СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ УСТОЙЧИВОСТИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА К ВИРУСУ ЛЕЙКОЗА Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/68 

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной генетики в сельском хозяйстве, в частности к способам диагностики генетической устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу.

Лейкоз крупного рогатого скота - одна из главных проблем скотоводства, так как очень легко передается от одного животного другому. Оздоровление стада после обнаружения больных животных - сложный процесс, который несет за собой большие материальные затраты. Необходимо регулярно проверять поголовье на наличие вируса лейкоза КРС, на протяжении многих лет выбраковывать коров с подтвержденным диагнозом, производить ремонт стада, заменяя выявленных больных животных здоровыми.

Данное заболевание характеризуется поражением кроветворной системы, лимфоцитозом, возникновением новообразований. Лейкоз КРС характеризуется продолжительным инкубационным периодом, чаще всего проявляется у коров старше четырех лет. Заболевание протекает двухстадийно. На гематологическом этапе лейкоз диагностируют по результатам анализа крови. Наблюдают лейкоцитоз, главным образом за счет лимфоцитов, появление в периферической крови функционально незрелых клеток. На онкологической стадии становятся заметными характерные клинические признаки. Чаще скотоводы имеют дело с энзоотической формой лейкоза коров, диагностируемого по результатам серологических и гематологических исследований крови, которые проводят весной и осенью у животных, достигших полугода.

Чтобы предотвратить экономический ущерб, существует множество методов определения генетической устойчивости животных к лейкозу путем их генотипирования в раннем возрасте. Таким образом, появляется возможность заранее комплектовать стадо из животных с повышенной резистентностью к данному заболеванию.

Впервые селекционно-генетический способ определения устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу в системе регистрации результатов исследовательской деятельности Российской Федерации упоминается в патенте RU 2032337 С1 (опубл. 10.04.1995). Его суть состоит в определении наследственно обусловленной устойчивости животных к заболеванию лейкозом путем выявления специфических маркеров, представленных определенными эритроцитарными антигенами Несмотря на свою прогрессивность относительно серологических методов, данное изобретение обладает существенными недостатками ввиду выбора в качестве генетических маркеров эритроцитарных антигенов, имеющих весьма опосредованную связь с устойчивостью к лейкозу.

Более точный способ определения генетической устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу был предложен в патенте RU2287587 С2 (опубл. 20.11.2006), где в качестве генетического маркера устойчивости к заболеванию указываются аллельные варианты гена BoLA-DRB3 главного комплекса гистосовместимости класса II (МНС class II), ассоциированного с иммунным ответом. Указанным способом возможно определение 30 аллелей гена BoLA-DRB3, в том числе, аллелей *11, *23 и *28, ассоциированных с устойчивостью к персистентному лимфоцитозу крупного рогатого скота, однако данный метод предполагает проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) с определением полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), в которой участвует комбинация из 4 эндонуклеаз (RsaI, HaeIII, BstYI и Bst2UI), что сильно усложняет проведение анализа.

Развитием идеи использования гена BoLA-DRB3 в качестве генетического маркера, ассоциированного с устойчивостью крупного рогатого скота к заболеванию лейкозом, является патент RU2316207 (опубл. 10.02.2008). Его суть заключается в создании высокопродуктивного и устойчивого к персистентному лимфоцитозу стада крупного рогатого скота путем определения генотипов коров маточного поголовья и племенных быков по гену BoLA-DRB3 и дальнейшего распределения животных по группам с различной чувствительностью к лимфоцитозу с осуществлением специального подбора пар. Недостатком метода является то, что распределение крупного рогатого скота на группы осуществляется на основе определения восьми аллелей, признанных отвечающими за устойчивость или чувствительность к лейкозу без учета специфических аллелей устойчивости, а также анализ осуществляется методом ПЦР ПДРФ с использованием эндонуклеаз Rsa I, Нае III, Bst YI, что удлиняет и усложняет процесс анализа.

В настоящий момент наиболее совершенный метод определения устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу методом ПЦР ПДРФ, зарегистрированный в патентной системе Российской Федерации, изложен в патенте RU2737552 С1 (опубл. 12.01.2020). Тестирование с помощью данного метода позволяет выявить животных-носителей не только общепризнанных аллелей устойчивости к лейкозу (0902, 2701, 2702, 2703, 2704, 2705, 2706, 0701), но и аллелей 1801 и 0601, являющихся специфическими генетическим маркерами резистентности к вирусу лейкоза. Недостатком данного способа является специфика проведения полимеразных цепных реакций типа ПДРФ - необходимость выполнения дополнительных процедур после процесса амплификации ДНК (рестрикция и электрофорез), что увеличивает возможность ошибок при проведении лабораторных процедур. При этом сам анализ и интерпретация его результатов требует определенной квалификации от сотрудников, занимает значительное количество времени и плохо поддается переводу в цифровой формат.

Наиболее близким по сущности аналогом к предлагаемому является способ диагностики устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу (патент России RU2428485 С1, опубл. 10.09.2011), который предполагает проведение аллель-специфичной Nested-ПЦР с праймерами, подобранными к позициям 70-71 в аминокислотной последовательности таким образом, что выявляют животных-носителей, только устойчивых к лейкозу, с последующим определением гомо- или гетерозиготности этих животных по данным аллелям путем пиросеквенирования. Несмотря на прогрессивность данного способа относительно методов ПЦР ПДРФ, он также обладает существенными недостатками: необходимость конструировать специфические праймеры для каждого диагностируемого аллеля гена BoLA-DRB3, большое количество дополнительных инструментальных операций в процессе анализа, требующих дополнительного оборудования, а также учет в анализе только аллелей, ассоциированных с устойчивостью к лейкозу.

Техническим результатом настоящего изобретения является создание способа выявления носителей аллеля *0902, ассоциированного с устойчивостью к лейкозу крупного рогатого скота, и аллеля *1501, ассоциированного с восприимчивостью к данному заболеванию, в любых популяциях, что позволяет отбирать животных, устойчивых к вирусу лейкоза крупного рогатого скота и отбраковывать носителей генетической предрасположенности к заболеванию. Путем воспроизводства особей с генетической устойчивостью можно обеспечить формирование популяций крупного рогатого скота, устойчивых к заболеванию лейкозом.

Технический результат изобретения достигается путем амплификации определенного участка второго экзона гена BoLA-DRB3 и последующего секвенирования полученной матрицы для определения первичной структуры исследуемого участка ДНК с автоматической расшифровкой хроматограммы и выравниванием ее относительно референс-последовательности. Далее вырожденные (варьирующие) нуклеотиды обозначаются вручную, после чего применяют сценарий BDRB32ex, сверяющий исследуемую последовательность с референсной базой данных последовательностей всех аллелей и распознающий отдельный аллель или группу аллелей гена BOLA-DRB3. ПЦР проводится с праймерами ex2_for - 5'-GTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3' и ex2_rev - 5'-CGACCCCGTAGTTGTGTCTG-3', ограничивающими фрагмент длиной 216 нуклеотидов в пределах второго экзона гена BOLA-DRB3 крупного рогатого скота. Последовательность нуклеотидов на указанном фрагменте генома включает аллель *0902, ассоциированный с устойчивостью к лейкозу КРС, и аллель и *1501, ассоциированный с восприимчивостью к данному заболеванию. Данным способом может быть определена групповая специфичность или иные аллели, определяемые в составе фрагмента гена. При этом использование данного метода не требует от оператора амплификатора никаких дополнительных манипуляций с пробирками или приборами, а интерпретация полученных данных автоматизирована и формализована.

Предлагаемый способ предназначен для проведения исследований по идентификации аллеля *0902, ассоциированного с устойчивостью к лейкозу КРС, и аллеля и *1501, ассоциированного с восприимчивостью к данному заболеванию.

Принцип действия: определение аллелей основано на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, ограничивающими фрагмент длиной 216 нуклеотидов в пределах второго экзона гена BOLA-DRB3 крупного рогатого скота. Продукты ПЦР используются в качестве матрицы для определения первичной последовательности фрагмента гена BOLA-DRB3. В сиквенсной реакции используется комплементарный праймер ex2_for - 5'-GTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3' и набор меченых дидезоксирибонуклеотидтрифосфатов BigDye Terminator Kit (Applied Biosystems, США). Реакция проводится в соответствии с инструкцией к набору для секвенирования BigDye™ Terminator Kit (Thermofisher, США). Возможность определения первичной нуклеотидной последовательности обеспечивается добавлением в сиквенсную реакцию меченых нуклеотидов, терминирующих синтез. Формирующиеся фрагменты разной длины, несущие меченый концевой нуклеотид, разделяются по длине с фиксацией спектра излучения флуорофора. Продукт сиквенсной реакции используется для постановки на автоматическом секвенаторе ABI 3130 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) или аналогичном оборудовании последующих поколений в соответствии с инструкцией производителя. Визуализация хроматограм осуществляется с помощью он-лайн алгоритма Benchling (https://www.benchling.com/). Определение аллелей производится автоматически с помощью программного сценария BDRB32ex.

После проведения секвенирования и первичной обработки хроматограм с помощью алгоритма Benchling выделяются вырожденные нуклеотиды в соответствии с международной номенклатурой и загружаются последовательности в программный сценарий BDRB32ex, написанный на языке программирования «Python». На начальном этапе обработки программный сценарий осуществляет выравнивание загружаемых последовательностей против конкретного референс-аллеля и посимвольно сравнивает с ним изучаемую последовательность. Если совпадения не обнаружено, сценарий выравнивает каждую из загружаемых последовательностей относительно базы данных, содержащей информацию о всех аллелях, детектируемых в пределах анализируемого фрагмента. На первом этапе алгоритм исключает наличие аллелей *0902 и *1501 в загруженных последовательностях. На втором этапе обработки программный сценарий определяет наличие иных аллелей, детектируемых в пределах анализируемого фрагмента гена BOLA-DRB3. В результате анализа можно определить аллель образца с точностью до группы аллелей или конкретного аллеля.

В апробации разработанного метода использовался биоматериал (периферическая кровь), отобранный у крупного рогатого скота костромской породы (n=50) из хвостовой вены в промаркированные стерильные вакуумные пробирки «Vacumed» с антикоагулянтом ЭДТА K2 («Greiner Bio-One», Австрия). Очистку ДНК проводили при помощи набора «DNeasy Blood & Tissue Kit» для выделения ДНК из образцов крови и тканей животных, а также из клеток, дрожжей, бактерий и вирусов («Qiagen», Германия) в соответствии с инструкцией производителя.

Полимеразную цепную реакцию проводили в амплификаторе «Терцик» (ЗАО «НПФ ДНК-Технология») в соответствии с протоколом, рекомендованным производителем, по следующей программе: 94°С - 10 с, 56°С - 20 с, 72°С - 20 с в течение 40 циклов. Для контроля качества ДНК и оценки эффективности работы праймеров продукты ПЦР анализировали методом агарозного гель-электрофореза. Для приготовления 1 л 10 кратного ТВЕ-буфера добавляли в мерную колбу 108 г TRIS (основного), 55 г. борной кислоты, 40 мл 0,5М ЭДТА (рН 8,0) и довести объем mQ до 1 л. Для приготовления геля для электрофореза в мерном стакане на 50 мл смешивали 25 мл 1% ТВЕ-буфера, 0,25 г агарозы и 1 мкл бромистого этидия. Разогревали смесь в микроволновой печи до полного растворения агарозы. Заливали смесь в камеру для приготовления гелей. Образцы наносили в лунки в составе 5× загрузочного буфера (бромфенол/глицерин). Условия проведения электрофореза выставляли в соответствии с инструкцией производителя камеры Mupid-exU, Япония. Специфические ПЦР-продукты использовали в качестве ДНК-матрицы при проведении сиквенсной реакции. Затем применяли предлагаемый способ.

В результате исследований установлено, что в протестированной выборке животных костромской породы отсутствует аллель BoLA-DRB3 *1501, связанный с высокой вирусной нагрузкой (таблица 1).

В то же время, выявлено 6 носителей (12%) аллельного варианта BoLA-DRB3 *0902, ассоциированного с подавлением репликации вируса бычьего лейкоза. Таким образом, отсутствие в исследуемой группе животных с аллелем BoLA-DRB3 *1501 в сочетании с присутствием в выборке носителей аллеля BoLA-DRB3 *0902 позволяет судить о высокой устойчивости данных животных к лейкозу, что корреспондируется с данными о генетической устойчивости скота костромской породы к лейкозу.

Источники информации:

1. Шинкаренко А.С. Селекционно-генетический способ профилактики лейкозов у крупного рогатого скота [Текст] / Патент России RU2032337 С1 - 1995 г. - Журнал «Ветеринария», 1987, № 2, С. 28-29.

2. Ковалюк Н.В., Ковалюк А.Н., Сивогривое Д.Е. Способ определения генотипа крупного рогатого скота [Текст] / Патент России RU2287587 С2. - 2006 г. - Бюлл. №32.

3. Горковенко Л.Г., Ковалюк Н.В., Сацук В.Ф. Селекционно-генетический способ создания высокопродуктивного и устойчивого к персистентному лимфоцитозу стада крупного рогатого скота [Текст] // Патент России RU2316207 С2 - 2008 г. - Бюлл. №4.

4. Гладырь Е.А., Зиновьева Н.А., Быкова А.С., Эрнст Л.К. Способ диагностики устойчивости крупного рогатого скота к вирусу лейкоза [Текст] / Патент России RU2428485 С1 - 2011 г. - Бюлл. №25.

5. Ласкавый В.Н., Малинин М.Л., Кузнецова А. Е., Караблин П.М., Шибаева М.А. Способ оценки устойчивости крупного рогатого скота к лейкозу [Текст] // Патент России RU2452955 С1 - 2012 г. - Бюлл. №16.

6. Чалова Н.А., Корякина К.С., Плешков В.А., Миронов А.Н. Способ оценки устойчивости к лейкозу крупного рогатого скота [Текст] // Патент России RU2737552 C1 - 2020 г. - Бюлл. №34.

7. Xue J, Gochuico BR, Alawad AS, Feghali-Bostwick CA, Noth I, Nathan SD, Rosen GD, Rosas IO, Dacic S, Ocak I, Fuhrman CR, Cuenco KT, Smith MA, Jacobs SS, Zeevi A, Morel PA, Pilewski JM, Valentine VG, Gibson KF, Kaminski N, Sciurba FC, Zhang Y, Duncan SR. The HLA class II Allele DRB1* 1501 is over-represented in patients with idiopathic pulmonary fibrosis. PLoS One. 2011 Feb 23;6(2):e14715. doi: 10.1371/journal.pone.0014715. PMID: 21373184; PMCID: PMC3044131.

Изобретение относится к области биотехнологии и молекулярной генетики в сельском хозяйстве, и может быть использовано для определения генетической устойчивости крупного рогатого скота к вирусу лейкоза путем выявления аллеля *0902, ассоциированного с устойчивостью к лейкозу, и аллеля *1501, ассоциированного с восприимчивостью к данному заболеванию, методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, ограничивающими фрагмент длиной 216 нуклеотидов в пределах второго экзона гена BOLA-DRB3 крупного рогатого скота, последующим секвенированием и компьютерным распознаванием с использованием референс-последовательностей. Предложенный метод включает программный сценарий BDRB32ex, созданный для компьютерного автоматического распознавания аллелей гена BOLA-DRB3 с использованием референс-последовательностей. Для проведения ПЦР используются праймеры ex2_for - 5'-GTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3' и ex2_rev - 5'-CGACCCCGTAGTTGTGTCTG-3'. Продукт сиквенсной реакции используется для постановки на автоматическом секвенаторе. Визуализация хроматограм осуществляется с помощью он-лайн алгоритма Benchling (https://www.benchling.com/). Определение аллелей производится автоматически по референс-последовательностям с помощью программного сценария BDRB32ex, содержащего инструкции на языке программирования «Python». Метод демонстрирует стабильную воспроизводимость результатов при анализе количества копий ДНК, превышающего порог чувствительности тест-системы. 1 табл.

Способ определения генетической устойчивости крупного рогатого скота к вирусу лейкоза, включающий амплификацию участка второго экзона гена BoLA-DRB3 праймерами ex2_for -5’-GTGTCATTTCTTCAACGGGAC-3’ и ex2_rev -5’-CGACCCCGTAGTTGTGTCTG-3’, последующее секвенирование полученной матрицы для определения первичной структуры исследуемого участка ДНК и выравнивание ее относительно референс-последовательности с помощью программного сценария BDRB32ex, представляющего собой набор инструкций на языке программирования «Python», осуществляющий посимвольное сравнение расшифрованной в результате секвенирования последовательности ДНК с референс-последовательностями, распознавание аллелей *0902 и *1501 гена BOLA-DRB3 крупного рогатого скота, при этом аллель *0902, ассоциирован с устойчивостью к лейкозу КРС, а аллель *1501, ассоциирован с восприимчивостью к данному заболеванию.