Способ малоинвазивного выделения бактериальной ДНК из биоптата тестикулярной ткани у инфертильных мужчин Российский патент 2023 года по МПК C12N15/00 G01N33/68 

Предлагаемое изобретение относится к медицине, в частности к урологии в разделе хирургической андрологии с использованием методологии молекулярной биологии и клинико-лабораторной диагностики, и может быть использовано в центрах вспомогательных репродуктивных технологий с целью лечения бесплодия у инфертильных мужчин с тяжелыми нарушениями сперматогенеза.

Разработка новой стратегии скрининга мужской инфертильности на основе молекулярных инструментов представляет собой насущную потребность. Действительно, экспрессия генов стала важным инструментом для диагностики, прогноза и стратегии лечения пациентов с данной патологией. Разработан и изложен способ выделения бактериальной ДНК из биоптата яичка с целью определения тестикулярного микробиома у инфертильных пациентов, которая доказывает свою актуальность при диагностике факторов мужского бесплодия. В яичках мужчин могут содержаться собственные бактерии, которые различаются в зависимости от степени фертильности. Такое открытие совершили ученые из Италии. Длительное время мужские яички считались абсолютно стерильными, но теперь оказалось, что у них тоже имеется собственный микробиом. По словам экспертов, проживающие естественным образом в яичках микроорганизмы образуют характерную среду, по содержанию которой можно сказать с определенной степенью вероятности о том, насколько легко мужчина сможет заводить детей. При наличии определенной разновидности бактерий шансы на потомство у мужчины более высокие, а если этой разновидности не хватает, то мужчина может столкнуться с угрозой бесплодия из-за низкого количества сперматозоидов.

Микробиом человека представляет собой совокупность всех микробиот, которые находятся на тканях и биологических жидкостях человека или внутри них, вместе с соответствующими анатомическими участками, в которых они находятся, включая кожу, молочные железы, плаценту, семенную жидкость, матку, фолликулы яичников, легкие, слюну, слизистую оболочку полости рта, конъюнктиву, желчевыводящие пути и желудочно-кишечный тракт (Marchesi JR, Ravel J (2015). "The vocabulary of microbiome research: a proposal". Microbiome. 3: 31. doi:10.1186/s40168-015-0094-5).

He остается без внимания и урогенитальный тракт инфертильных пациентов, в частности мужское население земного шара населяет около 20 процентов инфертильных мужчин, из которых до 1 процента случаев приходится на азооспермию - полное отсутствие сперматозоидов в эякуляте (Не Y., Zou Q., Li В., Chen Н., Du X., Weng S., Luo T. and Zeng X.: Ketamine inhibits human sperm function by Ca(2+) related mechanism. Biochem Biophys Res Commun 478: 501 506, 2016). Предыдущие исследования показали, что генетические факторы, включая хромосомные аномалии, ответственны за азооспермию (Myandina G. I., Kulchenko N. G., Alhejoj H. Polymorphism G-105A SEPS1 geneandmens' infertility. Medical New sof NorthCaucasus. 2018; 13(3):488-490 https://doi.org/10.14300/mnnc.2018.13085). Микробиомы в уретре играют важную роль в здоровье человека, заболеваниях других этиологий (Кадыров З.А., Степанов В.Н., Фаниев М.В., Рамишвили Ш.В. Микробиота органов урогенитальной системы. Урология, 2020; 1: 116-120/ Kadyrov Z.A., Stepanov V.N., Faniev M.V., Ramishvili Sh.V. Microbiota of the urogenital system organs. Urologiya. 2020; 1: 116-120. DOI: https://dx.doi.org/10.18565/urology.2020.L116-120). Сообщалось, что некоторые бактерии, в том числе Lactobacillusiners, Gardnerella vaginalis, Escherichia faecalis, E.coli и Staphylococcus aureus, связаны непосредственно с мужским фактором бесплодия, что было продемонстрировано с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) или методов, основанных на культуре бактерий (De Croo I., Van der Elst J., Everaert K., De Sutter P. and Dhont M.: Fertilization, pregnancy and embryo implantation rates after ICSI in cases of obstructive and non obstructive azoospermia. Hum Reprod 15: 1383 1388, 2000).

В течение последнего десятилетия исследования показали, что помимо известных прогностических факторов, таких как продолжительность субфертильности, возраст мужчины, индекс массы тела, также микробиом может влиять на фертильность. Присутствие определенной микробиоты во время вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) оказывает положительное влияние на результат. Это первое исследование, в котором подчеркивается, что тестикулярные ткани пациентов с мужским фактором бесплодия содержат ассоциированные с тканями комменсальные бактерии. Заявителями выявлен единственный источник информации, касающийся лишь названия данного объекта, который принят за аналог «Testicular microbiomeinazoospermicmen-first evidence of the impact of analtered microenvironment» / Massimo Alfano, Roberto Ferrarese, Irene Locatelli, Eugenio Ventimiglia, Silvia Ippolito, Pierangela Gallina, Daniela Cesana, Filippo Canducci, Luca Pagliardini, Paola Vigano, Massimo Clementi, Manuela Nebuloni, Francesco Montorsi, and Andrea Salonia. / Human Reproduction, Vol. 33, No.7 pp. 1212-1217, 2018 Advanced Access publication on May 30, 2018 doi:10.1093/humrep/dey116/. Недостатком в работе неполное описание непосредственно подготовительной фазы выделения бактериальной ДНК, из нативного биоптата ткани яичка пригодной для проведения NGS-секвенирования, что вызывает дополнительные трудности при проведении данной работы. В первой фазе подготовки биологического материала не указаны среды и использованные буферные растворы, их концентрация, время экспозиции и режимы центрифугирования для получения необходимого количества бактериальной ДНК из тестикулярного материала, и таким образом способ практически не выполним. Большинство современных методов выделения ДНК из тканей растительного и животного происхождения состоят из последующих этапов: разрушение клеточных стенок; лизис клеточных мембран; очистка от ингибиторов ферментативных реакций (ПЦР, рестрикции) Разрушение клеточных стенок осуществляется механически перетиранием с оксидом кремния (или оксидом алюминия) или с использованием жидкого азота.

Задачи: Снижение трудоемкости способа выделения бактериальной ДНК и повышение результативности при диагностике нарушения фертильности у мужчин с различными формами бесплодия, в дальнейшем улучшение тактики ведения и прогнозирования результатов лечения, сокращение времени реабилитации после проведения малоинвазивного диагностического обследования.

Сущность заключается в том, что способ малоинвазивного выделения бактериальной ДНК у инфертильных мужчин забор образца тестикулярной ткани яичка осуществляют интраоперационно путем биопсии яичка, с последующем забором образца из уретры и обрабатывают в физиологическом растворе в стерильных условиях и крио консервируют при температуре не менее -30°С, после чего проводят очистку интактной ДНК из тестикулярной ткани с помощью набора TheReliaPrep™ gDNATissueMiniprepSystem, Promega (Promega Corporation ⋅ 2800 Woods Hollow Road ⋅ Madison, WI 53711-5399 USA TM345 ⋅ Revised 8/13 www.promega.com), выделяя пробу интактной ДНК с использованием миниколонок в настольной микроцентрифуге, добавляют к образцу тестикулярной ткани 160 мкл ТЕ буфера и 20 мкл лизоцима с концентрацией 50 мг/мл, тщательно перемешивают, вортексируют, инкубируют при 37°С 1-2 часа, добавляют 20 мкл раствора Протеиназы К (РК) и 200 мкл Лизис-буфера, вортексируют 10 секунд, вновь инкубируют при 56°С 2 часа, добавляют по 20 мкл раствора РНКазы А, перемешивают на вортексе в течение 10 секунд, с последующим инкубированием 10 минут при 56°С, сразу добавляют 250 мкл связывающего буфера (ВВА), вортексируют 1 минуту и центрифугируют, мини колонки помещают внутрь пробирки для образца и переносят жидкость на колонку, центрифугируют по 1 минуте дважды на скорости 3000 в 1 мин и добавляют 500 мкл раствора для промывки колонок (CWD,) центрифугируют 2 минуты и отделяют жидкость, колонку переносят в микроцентрифужную пробирку, добавляют 50 мкл воды, центрифугируют и полученный элюят бактериальной ДНК тестикулярной ткани и образец мазка из уретры криоконсервируют для последующего анализа.

В предлагаемом способе использована предварительная инкубация лизоцимом в ТЕ буфере для разрушения бактериальной клеточной стенки, что является новизной при таком подходе. Лизоцим вносили в объеме 20 мкл из стокового раствора с концентрацией 50 мг/мл согласно методу Бирнбойма-Доли / Birnboin Н.С., Doly J. Rapid alkaline extraction method for screening recombinant plasmid DNA// Nucl. Acid Res. 1979. 7. 1513-1522. / к образцу, содержащему 160 мкл ТЕ-буфера. Далее проводили инкубирование в шейкере-термостате при 37°С в течение 1-2 часов при помешивании. Обработка лизоцимом способствует увеличению выхода бактериальной ДНК. Последующие этапы проводили по стандартному протоколу выделения ДНК из животных тканей. Данный способ был впервые применен в отношении тестикулярной ткани человека с целью выделения бактериальной ДНК пригодной для последующего секвенирования методом NGS.

Технический результат достигается тем, что предложенный комплекс мероприятий позволил сократить трудоемкость, совершенствовать прогнозирование результатов диагностики репродуктивного потенциала, а также обоснованность программы выбора алгоритма лечения и повышения медико-социальной реабилитации в более короткий срок.

Способ апробирован на материале 46 инфертильных пациентов с азооспермией, использованием биологического материала / тестикулярная ткань и мазок слизистой уретры / подвергнутых секвенированию методом NGS. Данный способ апробирован в течение последних 3-х лет и зарекомендовал себя как надежный способ получения бактериальной ДНК для тестикулярного микробиома.

Способ осуществляют следующим образом.

В операционных условиях, по стандартной методике биопсии яичка производят забор тестикулярной ткани у пациентов. Ткань помещают в стерильный физиологический раствор интраоперационно и обрабатывают для хранения в стерильных условиях в течение 30 минут при температуре криодиссекции не более -30°. Все процедуры выполнялись в стерильных условиях, с использованием одноразовых материалов и оборудования. По завершении оперативного пособия проводят забор образца отделяемого слизистой оболочки уретры (мазки) у данного пациента, используя стабилизационный буфер и комплект для выделения ДНК из эпителия уретры.

Следующим этапом проводят очистку интактной ДНК из тестикулярной ткани с помощью набора TheReliaPrep™ gDNATissueMiniprepSystem, Promega (США), что обеспечивает быструю и простую очистку интактной ДНК из тестикулярной ткани. Образцы выделяют с использованием мини-колонок в настольной микроцентрифуге.

Геномная ДНК, выделенная таким способом, имеет высокое качество и может быть использована в ПЦР-анализе. К каждому образцу тестикулярного биоптата добавляют 160 мкл ТЕ-буфера, затем 20 мкл лизоцима с концентрацией 50 мг/мл. Содержимое пробирок тщательно перемешивают на вортексе и осаждают путем краткого центрифугирования. Затем инкубируют в термостате при температуре 37°С в течение 1-2 часов.

К гомогенизированному образцу добавляют 20 мкл раствора Протеиназы К (РК) и 200 мкл Лизис-буфера с целью лизиса клеток в пробирке и перемешивают на вортексе в течение 10 секунд. Затем вновь инкубируют при 56°С в течение 2 часов. После чего добавляют по 20 мкл раствора РНКазы А к каждому образцу и перемешивали на вортексе в течение 10 секунд с последующим инкубированием в термостате при 56°С в течение 10 минут. Следующим этапом добавляли в извлеченные пробирки из термостата 250 мкл связывающего буфера (ВВА) и вортексируют в течение 1 минуты с последующим кратким центрифугированием.

Связывающие колонки помещают внутрь пробирки для каждого образца и переносят часть жидкости образца на связывающую колонку, с последующим центрифугированием в течение 1 минуты на скорости 3000 оборотов в минуту. При наличии лизата сверху на мембране, центрифугируют колонки в течение 1 минуты. Затем извлекают пробирки с протекшей жидкостью и перемещали связывающую колонку в новую пробирку с последующим добавлением 500 мкл раствора для промывки колонок (CWD) в колонку, центрифугируют в течение 2 минут на скорости 3000 оборотов в минуту, затем отделяют протекшую жидкость. Данный этап повторяют дважды, после чего помещали колонку в чистую 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и добавляют 50 мкл воды без нуклеаз в колонку, центрифугировав 1 минуту на максимальной скорости. Удалив связывающую колонку, сохраняют элюат с целью последующего секвенирования методом NGS (секвенирования следующего поколения).

Нельзя использовать повторно колонки или пробирки. Геномная ДНК может недолго храниться при 4°С или длительно при не более -30°С. Работоспособность заявляемого способа подтверждается следующими клиническими примерами:

Пример 1

Пациент С-ов, 1982 г.р., обратился в Центр Репродукции с жалобами на отсутствие наступления беременности у супруги более 7 лет без применения средств контрацепции. В первом браке один ребенок. Супруга - 29 лет. 1-я попытка ЭКО - без успеха. Анамнез жизни - перенесенные заболевания - отрицает. Проф. Вредности - отрицает. Половая жизнь с 15 лет. В настоящее время регулярная. Посещение бани - редко, СА + внутренние войска. Ранее по поводу бесплодия неоднократно лечился, без успеха. При проведении обследования по стандарту центра ВРТ в спермограмме - азооспермия. AZF. CFTR - мутаций не выявлено, кариотипирование -46ХУ. Нормальный. !!!. Исследование эякулята на бактериальную флору - микрофлора не выделена. Бактериальный посев секрета простаты - микрофлора не выделена. ПЦР на ЗППП - микрофлора не выделена ДИАГНОЗ. Мужской фактор бесплодия. Необструктивная азооспермия Хр. простатит в стадии латентного воспаления. В операционных условиях, по стандартной методике биопсии яичка произвели забор тестикулярной ткани у пациента. Ткань поместили в стерильный физиологический раствор интраоперационно и обработали для хранения в стерильных условиях в течение 30 минут при температуре криодиссекции - 30°. Все процедуры выполняли в стерильных условиях, с использованием одноразовых материалов и оборудования. По завершению оперативного пособия провели забор образца отделяемого слизистой оболочки уретры (мазки), используя стабилизационный буфер и комплект для выделения ДНК из эпителия уретры. Следующим этапом провели очистку интактной ДНК из тестикулярной ткани с помощью набора TheReliaPrep™ gDNATissueMiniprepSystem, Promega (Promega Corporation ⋅ 2800 Woods Hollow Road ⋅ Madison, WI 53711-5399 USA TM345 ⋅ Revised 8/13 что обеспечило быструю и простую очистку интактной ДНК из тестикулярной ткани. Образцы выделяли с использованием мини колонок в настольной микроцентрифуге.

Геномная ДНК, выделенная таким способом, имеет высокое качество и может быть использована в ПЦР-анализе. К каждому образцу тестикулярного биоптата добавили 160 мкл ТЕ-буфера, затем 20 мкл лизоцима с концентрацией 50 мг/мл. Содержимое пробирок тщательно перемешали на вортексе и осадили путем краткого центрифугирования затем инкубировали в термостате при температуре 37°С в течение 1 часа.

К гомогенизированному образцу добавили 20 мкл раствора Протеиназы К (РК) и 200 мкл Лизис-буфера с целью лизиса клеток в пробирке и перемешали на вортексе в течение 10 секунд. Затем вновь инкубируют при 56°С в течение 2 часов. После чего добавляют по 20 мкл раствора РНКазы А к каждому образцу и перемешали на вортексе в течение 10 секунд с последующим инкубированием в термостате при 56°С в течение 10 минут. Следующим этапом добавили в извлеченные пробирки из термостата 250 мкл связывающего буфера (ВВА) и вортексировали в течение 1 минуты с последующим центрифугированием. Мини колонки поместили внутрь пробирки для образца и перенесли жидкость на колонку, с последующим центрифугированием в течение 1 минуты на 3000 оборотов в 1 мин. Затем извлекли пробирку с протекшей жидкостью и переместили связывающую колонку в другую пробирку с последующим добавлением 500 мкл раствора для промывки колонок (CWD), центрифугировали в течение 2 минут при скорости 3000 об/1 мин, затем отделили протекшую жидкость. Данный этап повторили дважды, после чего поместили колонку в чистую 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и добавили 50 мкл воды без нуклеаз в колонку, центрифугировав 1 минуту. Удалив связывающую колонку, сохранили элюат с целью последующего секвенирования. В результате чего была получена разновидность 146 таксонов микробиоты урогенитального тракта из тестикулярной ткани и уретры, при наличии стерильных посевов, проведенных по стандартным методикам. Данная ситуация позволила поменять лечебный алгоритм и провести санацию урогенитального тракта мужчины антибактериальной химиотерапией. Впоследствии применение данного способа обеспечило правильный выбор тактики и определения прогноза результативности протокола ЭКО, что позволило сократить время лечения, реабилитации и получить положительный результат протокола ВРТ.

Пример 2

Пациент К-ев, 1982 г.р., обратился в Центр Репродукции с жалобами на бесплодный брак более 3 лет. Предыдущие 2 попытки ЭКО без успеха. Пара готовится вновь для проведения протокола ЭКО - по мужскому фактору. Анамнестически: Брак 1. Детей в браках ранее не было. Супруга - 27 лет, беременностей не было. Перенесенные заболевания ИПП - клинически санированы. Проф. вредности - отрицает. Половая жизнь с 16 лет. В СА не служил. В настоящее время половая жизнь регулярная без применения средств контрацепции. (2-3+ в неделю) Посещение бани - редко. Ранее по поводу бесплодия лечился - без эффекта с диагнозом МБ-1. Азооспермия. Результаты обследования: Спермограмма - азооспермия. AZF.CFTR-мутаций не выявлено. Гормоны крови: Тс, ЛГ, ФСГ, пролактин вариант нормы. Ингибин В-319 пг/мл-норма. Исследование эякулята на бактериальную флору - микрофлора не выделена. Бактериальный посев секрета простаты - микрофлора не выделена. При проведении забора биологического материала из тестикулярной ткани и уретры используя способ описанный в примере 1, при условии инкубирования в термостате при температуре 37°С в течение 2 часов. Выявлено наличие инфекции, передаваемое половым путем в невысоком бактериальном титре Urea./ul. и неспецифической инфекции Е. coli в минимальном титре, а также 191 таксон разновидности урогенитального микробиома. Данная клиническая картина потребовала дополнительной предоперационной подготовки и изменила тактику и стратегию ведения пациента, что позволило в последующем сократить экономические затраты и срок реабилитации. В результате проведения протокола ВРТ получена не только прогрессирующая беременность, но и возможность криоконсервации здоровых эмбрионов.

Изобретение относится к медицине, в частности к урологии в разделе хирургической андрологии с использованием методологии молекулярной биологии и клинико-лабораторной диагностики, и может быть использовано в центрах вспомогательных репродуктивных технологий с целью лечения бесплодия у инфертильных мужчин с тяжелыми нарушениями сперматогенеза. Осуществляют забор образца тестикулярной ткани яичка интраоперационно путем биопсии яичка, с последующим забором образца из уретры, и обрабатывают в физиологическом растворе в стерильных условиях и криоконсервируют при температуре не более -30°С. Проводят очистку интактной ДНК из тестикулярной ткани с помощью набора TheReliaPrep™ gDNATissueMiniprepSystem, Promega, выделяя пробу интактной ДНК с использованием мини-колонок в настольной микроцентрифуге. Добавляют к образцу тестикулярной ткани 160 мкл ТЕ буфера и 20 мкл лизоцима с концентрацией 50 мг/мл, тщательно перемешивают, вортексируют, инкубируют при 37°С 1-2 часа. Добавляют 20 мкл раствора Протеиназы К и 200 мкл Лизис-буфера, вортексируют 10 секунд. Вновь инкубируют при 56°С 2 часа, добавляют по 20 мкл раствора РНКазы А, перемешивают на вортексе в течение 10 секунд, с последующим инкубированием 10 минут при 56°С, сразу добавляют 250 мкл связывающего буфера (ВВА), вортексируют 1 минуту и центрифугируют. Мини-колонки помещают внутрь пробирки для образца и переносят жидкость на колонку, центрифугируют по 1 минуте дважды на скорости 3000 об. в 1 мин и добавляют 500 мкл раствора для промывки колонок (CWD,) центрифугируют 2 минуты и отделяют жидкость. Колонку переносят в микроцентрифужную пробирку, добавляют 50 мкл воды, центрифугируют. Полученный элюят бактериальной ДНК тестикулярной ткани и образец мазка из уретры криоконсервируют для последующего анализа. Способ позволяет сократить трудоемкость, совершенствовать прогнозирование результатов диагностики репродуктивного потенциала, а также обоснованность программы выбора алгоритма лечения и повышения медико-социальной реабилитации в более короткий срок. 2 пр.

Способ малоинвазивного выделения бактериальной ДНК из биоптата тестикулярной ткани у инфертильных мужчин, заключающийся в том, что забор образца тестикулярной ткани яичка осуществляют интраоперационно путем биопсии яичка с последующим забором образца из уретры и обрабатывают в физиологическом растворе в стерильных условиях и криоконсервируют при температуре не более -30°С, после чего проводят очистку интактной ДНК из тестикулярной ткани с помощью набора TheReliaPrep™ gDNATissueMiniprepSystem, Promega, выделяя пробу интактной ДНК с использованием мини-колонок в настольной микроцентрифуге, добавляют к образцу тестикулярной ткани 160 мкл ТЕ буфера и 20 мкл лизоцима с концентрацией 50 мг/мл, тщательно перемешивают, вортексируют, инкубируют при 37°С 1-2 часа, добавляют 20 мкл раствора Протеиназы К и 200 мкл Лизис-буфера, вортексируют 10 секунд, вновь инкубируют при 56°С 2 часа, добавляют по 20 мкл раствора РНКазы А, перемешивают на вортексе в течение 10 секунд, с последующим инкубированием 10 минут при 56°С, сразу добавляют 250 мкл связывающего буфера, вортексируют 1 минуту и центрифугируют, мини-колонки помещают внутрь пробирки для образца и переносят жидкость на колонку, центрифугируют по 1 минуте дважды на скорости 3000 в 1 мин и добавляют 500 мкл раствора для промывки колонок, центрифугируют 2 минуты и отделяют жидкость, колонку переносят в микроцентрифужную пробирку, добавляют 50 мкл воды, центрифугируют и полученный элюят бактериальной ДНК тестикулярной ткани и образец мазка из уретры криоконсервируют для последующего анализа.