирования семенной плазмы мужчин с азооспермией и прогнозирования присутствия сперматозоидов в ткани яичек, который состоит из следующих этапов.

1. Сбор эякулята мужчины в стерильный контейнер путем мастурбации при 3-4 днях полового воздержания.

2. Центрифугирование эякулята в течение 10 минут на 1900 об/мин (400g). Сбор надосадочной жидкости в стерильную пробирку. Центрифугирование полученной семенной плазмы в течение 30 мин на 12 000 об/мин (3000 g). Сбор надосадочной жидкости для последующего анализа.

3. Погружение полого оптического волокна в обработанные образцы семенной плазмы мужчин.

4. Спектральный анализ полученных биологических образцов при следующих параметрах съемки: лазер 633 нм, 10х объектив, 60 секунд по 9 накоплений в диапазоне 2150-3050 см^-1. Набор статистики по 3 спектрам в двух волокнах для одного образца с последующей математической обработкой.

Клинический пример 1

Супружеская пара Ч-ы, женщина 35 лет, мужчина 36 лет, обратилась с жалобами на отсутствие наступления беременности в течение 12 лет регулярной половой жизни без контрацепции. По результатам спермограммы у мужчины в эякуляте сперматозоиды отсутствуют. Гормональные и акушерско-гинекологические характеристики супруги в норме. У мужчины Кариотип: 46XY, AZF - AZF с- sy1197, CFTR: нет мутаций. УЗИ мошонки: норма. Гормоны: норма. Ингибин В - 202. Было принято решение о лечении бесплодия методами ВРТ с биопсией яичек в день трансвагинальной пункции жены. В день тестикулярной биопсии была собрана семенная плазма и отдана на спектроскопию комбинационного рассеяния. Результаты анализа показали высокую вероятность получения сперматозоидов. Средняя интенсивность спектральной линии 2940 см^-1 образца семенной плазмы составила 1600 у.е., входящую в диапазон 1000-2000 у.е.. В результате проведения открытой микрохирургической операции яичек были получены сперматозоиды, которые использовали для оплодотворения ооцитов жены, получено 2 эмбриона: один был перенесен в полость матки, 1 криоконсервирован.

Клинический пример 2

Пациент А-н, 28 лет, обратился в отделение андрологии для проведения тестикулярной биопсии в связи с жалобами на отсутствие наступления беременности в браке на протяжении 6 месяцев. В спермограмме - азооспермия с нормальным объемом эякулята. Уровень ФСГ - 36.93 мМЕ/мл, эстрадиола -143 пмоль/л, ТТГ-1.15 мкМЕ/мл, ЛГ-20.04 мМЕ/мл, пролактина - 455 мМЕ/л, тестостерона - 18.38 нмолъ/л. Супруга (24 года) обследовалась у гинеколога, патологии не выявлено.

В день проведения открытой микрохирургической биопсии яичек, придатков (MESE, TESE) путем мастурбации была собрана семенная плазма для последующего анализа. Средняя интенсивность спектральной линии 2940 см^-1 образца семенной плазмы составила 2200 у.е., лежащей выше диапазона 1000-2000 у.е., что указывало на отсутствие сперматозоидов в ткани яичек, что и было выявлено после измельчения семенных канальцев клиническим эмбриологом.

По результатам гистологического исследования показано следующее. Ткань правого яичка: представлено 4 поперечными срезами канальцев, с выраженным периканальцевым склерозом, сперматоциты и зрелые вытянутые сперматиды не определяются. (0 баллов по шкале Bergmann and Kliesch, 1998). В строме - клетки Лейдига. Ткань левого яичника: представлено 20 поперечных срезов канальцев, с выраженным периканальцевым склерозом, сперматоциты и зрелые вытянутые сперматиды не определяются. (0 баллов по шкале Bergmann and Kliesch, 1998). В строме - клетки Лейдига.

Таким образом, можно говорить о том, что разработанная техника прогнозирования наличия сперматозоидов в тестикулярной ткани по спектрам комбинационного рассеяния позволяет не проводить дорогостоящую хирургическую операцию, что снижает затраты как на само лечение, так и на послеоперационные осложнения. Технология является не только недорогой, но и безопасной, поскольку использует биологическую жидкость, собранную неинвазивно.

Подпись к рисунку 1

Рисунок. 1. Спектры комбинационного рассеяния образцов семенной плазмы пациентов с положительным (зеленый) и отрицательным (красный) исходом операции.

Список литературы

1. Гамидов С.И., Попова А.Ю., Гасанов Н.Г., Овчинников Р.И., Наумов Н.П., Шатылко Т.В. Роль методов хирургического получения сперматозоидов у пациентов с азооспермией в программах вспомогательных репродуктивных технологий (обзор литературы). Андрология и генитальная хирургия. 2018; 19(3):27-34. https://doi.org/10.17650/2070-9781-2018-19-3-27-34

2. Ješeta М. et al. Non-Invasive Diagnostics of Male Spermatogenesis from Seminal Plasma: Seminal Proteins // Diagn. Basel Switz. 2023. Vol. 13, №15. P. 2468.

3. Li, J., Yang, F., Dong, L. et al. Seminal plasma biomarkers for predicting successful sperm retrieval in patients with nonobstructive azoospermia: a narrative review of human studies. Basic Clin. Androl. 33, 9 (2023). https://doi.org/10.1186/s12610-023-00184-0

4. Candenas L., Chianese R. Exosome Composition and Seminal Plasma Proteome: A Promising Source of Biomarkers of Male Infertility // Int. J. Mol. Sci. 2020. Vol. 21, №19. P. 7022.

5. Ma Y. et al. The emerging role of extracellular vesicles in the testis // Hum. Reprod. Oxf. Engl. 2023. Vol. 38, №3. P. 334-351.

6. Бржозовский А.Г., Стародубцева Н.Л., Бугрова А.Е., Кононихин А.С., Чаговец В.В., Шатылко Т.В., Гамидов СИ., Тамбиев А.Х., Попова А.Ю., Гасанов Н.Г., Бицоев Т.Б., Франкевич В.Е. Прогностические возможности протеомного анализа семенной плазмы у мужчин с азооспермией. Андрология и генитальная хирургия. 2021;22(3): 18-24. https://doi.org/10.17650/1726-9784-2021-22-3-18-24

7. Гамидов С.И., Шатылко Т.В., Попова А.Ю., Гасанов Н.Г., Дружинина Н.К. Изолированное повышение уровня фолликулостимулирующего гормона как прогностический фактор негативного результата microTESE. Андрология и генитальная хирургия. 2023;24(2):85-94. https://doi.org/10.17650/2070-9781-2023-24-2-85-94

8. Сорокина Т.М., Андреева М.В., Штаут М.И., Черных В.Б., Курило Л.Ф. Оценка состояния сперматогенеза у пациентов с азооспермией или криптозооспермией с помощью метода количественного кариологического анализа незрелых половых клеток. Андрология и генитальная хирургия. 2019;20(1):75-81. https://doi.org/10.17650/2070-9781-2019-20-1-75-81

9. Патент на изобретение №2328736/10.07.2008. Бюл. №19. Курило Л.Ф. Способ цитологической диагностики нарушения сперматогенеза. [Patent RUS No 2328736/10.07.2008. Bull. No 19. Kurilo L.F. Method of cytogenetic diagnosis of spermatogenesis violation. (In Russ.)].

10. Osterberg E.C., Laudano M.A., Ramasamy R., Sterling J., Robinson B.D., Goldstein M., Li P. S., Haka A.S., Schlegel P.N., Indentification of spermatogenesis in a rat sertoli-cell only model using Raman spectroscopy: a feasibility study, J Urol 192(2), 607-612 (2014). 10.1016/j.juro.2014.01.106

11. Liu Y., Zhu Y., Di L., Ostrerberg E.C., Liu F., He L., Hu H., Huang Y., Li P.S., Li Z., Raman spectroscopy as an ex vivo noninvasive approach to distinguish complete and incomplete spermatogenesis within human seminiferous tubules, Fertil. Steril. 102(1), 54-60.е2 (2014). 10.1016j.fertnstert.2014.03.035

12. Huang J., Tang X., Chen Z., Li X., Zhang Y., Huang X., Zhang D., An G., Lee H.J., Rapid azoospermia classification by stimulated Raman scattering and second harmonic generation microscopy. Biomed Opt Express. 2023 Oct 5;14(11):5569-5582. doi: 10.1364/BOE.501623. PMID: 38021145; PMCID: PMC10659792.

13. Ermatov T., Skibina J.S., Tuchin V.V., Gorin D.A. Functionalized Microstuctured Optical Fibers: Materials, Methods, Applications. Materials (Basel). 2020 Feb 19;13(4):921. doi:10.3390/ma13040921. PMID: 32092963; PMCID: PMC7078627.

14. Gilany K., Jafarzadeh N., Mani-Varnosfaderani A., Manai-Tehrani A., Sadeghi M.R., Darbandi M., Darbandi S., Amini M., Arjmand B., Pahlevanzaden Z. Metabolic Fingerprinting of Seminal Plasma from Non-obstructive Azoospermia Patients: Positive Versus Negative Sperm Retrieval. J Reprod Infertil. 2018 Apr-Jun;19(2):109-114. PMID: 30009145; PMCID: PMC6010822.

15. Deng et al., Radiation treatment response and hypoxia biomarkers revealed by machine learning assisted Raman spectroscopy in tumour cells and xenograft tissues // Analyst, 2022, 147, 5091-5104

16. Larkin P. Infrared and Raman Spectroscopy Principles and Spectral Interpretation// 2nd Edition - November 13, 2017 https://www.sciencedirect.com/book/9780123869845/infrared-and-raman-spectroscopy

Изобретение относится к медицине, а именно к репродуктологии, андрологии и клинической эмбриологии, и может быть использовано для прогнозирования присутствия сперматозоидов в ткани яичек человека у пациентов с азооспермией. Осуществляют сбор эякулята, проведение спектроскопии комбинационного рассеяния семенной плазмы. Используют семенную плазму, центрифугированную в течение 10 мин при 400g и 30 мин при 3000g, которую погружают в полый волновод, с которого снимают спектральные характеристики методом рамановской микроскопии. При интенсивности спектральной линии 2940 см^-1 выше значения 2000 у.е. прогнозируют отсутствие сперматозоидов в ткани яичек пациентов. При интенсивности этой же спектральной линии в диапазоне 1000-2000 у.е. прогнозируют наличие сперматозоидов в ткани яичек пациентов. Способ обеспечивает возможность неинвазивной оценки семенной плазмы и прогнозирования наличия сперматозоидов за счет использования полых волноводов для анализа семенной плазмы, неинвазивности процедуры и отсутствия сложной и дорогостоящей пробоподготовки при получении точной картины клеточной и тканевой физиологии. 1 ил., 2 пр.

Способ прогнозирования присутствия сперматозоидов в ткани яичек человека у пациентов с азооспермией, включающий сбор эякулята, проведение спектроскопии комбинационного рассеяния семенной плазмы, отличающийся тем, что используют семенную плазму, центрифугированную в течение 10 мин при 400g и 30 мин при 3000g, которую погружают в полый волновод, с которого снимают спектральные характеристики методом рамановской микроскопии; при интенсивности спектральной линии 2940 см^-1 выше значения 2000 у.е. прогнозируют отсутствие сперматозоидов в ткани яичек пациентов; при интенсивности этой же спектральной линии в диапазоне 1000-2000 у.е. прогнозируют наличие сперматозоидов в ткани яичек пациентов.