АНАЛИЗ РАСЩЕПЛЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО VAMP Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/37 C12Q1/02 G01N33/53 G01N33/569 C07K16/18 

Описание патента на изобретение RU2807994C2

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к анализам на основе клеток для расщепляющих VAMP нейротоксинов клостридий.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Бактерии рода Clostridia продуцируют высоко активные и специфические белковые токсины, которые могут отравлять нейроны и другие клетки, к которым их доставляют. Примеры таких токсинов клостридий включают в себя нейротоксины, продуцируемые C. tetani (TeNT) и C. botulinum (BoNT) серотипов A-G, а также продуцируемые C. baratii и C. butyricum.

Нейротоксины клостридий действуют посредством ингибирования холинэргической передачи в периферической нервной системе, в частности, в нервно-мышечном соединении. В природе, нейротоксины клостридий синтезируются в форме одноцепочечного полипептида, который модифицируется пост-трансляционно посредством события протеолитического расщепления с формированием двух полипептидных цепей, соединенных вместе дисульфидной связью. Расщепление происходит в специфическом участке расщепления, часто обозначаемом как участок активации, который локализован между остатками цистеина, обеспечивающими межцепьевую дисульфидную связь. Эта двухцепочечная форма представляет собой активную форму токсина. Две цепи называют тяжелой цепью (H-цепью), имеющей молекулярную массу приблизительно 100 кДа, и легкой цепью (L-цепью), имеющей молекулярную массу приблизительно 50 кДа. H-цепь содержит N-концевой компонент для транслокации (домен HN) и C-концевой компонент для нацеливания (домен HC). Участок расщепления локализован между L-цепью и доменом HN. После связывания домена HC с его нейроном-мишенью и интернализации связанного токсина в клетку посредством эндосомы, домен HN транслоцирует L-цепь через эндосомальную мембрану и в цитозоль, и L-цепь обеспечивает функцию протеазы (также известной как нецитотоксическая протеаза).

Нецитотоксические протеазы действуют посредством протеолитического расщепления белков внутриклеточного транспорта, известных как белки SNARE (например, SNAP25, VAMP, или синтаксин) -см. Gerald K (2002) «Cell and Molecular Biology» (4th edition) John Wiley & Sons, Inc. Акроним SNARE происходит от термина растворимый рецептор присоединения NSF (Soluble NSF Attachment Receptor), где NSF обозначает чувствительный к N-этилмалеинимиду фактор (N-ethylmaleimide-Sensitive Factor). Акроним SNAP25 происходит от термина ассоциированный с синаптосомами белок (Synaptosome Associated Protein) 25 килодальтон. Акроним VAMP происходит от термина ассоциированный с везикулами мембранный белок (Vesicle Associated Membrane Protein). Белки SNARE являются составной частью слияния с внутриклеточной везикулой, и таким образом, секреции молекул посредством транспорта везикул из клетки. Протеазная функция представляет собой активность зависимой от цинка эндопептидазы и имеет высокую субстратную специфичность для белков SNARE. Соответственно, после доставки к желательной клетке-мишени, нецитотоксическая протеаза является способной ингибировать клеточную секрецию из клетки-мишени. L-цепи протеаз нейротоксинов клостридий представляют собой нецитотоксические протеазы, расщепляющие белки SNARE. L-цепи протеаз BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X и TeNT расщепляют VAMP (также обозначенный как синаптобревины), L-цепи протеаз BoNT/A и BoNT/E расщепляют SNAP25, и L-цепь протеазы BoNT/C расщепляет как SNAP25, так и синтаксин, что приводит к ингибированию высвобождения нейротрансмиттеров и consequent neuroparalysis (Rossetto, O. et al., «Botulinum neurotoxins: genetic, structural and mechanistic insights». Nature Reviews Microbiology 12.8 (2014): 535-549) (Zhang et al., «Identification and characterization of a novel botulinum neurotoxin»; Nature Communications, 2017, 8:14130).

Нейротоксины клостридий нацеливаются на нейроны и проникают в них посредством связывания с их специфическими рецепторами через свои связывающие рецептор домены (HC), хорошо определенные в литературе (Schiavo, G., Matteoli, M. & Montecucco, C. Neurotoxins affecting neuroexocytosis, Physiol Rev, 2000, 80, 717-766). Связывание рецептора определяет эффективность и специфичность BoNT для узнавания нейронов. BoNT/B, D-C и G разделяют два гомологичных белка синаптических везикул синаптотагмин I и II (Syt I/II) в качестве своих рецепторов, в то время как BoNT/A, E, D, F и TeNT используют другой белок синаптических везикул SV2. В дополнение к белковым рецепторам, все BoNT требуют липидных корецепторных ганглиозидов, которые являются широко распространенными на поверхностях нейронов.

Нейротоксины клостридий используют в терапии для лечения двигательных и вегетативных нарушений. Несколько продуктов BoNT/A (включая Botox®, Dysport® и Xeomin®) и один продукт BoNT/B (Neurobloc®/Myobloc®) одобрены регулирующими органами для использования у человека.

Обычно активность фармацевтических продуктов BoNT количественно оценивают в единицах MLD50 (летальной дозы для 50% мышей), где одна единица соответствует медиане летальной внутрибрюшинной дозы у мышей. Однако, единица MLD50 для ботулинических токсинов не является стандартизованной единицей. Действительно, анализы, использованные различными производителями поставляемых на рынок токсинов, отличаются, в частности, выбором буфера для разведения (Straughan, D. W., 2006, ATLA 34(3), 305-313; Hambleton and Pickett, Hambleton, P., and A. M. Pickett., 1994, Journal of the Royal Society of Medicine 87.11: 719). Кроме того, по этическим соображениям и последним нормативно-правовым актам, в настоящее время является предпочтительным избегать использования анализов активности с использованием животных. Анализы активности на основе клеток исключают необходимость тестирования на животных и связанные с этим этические опасения. После интоксикации клеток, активность нейротоксина клостридий можно измерять посредством оценки степени расщепления SNARE в клетке-мишени, например, посредством Вестерн-блоттинга. Альтернативно, расщепление SNARE можно детектировать и оценивать количественно с использованием способа сэндвич-ELISA. Такие способы хорошо функционируют для расщепления SNAP25 и синтаксина (см., например, Pellett, Sabine, et al. «Comparison of the primary rat spinal cord cell (RSC) assay and the mouse bioassay for botulinum neurotoxin type A potency determination». Journal of pharmacological and toxicological methods 61.3 (2010):304-310; Fernández-Salas, Ester, et al. «Botulinum neurotoxin serotype A specific cell-based potency assay to replace the mouse bioassay». PLoS One 7,11 (2012): e49516; Kalandakanond S et al. «Cleavage of intracellular substrates of botulinum toxins A, C and D in mammalian target tissue» The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics (2001):749-755; Peng L et al. «Cytotoxicity of botulinum neurotoxins reveals a direct role of syntaxin 1 and SNAP25 in neuron survival». Nature Communications (2013): 4:1472). Однако до настоящего времени доказывали, что продукт расщепления VAMP в лизатах клеток необычайно сложно детектировать. Действительно, несмотря на то, что специфические для расщепления VAMP антитела, которые узнают расщепленный VAMP, являются доступными и пригодными для детекции расщепления VAMP в анализах внеклеточной или клеточной фракции (Hallis, Bassam, B. A. James, and Clifford C. Shone. «Development of novel assays for botulinum type A and B neurotoxins based on their endopeptidase activities». Journal of clinical microbiology 34.8 (1996): 1934-1938; Kegel, B., et al. «An in vitro assay for detection of tetanus neurotoxin activity: Using antibodies for recognizing the proteolytically generated cleavage product». Toxicology in Vitro 21.8 (2007): 1641-1649; Fujita-Yoshigaki, Junko, et al. «Vesicle-associated Membrane Protein 2 Is Essential for cAMP-regulated Exocytosis in Rat Parotid Acinar Cells The Inhibition of cAMP-dependent Amylase Release by Botulinum Neurotoxin B». Journal of Biological Chemistry 271.22 (1996): 13130-13134), эти антитела не детектируют расщепленный VAMP в клеточных исследованиях.

Согласованным мнением в данной области до настоящего времени являлось то, что расщепленный продукт VAMP должен деградировать в клетке очень быстро и таким образом, не вносит вклад в длительность действия BoNT (Foran, Patrick G., et al. «Evaluation of the Therapeutic Usefulness of Botulinum Neurotoxin B, C1, E, and F Compared with the Long Lasting Type A Basis for Distinct Durations of Inhibition of Exocytosis in Central Neurons». Journal of biological chemistry 278.2 (2003): 1363-1371). Однако, Schiavo et al. показали, что оба продукта расщепления VAMP присутствуют в фракциях малых синаптических везикул, полученных из коры головного мозга крыс при обработке BoNT/B и TeNT, с использованием окрашивания Кумасси синим (Schiavo G., et al (1992), Tetanus and Botulinum-B neurotoxins block высвобождение нейротрансмиттеров by proteolytic cleavage of synaptobrevin. Nature 359 p832-835). Это позволяет предполагать, что продукты VAMP из клеточного источника могут присутствовать, хотя препарат синаптосом может не содержать все протеазы, присутствующие в тотальном лизате клеток. В Dong et al (2004) описано, что в клетках PC12, экспрессирующих YFP-Syb(FL)-CFP, сигналы обоих продуктов VAMP поддаются детекции после расщепления посредством BoNT/B, и что YFP-N-концевой продукт расщепления VAMP распространяется в цитозоле и перераспределятся в ядре, в то время как CFP-C-концевой продукт остается локализованным в везикуле (Dong M., et al (2004) Using fluorescent sensors to detect botulinum neurotoxin activity in vitro and in living cells. PNAS 101 (41) p14701-14706). Это доказательство позволяет предполагать, что оба продукта VAMP могут присутствовать, но еще неизвестные клеточные процессы мешают узнаванию антителом N-концевого продукта. Таким образом, стандартной практикой является измерение расщепления VAMP только по исчезновению полноразмерной полосы (см. eg. Pellett, Sabine, et al. «A neuronal cell‐based botulinum neurotoxin assay for highly sensitive and specific detection of neutralizing serum antibodies». FEBS letters 581,25 (2007): 4803-4808.; Whitemarsh, Regina CM, et al. «Novel application of human neurons derived from induced pluripotent stem cells for highly sensitive botulinum neurotoxin detection Biological Sciences: Applied Biological Sciences». Toxicological Sciences, 2012, 126(2):426-435). Однако анализы, основанные на потере сигнала, сопровождаются риском ошибки, поскольку могут присутствовать расхождения в общей загрузке белка, которые могут затем приводить либо к завышенной, либо к заниженной оценке исчезновения VAMP. Белок домашнего хозяйства, который остается неизменным в ходе обработки BoNT, можно использовать для нормализации исчезновения VAMP по плотности для контрольного белка. Недостатком в данном случае является то, что сигналы должны совпадать между антителами и находиться в линейном диапазоне для детекции каких-либо различий для целей нормализации. Хотя качественно это может являться целесообразным показателем активности BoNT, это не является пригодным для более подробного количественного определения и в частности, для определения активности фармацевтических составов BoNT.

Таким образом, существует необходимость анализов расщепления клеточного VAMP, основанных на усилении считывания сигнала.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В первом аспекте изобретение относится к антигенному полипептиду, содержащему эпитоп VAMP, где указанный антигенный полипептид состоит из 10-65 аминокислотных остатков, где указанный эпитоп VAMP содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 90% идентичной последовательности VAMP, содержащей по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, которые находятся непосредственно с C-конца от участка расщепления нейротоксином клостридий в указанном VAMP.

В другом аспекте изобретение относится к полипептиду, содержащему антигенный полипептид по изобретению, где полипептид не содержит область из более 17, предпочтительно, 16, более предпочтительно, 15 последовательных аминокислот, имеющих 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью природного VAMP.

В другом аспекте изобретение относится к антигенному белку, содержащему полипептид в соответствии с изобретением, ковалентно связанный с носителем.

В другом аспекте изобретение относится к применению антигенного полипептида или белка по изобретению для получения антител к C-концевому продукту расщепления VAMP. В одном варианте осуществления, эпитоп по изобретению используют для получения поликлонального антитела к C-концевому продукту расщепления VAMP. В другом варианте осуществления, эпитоп по изобретению используют для получения моноклонального антитела к C-концевому продукту расщепления VAMP.

В другом аспекте изобретение относится к антителу, которое связывается с антигенным полипептидом или белком по изобретению.

В другом аспекте изобретение относится к применению антитела по изобретению в клеточном анализе с увеличением сигнала для расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий.

В другом аспекте изобретение относится к способу определения расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий в клетке, включающему:

a) приведение клетки в контакт с нейротоксином клостридий в условиях, подходящих для активности нейротоксина клостридий;

b) приведение цитоплазматического содержимого указанной клетки в контакт с первым антителом для детекции к C-концевому продукту расщепления VAMP после расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий в условиях, подходящих для связывания первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP, где указанное первое антитело для детекции представляет собой антитело по изобретению; и

c) детекцию пригодными способами связывания указанного первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP.

В другом аспекте изобретение относится к способу определения иммунной устойчивости к расщепляющему VAMP нейротоксину клостридий у пациента, включающему:

a) добавление расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий к тестируемому образцу, полученному от пациента;

b) приведение клетки в контакт с тестируемым образцом со стадии a) в условиях, подходящих для активности нейротоксина клостридий;

c) приведение цитоплазматического содержимого указанной клетки в контакт с первым антителом для детекции к C-концевому продукту расщепления VAMP после расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий в условиях, подходящих для связывания первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP, где указанное первое антитело для детекции представляет собой антитело по изобретению;

d) детекцию пригодными способами связывания указанного первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP;

e) количественную оценку количества C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с первым антителом для детекции;

f) повторение стадий a) - e) с отрицательным контрольным образцом вместо тестируемого образца; и

g) сравнение количества C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с указанным первым антителом для детекции, на стадиях (e) и (f), где детекция более низкого количества C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с указанным первым антителом для детекции на стадии (e) по сравнению с количеством C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с указанным первым антителом для детекции на стадии (f), является показателем присутствия нейтрализующих антител против расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий.

В другом аспекте изобретение относится к набору, содержащему клетку, чувствительную к интоксикации расщепляющим VAMP нейротоксином; и первое антитело для детекции против расщепленного VAMP, где указанное первое антитело для детекции представляет собой антитело по изобретению.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на обнаружении авторами изобретения того, что возможно получение антител, пригодных для использования в анализе расщепления клеточного VAMP, основанном на усилении считывания сигнала.

В частности, авторы изобретения показали, что для детекции расщепления VAMP in vitro, ключевой является детекция эпитопов, локализованных на C-концевой стороне от участка расщепления BoNT. Действительно, авторы изобретения показали в настоящем описании успешную детекцию продукта расщепления нейронального VAMP2 посредством Вестерн-блоттинга (WB) с использованием антител, связывающих эпитопы, локализованные с C-концевой стороны от участков расщепления BoNT/F и/или BoNT/D, и/или BoNT/B, которые прилегают к участкам расщепления BoNT/D и/или BoNT/F, и/или BoNT/B. В частности, такие антитела являются способными детектировать как полноразмерный VAMP, так и продукт расщепления, в лизате клеток. Этот инструмент позволяет количественную оценку активности BoNT в клеточном анализе с усилением сигнала посредством мониторирования появления продукта расщепления VAMP.

В первом аспекте изобретение относится к антигенному полипептиду, содержащему эпитоп VAMP, где указанный антигенный полипептид состоит из 10-65 аминокислотных остатков, где указанный эпитоп VAMP содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 90% идентичной последовательности VAMP, содержащей по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, которые находятся непосредственно с C-конца от участка расщепления нейротоксином клостридий в указанном VAMP.

Термин «нейротоксин клостридий», в рамках изобретения, обозначает любой полипептид, который проникает в нейрон и ингибирует высвобождение нейротрансмиттеров. Этот процесс включает связывание нейротоксина с низкоаффинным или с высокоаффинным рецептором, интернализацию нейротоксина, транслокацию эндопептидазной части нейротоксина в цитоплазму и ферментную модификацию субстрата нейротоксина. Более конкретно, термин «нейротоксин клостридий» включает любой полипептид, продуцируемый бактериями Clostridium, который проникает в нейрон и ингибирует высвобождение нейротрансмиттеров, и такие полипептиды, полученные посредством рекомбинантных технологий или химических способов. Двухцепочечная форма является активной формой нейротоксина. Эти две цепи названы тяжелой цепью (H-цепью), имеющей молекулярную массу приблизительно 100 кДа, и легкой цепью (L-цепью), имеющей молекулярную массу приблизительно 50 кДа. Нейротоксины клостридий включают ботулинические нейротоксины (BoNT) и столбнячный нейротоксин (TeNT). Серотипы A-G BoNT можно различать на основании инактивации посредством специфической нейтрализующей антисыворотки, где такая классификация по серотипу коррелирует с процентом идентичности последовательности на уровне аминокислот. Белки BoNT данного серотипа далее разделяют на различные подтипы на основании процента идентичности аминокислотной последовательности.

Один пример аминокислотной последовательности нейротоксина BoNT/A представлен как SEQ ID NO: 1 (номер доступа в UniProt A5HZZ9). Один пример аминокислотной последовательности нейротоксина BoNT/B представлен как SEQ ID NO: 2 (номер доступа в UniProt B1INP5). Один пример аминокислотной последовательности нейротоксина BoNT/C представлен как SEQ ID NO: 3 (номер доступа в UniProt P18640). Один пример аминокислотной последовательности нейротоксина BoNT/D представлен как SEQ ID NO: 4 (номер доступа в UniProt P19321). Один пример аминокислотной последовательности нейротоксина BoNT/E представлен как SEQ ID NO: 5 (NCBI RefSeq accession number WP_003372387). Один пример аминокислотной последовательности нейротоксина BoNT/F представлен как SEQ ID NO: 6 (номер доступа в UniProt Q57236). Один пример аминокислотной последовательности нейротоксина BoNT/G представлен как SEQ ID NO: 7 (номер доступа в NCBI RefSeq WP_039635782). Один пример аминокислотной последовательности нейротоксина BoNT/X представлен как SEQ ID NO: 41 (номер доступа в Genbank BAQ12790.1). Один пример аминокислотной последовательности нейротоксина TeNT представлен как SEQ ID NO: 8 (номер доступа в UniProt P04958).

Термин «домен HC», в рамках изобретения, обозначает функционально отдельную область тяжелой цепи нейротоксина с молекулярной массой приблизительно 50 кДа, которая обеспечивает связывание нейротоксина с рецептором, локализованным на поверхности клетки-мишени. Домен HC состоит из двух структурно отдельных субдоменов, «субдомена HCN» (N-концевой части домена HC) и «субдомена HCC» (C-концевой части домена HC), каждый из которых имеет молекулярную массу приблизительно 25 кДа.

Термин «домен LHN», в рамках изобретения, обозначает нейротоксин, который лишен домена HC и состоит из домена эндопептидазы («L» или «легкой цепи») и домена, ответственного за транслокацию эндопептидазы в цитоплазму (домена HN тяжелой цепи).

Иллюстративные домены L, HN, HCN и HCC показаны в таблице 1.

Таблица 1 - Иллюстративные домены L, HN, HCN и HCC

Нейротоксин клостридий Номер доступа SEQ ID NO L HN HCN HCC BoNT/A1 A5HZZ9 1 1-448 449-872 873-1094 1095-1296 BoNT/B1 B1INP5 2 1-441 442-859 860-1081 1082-1291 BoNT/C1 P18640 3 1-449 450-867 868-1095 1096-1291 BoNT/D P19321 4 1-442 443-863 864-1082 1083-1276 BoNT/E1 WP_003372387 5 1-423 424-846 847-1069 1070 -1252 BoNT/F1 Q57236 6 1-439 440-865 866-1087 1088-1278 BoNT/G WP_039635782 7 1-446 447-864 865-1089 1090-1297 BoNT/X BAQ12790.1 41 1-439 440-891 892-1105 1106-1306 TeNT P04958 8 1-456 457-880 881-1111 1112-1315

Вышеуказанные эталонные последовательности следует рассматривать в качестве руководства, поскольку могут присутствовать небольшие изменения в соответствии с сероподтипами. В качестве примера, в US 2007/0166332 (полное содержание которого, таким образом, приведено в качестве ссылки) процитированы немного отличные последовательности клостридий.

Ассоциированные с везикулами мембранные белки (VAMP) представляют собой семейство белков SNARE, которые имеют сходную структуру и вовлечены в слияние везикул и экзоцитоз, в частности высвобождение нейротрансмиттеров. VAMP являются членами семейства белков SNARE, названного семейством синаптобревина и включающего такие члены, как VAMP1, VAMP2 (оба также известные как синаптобревин), VAMP3 (также известный как целлюбревин), VAMP4, VAMP5, VAMP7 (также известный как SYBL1 или нечувствительный к столбнячному токсину VAMP), VAMP8 (также известный как эндобревин), YKT6, SEC22A и другие. VAMP1, VAMP2 и VAMP3 подвергаются расщеплению посредством легких цепей BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X и TeNT. BoNT/X расщепляет также VAMP4, VAMP5 и YKT6.

Термин «эпитоп VAMP», в рамках изобретения, обозначает часть белка VAMP, с которой связывается антитело.

В предпочтительном варианте осуществления, антигенный полипептид по изобретению состоит из 10-65, 10-60, 10-55, 10-50, 10-45, 10-40, 10-35, 10-30, 10-25, 10-20, 10-19, 10-18, 10-17, 10-16 или 10-15 аминокислотных остатков, предпочтительно, 10-15 аминокислотных остатков. Например, антигенный полипептид по изобретению может состоять из 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 или 65 аминокислотных остатков.

В предпочтительном варианте осуществления, антигенный полипептид по изобретению содержит эпитоп VAMP или состоит из эпитопа VAMP, содержащего аминокислотную последовательность, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичную последовательности VAMP, содержащей по меньшей мере 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 или 17 аминокислотных остатков, расположенных непосредственно с C-конца от участка расщепления нейротоксином клостридий в указанном VAMP.

Аминокислотные последовательности природных VAMP, в частности, VAMP1, VAMP2, VAMP3, VAMP4, VAMP5 и YKT6 крысы и человека, и их соответствующие участки расщепления VAMP нейротоксином клостридий показаны в таблице 2 и на фигуре 1.

Таблица 2 - Участки расщепления VAMP нейротоксином клостридий

VAMP SEQ ID NO BoNT/F5 и BoNT/FA Другой BoNT/F BoNT/D и BoNT/DC BoNT/B и TeNT BoNT/G BoNT/X VAMP1_крысы (Q63666) 9 Leu56-Glu57 Gln60-Lys61 Lys61-Leu62 Отсутствие расщепления Ala83-Ala84 Arg68-Ala69 VAMP1_человека (P23763) 10 Leu56-Glu57 Gln60-Lys61 Lys61-Leu62 Gln78-Phe79 Ala83-Ala84 Arg68-Ala69 VAMP2_крысы (P63045) 11 Leu54-Glu55 Gln58-Lys59 Lys59-Leu60 Gln76-Phe77 Ala81-Ala82 Arg66-Ala67 VAMP2_человека (P63027) 12 Leu54-Glu55 Gln58-Lys59 Lys59-Leu60 Gln76-Phe77 Ala81-Ala82 Arg66-Ala67 VAMP3_крысы (P63025) 13 Leu41-Glu42 Gln45-Lys46 Lys46-Leu47 Gln63-Phe64 Ala68-Ala69 Arg53-Ala54 VAMP3_человека (Q15836) 14 Leu37-Glu38 Gln41-Lys42 Lys42-Leu43 Gln59-Phe60 Ala64-Ala65 Arg49-Ala50 VAMP4_крысы (D4A560) 42 Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Lys87-Ser88 VAMP4_человека (O75379) 43 Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Lys87-Ser88 VAMP5_крысы (Q9Z2J5) 44 Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Arg40-Ser41 VAMP5_человека (O95183) 45 Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Arg40-Ser41 YKT6_крысы (Q5EGY4) 46 Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Lys173-Ser174 YKT6_человека (O15498) 47 Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Отсутствие расщепления Lys173-Ser174

В одном варианте осуществления, VAMP выбран из VAMP1, VAMP2, VAMP3, VAMP4, VAMP5 и/или YKT6.

В одном варианте осуществления, VAMP выбран из VAMP1, VAMP2 и/или VAMP3.

В одном варианте осуществления, VAMP выбран из VAMP4, VAMP5 и/или YKT6.

В предпочтительном варианте осуществления, VAMP представляет собой VAMP человека, более предпочтительно, VAMP1, VAMP2, VAMP3, VAMP4, VAMP5 и/или YKT6 человека.

В одном варианте осуществления, VAMP выбран из VAMP1, VAMP2 и/или VAMP3 человека.

В одном варианте осуществления, VAMP выбран из VAMP4, VAMP5 и/или YKT6 человека.

В одном варианте осуществления антигенного полипептида по изобретению, эпитоп VAMP представляет собой расщепляемый эпитоп VAMP для BoNT/F, где по меньшей мере 8 аминокислотных остатков находятся непосредственно на C-конце участка расщепления BoNT/F в VAMP.

Примеры эпитопов VAMP для BoNT/F, более конкретно, эпитопов VAMP1, VAMP2 и/или VAMP3 для BoNT/F, включают:

• KLSELDDRADALQ (SEQ ID NO: 15)

• QKLSELDDRADALQ (SEQ ID NO: 16)

• KLSELDDRAD (SEQ ID NO: 17)

• KLSELDDRADALQAGAS (SEQ ID NO: 18)

• DQKLSELDDRADALQ (SEQ ID NO: 31).

В одном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/F, в частности, эпитоп VAMP1, VAMP2 и/или VAMP3 для BoNT/F, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или на 100% идентичной последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 15 - SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 31. В предпочтительном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/F содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной KLSELDDRADALQ (SEQ ID NO: 15). В более предпочтительном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/F содержит или состоит из KLSELDDRADALQ (SEQ ID NO: 15).

В одном варианте осуществления антигенного полипептида по изобретению, эпитоп VAMP представляет собой эпитоп VAMP для BoNT/D, где по меньшей мере 8 аминокислотных остатков находятся непосредственно на C-конце участка расщепления BoNT/D в VAMP.

Примеры эпитопов VAMP для BoNT/D, более конкретно, эпитопов BoNT/D VAMP1, VAMP2 и/или VAMP3, включают:

• KLSELDDRADALQ (SEQ ID NO: 15)

• LSELDDRADALQ (SEQ ID NO: 19)

• LSELDDRADA (SEQ ID NO: 20)

• LSELDDRADALQAGAS (SEQ ID NO: 21).

В одном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/D, в частности, эпитоп VAMP1, VAMP2 и/или VAMP3 для BoNT/D, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 15, и SEQ ID NO: 19 - SEQ ID NO: 21. В предпочтительном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/D содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной KLSELDDRADALQ (SEQ ID NO:15). В более предпочтительном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/D содержит или состоит из KLSELDDRADALQ (SEQ ID NO: 15).

В одном варианте осуществления антигенного полипептида по изобретению, эпитоп VAMP представляет собой расщепляемый BoNT/F5 или BoNT/FA эпитоп VAMP, где по меньшей мере 8 аминокислотных остатков находятся непосредственно на C-конце участка расщепления BoNT/F5 или участка расщепления BoNT/FA в VAMP.

Примеры эпитопов VAMP для BoNT/F5 или BoNT/FA, более конкретно, эпитопов VAMP1, VAMP2 и/или VAMP3 для BoNT/F5 или BoNT/FA, включают:

• ERDQKLSELDDRA (SEQ ID NO: 32)

• LERDQKLSELDDRA (SEQ ID NO: 33)

• VLERDQKLSELDDRA (SEQ ID NO: 34).

В одном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/F5 или BoNT/FA, в частности, эпитоп VAMP1, VAMP2 и/или VAMP3 для BoNT/F5 или BoNT/FA, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 32 - SEQ ID NO: 34. В предпочтительном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/F5 или BoNT/FA содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной ERDQKLSELDDRA (SEQ ID NO: 32). В более предпочтительном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/F5 или BoNT/FA содержит или состоит из ERDQKLSELDDRA (SEQ ID NO: 32).

В одном варианте осуществления антигенного полипептида по изобретению, эпитоп VAMP представляет собой эпитоп VAMP для BoNT/B или TeNT, где по меньшей мере 8 аминокислотных остатков находятся непосредственно на C-конце участка расщепления BoNT/B или участка расщепления TeNT в VAMP.

Примеры эпитопов VAMP для BoNT/B или TeNT, более конкретно, эпитопов VAMP1, VAMP2 и/или VAMP3 для BoNT/B или TeNT, включают:

• FETSAAKLKRKYW (SEQ ID NO: 22)

• FESSAAKLKRKYW (SEQ ID NO: 23)

• QFETSAAKLKRKYW (SEQ ID NO: 24)

• FETSAAKLKR (SEQ ID NO: 25)

• FETSAAKLKRKYWWKN (SEQ ID NO: 26)

• ETSAAKLKRKYWWK (SEQ ID NO: 48)

• FETSAAKLKRKYWWK (SEQ ID NO: 49)

• QFESSAAKLKRKYW (SEQ ID NO: 50)

• FESSAAKLKR (SEQ ID NO: 51)

• FESSAAKLKRKYWWK (SEQ ID NO: 52).

В одном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/B или TeNT, в частности, эпитоп VAMP1, VAMP2 и/или VAMP3 для BoNT/B или TeNT, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 22 - SEQ ID NO: 26, и SEQ ID NO: 48 - SEQ ID NO: 52. В предпочтительном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/B или TeNT содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной FETSAAKLKRKYW (SEQ ID NO: 22) или FETSAAKLKRKYWWK (SEQ ID NO: 49). В более предпочтительном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/B или TeNT содержит или состоит из FETSAAKLKRKYW (SEQ ID NO: 22) или FETSAAKLKRKYWWK (SEQ ID NO: 49). Неожиданно, антитела, связывающие последний эпитоп, позволяют не только детекцию расщепления VAMP посредством BoNT/B, но также расщепления VAMP посредством BoNT/F.

В одном варианте осуществления антигенного полипептида по изобретению, эпитоп VAMP представляет собой эпитоп VAMP для BoNT/G где по меньшей мере 8 аминокислотных остатков находятся непосредственно на C-конце участка расщепления BoNT/G в VAMP.

Примеры эпитопов VAMP для BoNT/G, более конкретно, эпитопов VAMP1, VAMP2 и/или VAMP3 для BoNT/G, включают:

• AKLKRKYWWKN (SEQ ID NO: 27)

• AAKLKRKYWWKN (SEQ ID NO: 28)

• AKLKRKYWWKNCKM (SEQ ID NO: 29)

• AKLKRKYWWKNLKM (SEQ ID NO: 30).

В одном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/G, в частности, эпитоп VAMP1, VAMP2 и/или VAMP3 для BoNT/G, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 27 - SEQ ID NO: 30. В предпочтительном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/G содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной AKLKRKYWWKN (SEQ ID NO: 27). В более предпочтительном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/G содержит или состоит из AKLKRKYWWKN (SEQ ID NO: 27).

В одном варианте осуществления антигенного полипептида по изобретению, эпитоп VAMP представляет собой эпитоп VAMP для BoNT/X, где по меньшей мере 8 аминокислотных остатков находятся непосредственно на C-конце участка расщепления BoNT/X в VAMP.

Примеры эпитопов VAMP для BoNT/X, более конкретно, эпитопов VAMP1, VAMP2 и/или VAMP3 для BoNT/X, включают:

• ADALQAGASQF (SEQ ID NO: 53)

• ADALQAGASQ (SEQ ID NO: 54)

• RADALQAGASQF (SEQ ID NO: 55)

• ADALQAGASQFE (SEQ ID NO: 56)

• ADALQAGASVF (SEQ ID NO: 57)

• ADALQAGASV (SEQ ID NO: 58)

• ADALQAGASVFE (SEQ ID NO: 59)

• RADALQAGASVF (SEQ ID NO: 60)

• RADALQAGAS (SEQ ID NO: 61).

В одном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/X, в частности, эпитоп VAMP1, VAMP2 и/или VAMP3 для BoNT/X, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 53 - SEQ ID NO: 61. В предпочтительном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/X содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной ADALQAGASQF (SEQ ID NO: 53). В более предпочтительном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/X содержит или состоит из ADALQAGASQF (SEQ ID NO: 53).

Другие примеры эпитопов VAMP для BoNT/X, и более конкретно, эпитопов VAMP4 для BoNT/X, включают:

• SESLSDNATAF (SEQ ID NO: 62)

• SESLSDNATA (SEQ ID NO: 63)

• KSESLSDNATAF (SEQ ID NO: 64)

• SESLSDNATAFS (SEQ ID NO: 65).

В одном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/X, в частности, эпитоп VAMP4 для BoNT/X, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 62 - SEQ ID NO: 65. В предпочтительном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/X содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной SESLSDNATAF (SEQ ID NO: 62). В более предпочтительном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/X содержит или состоит из SESLSDNATAF (SEQ ID NO: 62).

Другие примеры эпитопов VAMP для BoNT/X, и более конкретно, эпитопов VAMP5 для BoNT/X, включают:

• SDQLLDMSSTF (SEQ ID NO: 66)

• SDQLLDMSST (SEQ ID NO: 67)

• RSDQLLDMSSTF (SEQ ID NO: 68)

• SDQLLDMSSTFN (SEQ ID NO: 69)

• SDQLLDMSSAF (SEQ ID NO: 70)

• SDQLLDMSSA (SEQ ID NO: 71)

• RSDQLLDMSSAF (SEQ ID NO: 72)

• SDQLLDMSSAFS (SEQ ID NO: 73)

• RSDQLLDMSS (SEQ ID NO: 74).

В одном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/X, в частности, эпитоп VAMP5 для BoNT/X, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 66 - SEQ ID NO: 74. В предпочтительном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/X содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной SDQLLDMSSTF (SEQ ID NO: 66). В более предпочтительном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/X содержит или состоит из SDQLLDMSSTF (SEQ ID NO: 66).

Другие примеры эпитопов VAMP для BoNT/X, и более конкретно, эпитопов YKT6 для BoNT/X, включают:

• SEVLGTQSKAF (SEQ ID NO: 75)

• SEVLGTQSKA (SEQ ID NO: 76)

• KSEVLGTQSKAF (SEQ ID NO: 77)

• SEVLGTQSKAFY (SEQ ID NO: 78).

В одном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/X, в частности, эпитоп YKT6 для BoNT/X, содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности, выбранной из: SEQ ID NO: 75 - SEQ ID NO: 78. В предпочтительном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/X содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной SEVLGTQSKAF (SEQ ID NO: 75). В более предпочтительном варианте осуществления, эпитоп VAMP для BoNT/X содержит или состоит из SEVLGTQSKAF (SEQ ID NO: 75).

В рамках изобретения, «процент идентичности последовательностей» между двумя или более последовательностями нуклеиновой кислоты или аминокислотными последовательностями является функцией количества идентичных нуклеотидов или аминокислот в идентичных положениях, разделяемых выровненными последовательностями. Таким образом, % идентичности можно рассчитывать как количество идентичных нуклеотидов или аминокислот в каждом положении при выравнивании, деленное на общее количество нуклеотидов или аминокислот в выровненной последовательности, умноженное на 100. При расчетах % идентичности последовательности можно также принимать во внимание количество пропусков, и длину каждого пропуска, которые необходимо вводить для оптимизации выравнивания двух или более последовательностей. Сравнение последовательностей и определение процента идентичности между двумя или более последовательностями можно проводить с использованием специфических математических алгоритмов, известных специалисту в данной области, например, математического алгоритма глобального выравнивания (такого как описано в Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48(3), 443-453, 1972).

В другом аспекте изобретение относится к полипептиду, содержащему антигенный полипептид по изобретению, где полипептид не содержит область из более 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, предпочтительно, 16, более предпочтительно, 15, последовательных аминокислот, имеющих 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью природного VAMP. Специалисту в данной области понятно, что такой полипептид также является антигенным.

В предпочтительном варианте осуществления, полипептид содержит ковалентный линкер, предпочтительно, на N-конце и/или на C-конце. Примеры ковалентных линкеров, которые являются подходящими по изобретению, представлены ниже.

В другом аспекте изобретение относится к антигенному белку, содержащему полипептид по изобретению, ковалентно связанный с носителем.

Предпочтительно, носитель представляет собой неиммуногенный или слабо иммуногенный белок. Примеры пригодных носителей включают гемоцианин морского блюдечка (KLH), овальбумин (OVA), тиреоглобулин (THY), бычий сывороточный альбумин (BSA), ингибитор трипсина соевых бобов (STI) или пептид множественного связывания (MAP).

В одном варианте осуществления, антигенный белок содержит ковалентный линкер между полипептидом по изобретению (который может уже содержать линкер, как указано выше) и носителем. Указанный линкер может представлять собой одну или несколько аминокислот, природных или неприродных, которые, как хорошо известно в данной области, могут формировать ковалентные связи с другими аминокислотами (полипептида и/или носителя) благодаря присутствию реакционноспособных групп, присутствующих на их N-конце, C-конце и/или боковых цепях. Примечательно, что аминокислота, имеющая первичную аминогруппу (-NH2) на N-конце и/или боковой цепи (такая как лизин), может вступать в реакцию с аминокислотой, имеющей карбоксильную (-COOH) группу на C-конце и/или боковой цепи (такой как аспарагиновая кислота или глутаминовая кислота), для формирования ковалентной связи; аминокислота, имеющая сульфгидрильную (-SH) группу на боковой цепи (такая как цистеин или селеноцистеин), может вступать в реакцию с аминокислотой, имеющей сульфгидрильную (-SH) группу на боковой цепи (такой как цистеин или селеноцистеин) для формирования ковалентной связи. Например, ковалентный линкер может представлять собой цистеин, добавленный к C-концу или N- концу полипептида по изобретению, где указанный цистеин формирует дисульфидный мостик с другим цистеином, добавленным в носитель или присутствующим в нем. Ковалентный линкер может, альтернативно или дополнительно, находиться в форме нескольких аминокислот, формирующих спейсер, например, линкер может представлять собой пептид, содержащий незаряженные аминокислоты с небольшими боковыми группами R, например, такие как глицин, аланин, валин, лейцин или серин. Примеры пригодных спейсеров по изобретению включают G-спейсеры, такие как GGG, GGGG и GGGGS, или A-спейсеры, такие как AAA, AAAA и AAAAV. В одном варианте осуществления, линкер состоит из от приблизительно 1 до приблизительно 30 аминокислотных остатков, предпочтительно, от приблизительно 2 до приблизительно 25 аминокислотных остатков, более предпочтительно, от приблизительно 3 до приблизительно 20 аминокислотных остатков, например, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 аминокислотных остатков.

В другом аспекте изобретение относится к использованию антигенного полипептида или белка по изобретению для получения антител к C-концевому продукту расщепления VAMP. В одном варианте осуществления, эпитоп по изобретению используют для получения поликлонального антитела к C-концевому продукту расщепления VAMP. В другом варианте осуществления, эпитоп по изобретению используют для получения моноклонального антитела к C-концевому продукту расщепления VAMP.

Способы получения антител хорошо известны в данной области, см. например, Greenfield, Edward A., ed. Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2014; Leenaars, Marlies, and Coenraad FM Hendriksen. «Critical steps in the production of polyclonal and monoclonal antibodies: evaluation and recommendations». Ilar Journal 46,3 (2005): 269-279.

Поликлональные антитела, связывающие эпитоп VAMP, как описано в настоящем описании, можно получать посредством инъекции животному, например, млекопитающему, такому как кролик, коза, мышь, хомяк или обезьяна, или в яйцо, например, яйцо курицы, антигенного полипептида или белка по изобретению. Поликлональные антитела для эпитопа VAMP, как описано в настоящем описании, можно выделять из животного (например, из крови) или яйца и дополнительно очищать хорошо известными способами, такими как аффинная хроматография белка, для получения фракции IgG, или посредством аффинной очистки против эпитопа VAMP, используемого для получения антител. Несколько контрактных исследовательских организаций предоставляют услуги получения антител по заказу, например, компания Eurogentec предоставляет «быструю 28-суточную программу», в которой проводят иммунизацию на сутки 0, и затем 3 бустер-инъекции на сутки 7, 10 и 18. Промежуточный отбор крови на сутки 21 и конечный отбор крови на сутки 28. Это является одним примером общего способа получения поликлональных антител, хорошо известного в данной области.

Моноклональные антитела, связывающие эпитоп VAMP, как описано в настоящем описании, можно получать с использованием способа гибридомы. См., например, Chapter 7, Greenfield, Edward A., ed. Antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2014. Кратко, животного-хозяина, например, млекопитающего, такого как кролик, коза, мышь, хомяк или обезьяна, подвергают одной или нескольким инъекциям антигенного полипептида или белка по изобретению, чтобы стимулировать образование лимфоцитов, которые продуцируют или способны продуцировать антитела, специфически связывающиеся с расщепленным VAMP. Титр антитела у иммунизированного животного можно мониторировать с течением времени стандартными способами, такими как ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ). Альтернативно, лимфоциты можно иммунизировать in vitro с использованием подходящей культуры линии клеток. В подходящее время после иммунизации, например, когда титры антитела являются наивысшими, продуцирующие антитело клетки выделяют от животного. Как правило, либо используют лимфоциты периферической крови, если желательны клетки человеческого происхождения, либо используют клетки селезенки или клетки лимфатических узлов, если желательны источники из не относящихся к человеку млекопитающих. Выделенные продуцирующие антитело клетки сливают с иммортализованной линией клеток с использованием подходящего средства для слияния, такого как полиэтиленгликоль, для получения клетки гибридомы. Иммортализованные линии клеток, как правило, представляют собой трансформированные клетки млекопитающих, в частности, клетки миеломы, происходящие от грызунов, быка или человека. Как правило, линию клеток миеломы мыши сливают со спленоцитами, собранными от подходящим образом иммунизированной мыши для получения гибридомы. Предпочтительными иммортализованными линиями клеток являются линии клеток миеломы мыши, которые являются чувствительными к культуральной среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (HAT). Любую из ряда линий клеток миеломы можно использовать в качестве партнера по слиянию в соответствии со стандартными способами, например, линии миеломы P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 или Sp2/O-Ag14. Клетки гибридомы, полученные в результате слияния, затем отбирают с использованием среды HAT, которая уничтожает неслитые и непродуктивно слитые клетки миеломы (неслитые спленоциты погибают через несколько суток в культуре, поскольку они не являются трансформированными). Культуральную среду, в которой выращивают клетки гибридомы, можно затем анализировать по присутствию моноклональных антител, связывающих эпитоп VAMP, как описано в настоящем описании. Например, можно проводить скрининг супернатантов гибридомы с использованием положительных по расщепленному VAMP сред в анализе иммунопреципитации, анализе связывания in vitro, например, таком как радиоиммунный анализ (RIA) или an твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), или в анализе активности на основе клеток. Аффинность связывания моноклонального антитела можно также определять, например, посредством анализа Скэтчарда. См., например, Peter J. Munson and David Rodbard, Ligand: A Versatile Computerized Approach For Characterization of Ligand-Binding Systems, 107(1) Anal. Biochem. 220-239 (1980). После идентификации желательных клеток гибридомы, способы предельных разведений используют для выделения клонов, происходящих из одиночной клетки, пока не получают клональную линию клеток, экспрессирующую желательное моноклональное антитело. Альтернативно, моноклональные антитела, связывающие эпитоп VAMP, как описано в настоящем описании, можно получать посредством скрининга рекомбинантной комбинаторной библиотеки иммуноглобулинов, например, такой как библиотека фагового дисплея антител, с использованием антигенного полипептида, белка или пептида по изобретению. Наборы для получения и скрининга библиотек фагового дисплея являются коммерчески доступными, например, такие как Recombinant Phage Antibody System (Amersham GE Healthcare, Piscataway, NJ); и SurfZAP™ Phage Display Kit (Stratagene, La JoIIa, CA). Кроме того, примеры способов и реагентов, которые можно использовать для получения и скрининга библиотеки дисплея антител, можно обнаружить, например, в Ladner et al. Патент США 5223409; Borrebaeck et al. Патент США 5712089; Griffiths et al. Патент США 5885793; Griffiths et al. Патент США 5962255; McCafferty et al. Патент США 5969108; Griffiths et al. Патент США 6010884; Jespers et al. Патент США 6017732; Borrebaeck et al. Патент США 6027930; Johnson et al. Патент США 6140471; McCafferty et al. Патент США 6172197, полное содержание каждого из которых, таким образом, приведено в качестве ссылки.

В другом аспекте изобретение относится к антителу, связывающему антигенный полипептид или белок по изобретению.

В одном варианте осуществления, антитело представляет собой поликлональное антитело.

В одном варианте осуществления, антитело представляет собой моноклональное антитело.

Аффинность связывания между антителом и антигенным полипептидом или белком можно оценивать посредством определения равновесной константы диссоциации (KD), которая измеряет скорость, с которой формируются новые комплексы антитело-антиген, сравниваемую со скоростью, с которой комплексы антитело-антиген диссоциируют при равновесии. Равновесную константу диссоциации выражают в M и определяют по соотношению Kd/Ka при равновесии, где Ka представляет собой константу скорости связывания антитела, и Kd представляет собой константу скорости диссоциации антитела. KD=[Ab] x [Ag]/[Ab+Ag], где [Ab] представляет собой молярную концентрацию антитела, [Ag] представляет собой молярную концентрацию антигена, и [Ab+Ag] представляет собой молярную концентрацию комплекса антитело-антиген, где все концентрации представляют собой концентрации компонентов, когда система находится в равновесии. Чем меньше равновесная константа диссоциации, тем более прочно связано антитело с его антигеном, или тем выше аффинность связывания между антителом и антигеном.

В одном варианте осуществления, KD между антителом по изобретению и эпитопом антигенного полипептида или белка ниже, чем 10-6 M. В предпочтительном варианте осуществления, KD между антителом по изобретению и антигенным полипептидом или белком ниже, чем 10-7 M. В более предпочтительном варианте осуществления, KD между антителом по изобретению и антигенным полипептидом или белком ниже, чем 10-8 M. В более предпочтительном варианте осуществления, KD между антителом по изобретению и антигенным полипептидом или белком ниже, чем 10-9 M. В более предпочтительном варианте осуществления, KD между антителом по изобретению и антигенным полипептидом или белком ниже, чем 10-10 M. В более предпочтительном варианте осуществления, KD между антителом по изобретению и антигенным полипептидом или белком ниже, чем 10-11 M. В более предпочтительном варианте осуществления, KD между антителом по изобретению и антигенным полипептидом или белком ниже, чем 10-12 M.

В другом аспекте изобретение относится к применению антитела по изобретению в клеточном анализе с усилением сигнала для расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий.

В одном варианте осуществления, применение представляет собой применение in vitro или ex vivo.

В другом аспекте изобретение относится к способу определения расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий в клетке, включающему:

a) приведение клетки в контакт с нейротоксином клостридий в условиях, подходящих для активности нейротоксина клостридий;

b) приведение цитоплазматического содержимого указанной клетки в контакт с первым антителом для детекции к C-концевому продукту расщепления VAMP после расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий в условиях, подходящих для связывания первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP, где указанное первое антитело для детекции представляет собой антитело по изобретению; и

c) детекцию пригодными способами связывания указанного первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP.

В одном варианте осуществления, способ по изобретению дополнительно включает d) количественную оценку пригодными способами количества C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с указанным первым антителом для детекции.

В одном варианте осуществления способа по изобретению, стадия b) включает приведение цитоплазматического содержимого указанной клетки в контакт с вторым антителом для детекции против полноразмерного VAMP в условиях, подходящих для связывания указанного второго антитела для детекции с полноразмерным VAMP; стадия c) включает детекцию пригодными способами связывания второго антитела для детекции с полноразмерным VAMP, и стадия d) включает количественную оценку пригодными способами количества полноразмерного VAMP, связанного с указанным вторым антителом для детекции.

В одном варианте осуществления, способ представляет собой способ in vitro или ex vivo.

Специалисту в данной области понятно, что увеличение количества C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с первым антителом, и/или уменьшение количества полноразмерного VAMP, связанного с вторым антителом для детекции, являются показателями увеличения расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий.

В одном варианте осуществления, второе антитело для детекции является таким же, как первое антитело для детекции, и связывается с C-концевым продуктом расщепления VAMP и с полноразмерным VAMP.

В альтернативном варианте осуществления, второе антитело для детекции отличается от указанного первого антитела для детекции и связывается с полноразмерным VAMP, но не с C-концевым продуктом расщепления VAMP. Подходящим образом, второе антитело для детекции связывается с эпитопом VAMP, находящимся с N-конца от участка расщепления нейротоксином клостридий. Примеры пригодных антител включают коммерчески доступные антитела, такие как ab3347 (Abcam) или ab181869 (Abcam).

В конкретном варианте осуществления, способ определения расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий в клетке включает:

a) приведение клетки в контакт с нейротоксином клостридий в условиях, подходящих для активности нейротоксина клостридий;

b) приведение цитоплазматического содержимого указанной клетки в контакт с

• первым антителом для детекции к C-концевому продукту расщепления VAMP после расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий в условиях, подходящих для связывания первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP, где указанное первое антитело для детекции представляет собой антитело по изобретению, которое связывается с C-концевым продуктом расщепления VAMP и с полноразмерным VAMP; и с

• вторым антителом для детекции, которое связывается с полноразмерным VAMP, но не с C-концевым продуктом расщепления VAMP;

c) детекцию пригодными способами

• связывания первого антитела с C-концевым продуктом расщепления VAMP и с полноразмерным VAMP; и

• связывания второго антитела для детекции с полноразмерным VAMP; и

d) количественную оценку пригодными способами:

• объединенного количества C-концевого продукта расщепления VAMP и полноразмерного VAMP, связанных с первым антителом для детекции; и

• количества полноразмерного VAMP, связанного с вторым антителом для детекции.

Специалисту в данной области понятно, что уменьшение количества полноразмерного VAMP, связанного с вторым антителом для детекции, и отсутствие изменений объединенного количества полноразмерного VAMP и C-концевого продукта расщепления VAMP, связанных с первым антителом для детекции, является показателем расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий.

В другом конкретном варианте осуществления, способ определения расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий в клетке включает:

a) приведение клетки в контакт с нейротоксином клостридий в условиях, подходящих для активности нейротоксина клостридий;

b) приведение цитоплазматического содержимого указанной клетки в контакт с первым антителом для детекции к C-концевому продукту расщепления VAMP после расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий в условиях, подходящих для связывания первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP, где указанное первое антитело для детекции представляет собой антитело по изобретению, которое связывается с C-концевым продуктом расщепления VAMP и с полноразмерным VAMP;

c) детекцию пригодными способами

• связывания первого антитела с C-концевым продуктом расщепления VAMP; и

• связывания первого антитела для детекции с полноразмерным VAMP;

где сигнал, образованный в результате связывания первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP, можно отличать от сигнала, образованного в результате связывания первого антитела для детекции с полноразмерным VAMP; и

d) количественную оценку пригодными способами:

• количества C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с первым антителом для детекции; и

• количества полноразмерного VAMP, связанного с первым антителом для детекции.

Специалисту в данной области понятно, что увеличение количества C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с первым антителом, и уменьшение количества полноразмерного VAMP, связанного с первым антителом для детекции, являются показателями увеличения расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий.

В другом аспекте изобретение относится к способу определения иммунной устойчивости к расщепляющему VAMP нейротоксину клостридий у пациента, включающему:

a) добавление расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий к тестируемому образцу, полученному от пациента;

b) приведение клетки в контакт с тестируемым образцом со стадии a) в условиях, подходящих для активности нейротоксина клостридий;

c) приведение цитоплазматического содержимого указанной клетки в контакт с первым антителом для детекции к C-концевому продукту расщепления VAMP после расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий в условиях, подходящих для связывания первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP, где указанное первое антитело для детекции представляет собой антитело по изобретению;

d) детекцию пригодными способами связывания указанного первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP;

e) количественную оценку количества C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с первым антителом для детекции;

f) повторение стадий a) - e) с отрицательным контрольным образцом вместо тестируемого образца; и

g) сравнение количества C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с указанным первым антителом для детекции, на стадиях (e) и (f), где детекция более низкого количества C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с указанным первым антителом для детекции, на стадии (e) по сравнению с количеством C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с указанным первым антителом для детекции на стадии (f), является показателем присутствия нейтрализующих антител против расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий.

В одном варианте осуществления, стадия f) дополнительно включает повторение стадий a) - e) с положительным контрольным образцом.

В рамках изобретения, термин «нейтрализующие антитела против расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий» обозначает любое антитело, которое может, в физиологических условиях, связываться с областью расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий таким образом, чтобы уменьшать или предотвращать проявление расщепляющим VAMP нейротоксином клостридий его терапевтического эффекта у пациента.

В одном варианте осуществления, пациент представляет собой млекопитающее. В предпочтительном варианте осуществления, пациент представляет собой человека.

В одном варианте осуществления, образец выбран из крови, плазмы, сыворотки и лимфатической жидкости, полученной от пациента.

Тестируемый образец можно получать от пациента до воздействия расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий, после однократной обработки расщепляющим VAMP нейротоксином клостридий или после многократных обработок расщепляющим VAMP нейротоксином клостридий. В конкретном варианте осуществления, тестируемый образец происходит от пациента, который является устойчивым к обработке расщепляющим VAMP нейротоксином клостридий.

В рамках изобретения, термин «контрольный образец» означает любой образец, в котором присутствие или отсутствие тестируемого образца является известным, и включает как отрицательные, так и положительные контрольные образцы. Применительно к нейтрализующим антителам против расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий, отрицательный контрольный образец может быть получен от индивидуума, который никогда не подвергался воздействию расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий, и может включать, без ограничения, образец от того же самого индивидуума, предоставившего тестируемый образец, но полученный до подвергания обработки расщепляющим VAMP нейротоксином клостридий; образец, полученный от другого индивидуума, никогда не подвергавшегося воздействию расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий; пулированный образец, полученный от множества различных индивидуумов, никогда не подвергавшихся воздействию расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий.

Применительно к нейтрализующим антителам против расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий, положительный контрольный образец может быть получен от индивидуума, который проявляет иммунную устойчивость к расщепляющему VAMP нейротоксину клостридий, и включает, без ограничения, индивидуума, тестированного как положительный в анализах, основанных на тестировании пациентов; индивидуума, тестированного как положительный в биологическом анализе in vivo; и индивидуума, для которого показан гипериммунитет, например, пациента, вакцинированного против расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий.

В одном варианте осуществления, способ представляет собой способ in vitro или ex vivo.

В одном варианте осуществления способа определения иммунной устойчивости, стадия c) включает приведение цитоплазматического содержимого указанной клетки в контакт с вторым антителом для детекции против полноразмерного VAMP в условиях, подходящих для связывания указанного второго антитела для детекции с полноразмерным VAMP; стадия d) включает детекцию пригодными способами связывания второго антитела для детекции с полноразмерным VAMP, и стадия e) включает количественную оценку количества полноразмерного VAMP, связанного с указанным вторым антителом для детекции.

В одном варианте осуществления, второе антитело для детекции является таким же, как первое антитело для детекции, и связывается с C-концевым продуктом расщепления VAMP и с полноразмерным VAMP.

В альтернативном варианте осуществления, второе антитело для детекции является отличным от указанного первого антитела для детекции, и связывается с полноразмерным VAMP, но не с C-концевым продуктом расщепления VAMP. Подходящим образом, второе антитело для детекции связывается с эпитопом VAMP, который находится с N-конца от участка расщепления нейротоксином клостридий. Примеры пригодных антител включают коммерчески доступные антитела, такие как ab3347 (Abcam) или ab181869 (Abcam).

В конкретном варианте осуществления, способ определения иммунной устойчивости к расщепляющему VAMP нейротоксину клостридий у пациента включает:

a) добавление расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий к тестируемому образцу, полученному от пациента;

b) приведение клетки в контакт с тестируемым образцом со стадии a) в условиях, подходящих для активности нейротоксина клостридий;

c) приведение цитоплазматического содержимого указанной клетки в контакт с

• первым антителом для детекции к C-концевому продукту расщепления VAMP после расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий в условиях, подходящих для связывания первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP, где указанное первое антитело для детекции представляет собой антитело по изобретению, которое связывается с C-концевым продуктом расщепления VAMP и с полноразмерным VAMP; и с

• вторым антителом для детекции, которое связывается с полноразмерным VAMP, но не с C-концевым продуктом расщепления VAMP;

d) детекцию пригодными способами

• связывания первого антитела с C-концевым продуктом расщепления VAMP и с полноразмерным VAMP; и

• связывания второго антитела для детекции с полноразмерным VAMP;

e) количественную оценку

• объединенного количества C-концевого продукта расщепления VAMP и полноразмерного VAMP, связанного с первым антителом для детекции; и

• количества полноразмерного VAMP, связанного с вторым антителом для детекции;

f) повторение стадий a) - e) с отрицательным контрольным образцом вместо тестируемого образца; и

g) сравнение количества C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с указанным первым антителом для детекции, на стадиях (e) и (f), где детекция более низкого объединенного количества C-концевого продукта расщепления VAMP и полноразмерного VAMP, связанного с первым антителом для детекции, и/или более высокого количества полноразмерного VAMP, связанного с вторым антителом для детекции на стадии (e), по сравнению с соответствующими количествами на стадии (f), является показателем присутствия нейтрализующих антител против расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий.

В другом конкретном варианте осуществления, способ определения иммунной устойчивости к расщепляющему VAMP нейротоксину клостридий у пациента включает:

a) добавление расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий к тестируемому образцу, полученному от пациента;

b) приведение клетки в контакт с тестируемым образцом со стадии a) в условиях, подходящих для активности нейротоксина клостридий;

c) приведение цитоплазматического содержимого указанной клетки в контакт с первым антителом для детекции к C-концевому продукту расщепления VAMP после расщепления VAMP посредством расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий в условиях, подходящих для связывания первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP, где указанное первое антитело для детекции представляет собой антитело по изобретению, которое связывается с C-концевым продуктом расщепления VAMP и с полноразмерным VAMP;

d) детекцию пригодными способами

• связывания первого антитела с C-концевым продуктом расщепления VAMP и с полноразмерным VAMP; и

• связывания первого антитела для детекции с полноразмерным VAMP;

где сигнал, образованный в результате связывания первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP, можно отличать от сигнала, образованного в результате связывания первого антитела для детекции с полноразмерным VAMP;

e) количественную оценку

• количества C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с первым антителом для детекции; и

• количества полноразмерного VAMP, связанного с первым антителом для детекции;

f) повторение стадий a) - e) с отрицательным контрольным образцом вместо тестируемого образца; и

g) сравнение количества C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с указанным первым антителом для детекции, на стадиях (e) и (f), где детекция более низкого количества C-концевого продукта расщепления VAMP, связанного с указанным первым антителом для детекции, и/или более высокого количества полноразмерного VAMP, связанного с первым антителом для детекции на стадии (e), по сравнению с соответствующими количествами на стадии (f), является показателем присутствия нейтрализующих антител против расщепляющего VAMP нейротоксина клостридий.

В рамках изобретения, «расщепляющий VAMP нейротоксин клостридий» обозначает нейротоксин клостридий, который связывается с рецептором на клетке-мишени, транслоцирует в цитозоль легкую цепь (L) клостридий, которая, в свою очередь, протеолитически расщепляет VAMP, таким образом, нарушая секрецию молекул посредством везикулярного транспорта, осуществляемого клеткой.

Предпочтительно, в способах или применении по изобретению, расщепляющий VAMP нейротоксин клостридий содержит легкую цепь BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X или TeNT. Подходящим образом, легкая цепь BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X или TeNT содержит последовательность, выбранную из:

- аминокислотных остатков 1-441 из SEQ ID NO: 2 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно, по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности последовательности с ними,

- аминокислотных остатков 1-442 из SEQ ID NO: 4 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности последовательности с ними,

- аминокислотных остатков 1-439 из SEQ ID NO: 6 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности последовательности с ними,

- аминокислотных остатков 1-446 из SEQ ID NO: 7 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности последовательности с ними,

- аминокислотных остатков 1-439 из SEQ ID NO: 41 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности последовательности с ними, и

- аминокислотных остатков 1-456 из SEQ ID NO: 8 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности последовательности с ними.

Понятно, что легкая цепь BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X или TeNT, как описано в настоящем описании, имеет способность расщеплять VAMP.

В одном варианте осуществления способов или применений по изобретению, расщепляющий VAMP нейротоксин клостридий выбран из BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X и TeNT. Подходящим образом, BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X или TeNT содержит последовательность, выбранную из:

- SEQ ID NO: 2 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности последовательности с ней,

- SEQ ID NO: 4, или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности последовательности с ней,

- SEQ ID NO: 6 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности последовательности с ней,

- SEQ ID NO: 7 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности последовательности с ней,

- SEQ ID NO: 41 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности последовательности с ней, и

- SEQ ID NO: 8 или полипептидной последовательности, имеющей по меньшей мере 70%, предпочтительно по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичности последовательности с ней.

Понятно, что нейротоксин клостридий BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X или TeNT, как описано в настоящем описании, имеет способность связываться с рецептором на клетке-мишени, транслоцировать легкую цепь клостридий в цитозоль и расщеплять VAMP.

В одном варианте осуществления, расщепляющий VAMP нейротоксин клостридий представляет собой мозаичный нейротоксин. Термин «мозаичный нейротоксин», как используют в этом контексте, относится к природному нейротоксину клостридий, который содержит по меньшей мере один функциональный домен из другого типа нейротоксинов клостридий (например, нейротоксина клостридий другого серотипа), где нейротоксин клостридий обычно не содержит указанный по меньшей мере один функциональный домен. Примерами природных расщепляющих VAMP мозаичных нейротоксинов являются BoNT/DC и BoNT/FA. BoNT/DC содержит L-цепь и домен HN серотипа D, и домен HC серотипа C Nakamura K, et al. «Characterization of the D/C mosaic neurotoxin produced by Clostridium botulinum associated with bovine botulism in Japan». Vet. Microbiol. (2010): 140:147-154., в то время как BoNT/FA состоит из легкой цепи BoNT/F5, домена HN, близко родственного подтипу F1, и домена HC BoNT/A1 (Pellett, Sabine, et al. «Purification and Characterization of Botulinum Neurotoxin FA from a Genetically Modified Clostridium botulinum Strain». mSphere 1.1 (2016): e00100-15).

В одном варианте осуществления, расщепляющий VAMP нейротоксин клостридий представляет собой мозаичный нейротоксин, выбранный из BoNT/DC и BoNT/FA.

В одном варианте осуществления, расщепляющий VAMP нейротоксин клостридий представляет собой химерный нейротоксин. Термин «химерный нейротоксин», в рамках изобретения, обозначает нейротоксин, содержащий один или несколько доменов, происходящих из первого нейротоксина, и один или несколько доменов, происходящих из второго нейротоксина. Например, химерный нейротоксин может содержать домен LHN, происходящий из первого нейротоксина, и домен HC, происходящий из второго нейротоксина. Другим примером химерного нейротоксина является нейротоксин, содержащий домен LHNHCN, происходящий из первого нейротоксина, и домен HCC, происходящий из второго нейротоксина. Примеры химерных нейротоксинов представлены в GB1607901.4 (еще не опубликовано), содержание которого приведено в настоящем описании в качестве ссылки.

В одном варианте осуществления, расщепляющий VAMP нейротоксин клостридий представляет собой химерный нейротоксин, содержащий:

- легкую цепь (L) из BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X или TeNT,

- домен HN из BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X или TeNT,

- домен HCN из BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X или TeNT,

- домен HCC из BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X или TeNT, и

при этом по меньшей мере два из доменов происходят из различных нейротоксинов клостридий.

В одном варианте осуществления, расщепляющий VAMP нейротоксин клостридий представляет собой химерный нейротоксин, содержащий:

- домен LHN из первого нейротоксина клостридий, выбранного из BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X или TeNT,

- домен HCNHCC из второго нейротоксина клостридий, выбранного из BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X или TeNT,

где первый и второй нейротоксины клостридий являются различными.

В одном варианте осуществления, расщепляющий VAMP нейротоксин клостридий представляет собой химерный нейротоксин, содержащий:

- домен LHNHCN из первого нейротоксина клостридий, выбранного из BoNT/B, BoNT/D, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X или TeNT,

- домен HCC из второго нейротоксина клостридий, выбранного из BoNT/A, BoNT/B, BoNT/C, BoNT/D, BoNT/E, BoNT/F, BoNT/G, BoNT/X или TeNT

где первый и второй нейротоксины клостридий являются различными.

Расщепляющий VAMP нейротоксин клостридий может представлять собой модифицированный нейротоксин или его производное, включая, но без ограничения, нейротоксины, описанные ниже. Модифицированный нейротоксин или его производное может содержать одну или несколько аминокислот, модифицированных по сравнению с нативной (немодифицированной) формой нейротоксина, или может содержать одну или несколько вставленных аминокислот, которые не присутствуют в нативной (немодифицированной) форме токсина. В качестве примера, модифицированный нейротоксин клостридий может иметь модифицированные аминокислотные последовательности в одном или нескольких доменах относительно нативной (немодифицированной) последовательности нейротоксина клостридий. Такие модификации могут модифицировать функциональные аспекты нейротоксина, например, биологическую активность или персистенцию.

Модифицированный расщепляющий VAMP нейротоксин клостридий, как описано в настоящем описании, сохраняет способность связываться с рецептором на клетке-мишени, для транслокации легкой цепи в цитоплазму клетки и расщепления VAMP.

Модифицированный расщепляющий VAMP нейротоксин клостридий может иметь одну или несколько модификаций в аминокислотной последовательности тяжелой цепи (такой как модифицированный домен HC), где указанная модифицированная тяжелая цепь связывается с нервными клетками-мишенями с более высокой или более низкой аффинностью, чем нативный (немодифицированный) нейротоксин. Такие модификации в домене HC могут включать модификацию остатков в участке связывания ганглиозида или в участке связывания белкового рецептора домена HCC, которые изменяют связывание с ганглиозидным рецептором и/или белковым рецептором в нервной клетке-мишени. Примеры таких модифицированных нейротоксинов описаны в WO 2006/027207 и WO 2006/114308, полное содержание обеих из которых, таким образом, приведено в качестве ссылки. Например, домен HCC из нейротоксина BoNT/B содержит по меньшей мере одну замену, добавку или делецию аминокислотного остатка, которая оказывает эффект увеличения аффинности связывания домена HCC BoNT/B для Syt II человека по сравнению с природной последовательностью HCC BoNT/B. Пригодные замена, добавка или делеция аминокислотного остатка в субдомене HCC BoNT/B описаны в WO2013/180799 и в PCT/US2016/024211, которые еще не опубликованы (содержание обеих из которых приведено в качестве ссылки). Пригодные замена, добавка или делеция аминокислотного остатка в субдомене HCC включают мутации замены, выбранные из группы, состоящей из: V1118M; Y1183M; E1191M; E1191I; E1191Q; E1191T; S1199Y; S1199F; S1199L; S1201V; E1191C, E1191V, E1191L, E1191Y, S1199W, S1199E, S1199H, W1178Y, W1178Q, W1178A, W1178S, Y1183C, Y1183P и их комбинаций.

В одном варианте осуществления, расщепляющий VAMP нейротоксин клостридий представляет собой перенацеленный нейротоксин. Термин «перенацеленный нейротоксин» (также обозначаемый как «нацеленные на мишень ингибиторы секреции», «TSI», «TVEMP» или «TEM»), в рамках изобретения, обозначает нейротоксин клостридий, содержащий нацеливающую группу (TM), которая связывается с не родственным клостридиям рецептором. TM может заменять, частично или полностью, домен HC или HCC тяжелой цепи нейротоксина клостридий. Примеры перенацеленных нейротоксинов описаны в WO96/33273, WO98/07864, WO00/10598, WO01/21213, WO01/53336; WO02/07759 WO2005/023309, WO2006/026780, WO2006/099590, WO2006/056093, WO2006/059105, WO2006/059113, WO2007/138339, WO2007/106115, WO2007/106799, WO2009/150469, WO2009/150470, WO2010/055358, WO2010/020811, WO2010/138379, WO2010/138395, WO2010/138382, WO2011/020052, WO2011/020056, WO2011/020114, WO2011/020117, WO2011/20119, WO2012/156743, WO2012/134900, WO2012/134897, WO2012/134904, WO2012/134902, WO2012/135343, WO2012/135448, WO2012/135304, WO2012/134902, WO2014/033441, WO2014/128497, WO2014/053651, WO2015/004464, содержание всех из которых приведено в настоящем описании в качестве ссылки.

Примеры клеток, пригодных для использования в способах или применениях по изобретению, включают прокариотическую клетку, например, клетку E. coli, клетку дрожжей, клетку насекомого, клетку животного, клетку млекопитающего, клетку человека, клетку мыши, клетку примата и/или нейрональную клетку. Предпочтительно, клетка представляет собой нейрональную клетку, в частности, клетки с высокой чувствительностью к BoNT,

Клетка с высокой чувствительностью к BoNT представляет собой клетку, которая является чувствительной к интоксикации BoNT. В некоторых вариантах осуществления, клетка с высокой чувствительностью к BoNT представляет собой клетку, которая является чувствительной к интоксикации посредством, например, приблизительно 500 пМ или менее, приблизительно 400 пМ или менее, приблизительно 300 пМ или менее, приблизительно 200 пМ или менее, приблизительно 100 пМ или менее, приблизительно 90 пМ или менее, приблизительно 80 пМ или менее, приблизительно 70 пМ или менее, приблизительно 60 пМ или менее, приблизительно 50 пМ или менее, приблизительно 40 пМ или менее, приблизительно 30 пМ или менее, приблизительно 20 пМ или менее, приблизительно 10 пМ или менее, приблизительно 9 пМ или менее, приблизительно 8 пМ или менее, приблизительно 7 пМ или менее, приблизительно 6 пМ или менее, приблизительно 5 пМ или менее, приблизительно 4 пМ или менее, приблизительно 3 пМ или менее, приблизительно 2 пМ или менее, приблизительно 1 пМ или менее, приблизительно 0,9 пМ или менее, приблизительно 0,8 пМ или менее, приблизительно 0,7 пМ или менее, приблизительно 0,6 пМ или менее, приблизительно 0,5 пМ или менее, приблизительно 0,4 пМ или менее, приблизительно 0,3 пМ или менее, приблизительно 0,2 пМ, приблизительно 0,1 пМ или менее, приблизительно 90 фМ или менее, приблизительно 80 фМ или менее, приблизительно 70 фМ или менее, приблизительно 60 фМ или менее, приблизительно 50 фМ или менее, приблизительно 40 фМ или менее, приблизительно 30 фМ или менее, приблизительно 20 фМ или менее, или приблизительно 10 фМ или менее BoNT.

Предпочтительно, клетка имеет высокую чувствительность (как определено выше) к расщепляющему VAMP BoNT.

В одном варианте осуществления, клетка представляет собой первичную нейрональную клетку с высокой чувствительностью к BoNT, например, кортикальные нейроны, гиппокампальные нейроны и/или нейроны спинного мозга. Например, клетка представляет собой кортикальный нейрон крысы.

В одном варианте осуществления, клетка происходит из линии нейрональных клеток с высокой чувствительностью к BoNT, например, BE(2)-M17, Kelly, LA1-55n, N1 E-115, N4TG3, N18, Neuro-2a, NG108-15, PC12, SH-SY5Y, SiMa и/или SK-N-BE(2)-C.

В одном варианте осуществления, клетка представляет собой нейрональную клетку, происходящую из стволовой клетки, в частности, из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки (клетки iPS), например, нейроны i-Cell® Neurons, дофаминергические нейроны i-Cell® DopaNeurons, глутаматергические нейроны iCell Glutamatergic Neurons, двигательные нейроны iCell MotoNeurons (Cellular dynamics Inc), кортикальные нейроны головного мозга, нервные стволовые клетки (Axol Biosciences), нейроны Peri.4U neurons, CNS.4U neurons, Dopa.4UNeurons (Axiogenesis), клетки MNP (Lonza), кортикальные нейроны, двигательные нейроны (iStem) и/или происходящие из iPSC нервные клетки (MTI-GlobalStem).

В одном варианте осуществления, клетку можно модифицировать посредством рекомбинантной технологии для экспрессии высоких уровней VAMP, такого как VAMP1, VAMP2 VAMP3, VAMP4, VAMP5 и/или YKT6, более предпочтительно VAMP1, VAMP2 и/или VAMP3.

В одном варианте осуществления, в котором расщепляющий VAMP нейротоксин представляет собой BoNT/B, BoNT/DC или BoNT/G, клетка экспрессирует высокие уровни синаптотагмина I и/или синаптотагмина II (Syt I/Syt II). В одном варианте осуществления, в котором расщепляющий VAMP нейротоксин представляет собой BoNT/B, BoNT/D-C или BoNT/G, клетку модифицируют посредством рекомбинантной технологии для экспрессии высоких уровней синаптотагмина I и/или синаптотагмина II (Syt I/Syt II).

В одном варианте осуществления, в котором расщепляющий VAMP нейротоксин представляет собой BoNT/FA, BoNT/F, BoNT/D или TeNT, клетка экспрессирует высокие уровни белка синаптических везикул (SV2). В одном варианте осуществления, в котором расщепляющий VAMP нейротоксин представляет собой BoNT/FA, BoNT/F, BoNT/D или TeNT, клетку модифицируют посредством рекомбинантной технологии для экспрессии высоких уровней белка синаптических везикул (SV2).

В рамках изобретения, «условия, подходящие для активности нейротоксина клостридий», относятся к условиям (например, температуре, pH, кофакторам и т.д.), в которых нейротоксин клостридий может связываться с рецептором нейротоксина клостридий, присутствующим на мембране клетки, транслоцировать легкую цепь нейротоксина клостридий в цитоплазму клетки и расщеплять VAMP.

В одном варианте осуществления способов по изобретению, условия, подходящие для активности нейротоксина клостридий, могут включать инкубацию при приблизительно 37°C в течение периода от приблизительно 1 часа до приблизительно 48 часов. В одном варианте осуществления способа по изобретению, условия, подходящие для активности нейротоксина клостридий, могут включать инкубацию при приблизительно 37°C в течение периода от приблизительно 2 часов до приблизительно 36 часов. В одном варианте осуществления способа по изобретению, условия, подходящие для активности нейротоксина клостридий, могут включать инкубацию при приблизительно 37°C в течение периода от приблизительно 4 часов до приблизительно 24 часов.

Например, условия, подходящие для активности нейротоксина клостридий, могут включать инкубацию при 37°C в течение 24 часов.

В рамках изобретения, «условия, подходящие для связывания первого антитела для детекции с расщепленным VAMP», и «условия, подходящие для связывания второго антитела для детекции с полноразмерным VAMP», относятся к условиям (например, температуре, pH, кофакторам и т.д.), в которых первое и/или второе антитело для детекции может связываться с расщепленным VAMP и/или полноразмерным VAMP.

В одном варианте осуществления способа по изобретению, условия, подходящие для связывания антитела, могут включать инкубацию при приблизительно 4°C в течение периода от приблизительно 8 часов до приблизительно 48 часов. В одном варианте осуществления способа по изобретению, условия, подходящие для связывания антитела, могут включать инкубацию при приблизительно 4°C в течение периода от приблизительно 10 часов до приблизительно 24 часов. В одном варианте осуществления способа по изобретению, условия, подходящие для связывания антитела, могут включать инкубацию при приблизительно 4°C в течение периода от приблизительно 12 часов до приблизительно 16 часов.

В одном варианте осуществления способа по изобретению, условия, подходящие для связывания антитела, могут включать инкубацию при приблизительно 25°C в течение периода от приблизительно 30 минут до приблизительно 8 часов. В одном варианте осуществления способа по изобретению, условия, подходящие для связывания антитела, могут включать инкубацию при приблизительно 25°C в течение периода от приблизительно 1 часа до приблизительно 4 часов. В одном варианте осуществления способа по изобретению, условия, подходящие для связывания антитела, могут включать инкубацию при приблизительно 25°C в течение периода от приблизительно 1,5 часов до приблизительно 3 часов.

Способы, пригодные для детекции и количественной оценки связывания антитела для детекции с расщепленным или полноразмерным VAMP, хорошо известны в данной области. Например, связывание антитела для детекции с расщепленным или полноразмерным VAMP можно детектировать и количественно оценивать посредством Вестерн-блоттинга. Поскольку каждый белок продвигается в соответствии со специфической молекулярной массой при SDS-PAGE, расщепленный VAMP можно детектировать в соответствии с более низкими молекулярными массами, чем полноразмерный VAMP. Анализ полос посредством денситометрии позволяет считывание процента расщепления с использованием как полноразмерной полосы, так и расщепленной полосы, внутри одной и той же дорожки в геле. Альтернативно, расщепление VAMP можно детектировать и количественно оценивать с использованием твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), например, сэндвич-ELISA.

В одном варианте осуществления способов по изобретению, первое антитело для детекции представляет собой поликлональное антитело, и связывание первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP детектируют и количественно оценивают в твердофазном иммуноферментном анализе.

В одном варианте осуществления способов по изобретению, первое антитело для детекции представляет собой поликлональное антитело, и связывание первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP детектируют и количественно оценивают в анализе Вестерн-блоттинга.

В одном варианте осуществления способов по изобретению, первое антитело для детекции представляет собой моноклональное антитело, и связывание первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP детектируют и количественно оценивают в твердофазном иммуноферментном анализе.

В одном варианте осуществления способов по изобретению, первое антитело для детекции представляет собой моноклональное антитело, и связывание первого антитела для детекции с C-концевым продуктом расщепления VAMP детектируют и количественно оценивают в анализе Вестерн-блоттинга.

В одном варианте осуществления способов по изобретению, клетку лизируют перед приведением ее цитоплазматического содержимого в контакт с антителом(антителами) для детекции.

В альтернативном варианте осуществления способов по изобретению, клетку подвергают пермеабилизации перед приведением ее цитоплазматического содержимого в контакт с антителом(антителами) для детекции.

В другом аспекте изобретение относится к набору, содержащему клетку, которая является чувствительной к интоксикации расщепляющим VAMP нейротоксином; и первое антитело для детекции против расщепленного VAMP, где указанное первое антитело для детекции представляет собой антитело по изобретению.

В одном варианте осуществления, набор дополнительно содержит второе антитело для детекции, которое связывается с полноразмерным VAMP, но не с C-концевым продуктом расщепления VAMP. Подходящим образом, второе антитело для детекции связывается с эпитопом VAMP, который находится с N-конца от участка расщепления нейротоксином клостридий. Примеры пригодных антител включают коммерчески доступные антитела, такие как ab3347 (Abcam) или ab181869 (Abcam).

Это описание не является ограниченным иллюстративными способами и материалами, описанными в настоящем описании, и любые способы и материалы, сходные или эквивалентные с описанными в настоящем описании, можно использовать в практическом осуществлении или тестировании вариантов осуществления этого описания. Числовые диапазоны включают числа, определяющие диапазон. Если не указано иное, любые последовательности нуклеиновой кислоты записаны слева направо в ориентации от 5'- до 3'-; аминокислотные последовательности записаны слева направо в ориентации от амино- до карбокси-конца, соответственно.

Когда представлен диапазон значений, понятно, что каждое промежуточное значение, до десятых единицы нижнего предела, если контекст явно не требует иного, между верхним и нижним пределами этого диапазона, также конкретно описано. Каждый меньший диапазон между любым указанным значением или промежуточным значением в указанном диапазоне и любое другое указанное или промежуточное значение в этом указанном диапазоне включены в это описание. Верхний и нижний пределы этих меньших диапазонов можно независимо включать или исключать из диапазона, и каждый диапазон, в котором любой, никакой или оба предела включены в меньшие диапазоны, также включены в это описание, с учетом любого конкретно исключенного предела в указанном диапазоне. Когда указанный диапазон включает один или оба из пределов, диапазоны, исключающие любой один или оба из этих включенных пределов, также включены в это описание.

Следует отметить что, в рамках изобретения и в прилагаемой формуле изобретения, неконкретизированные и конкретизированные формы единственного числа включают ссылки на множественное число, если контекст явно не требует иного. Таким образом, например, ссылка на «нейротоксин клостридий» включает множество таких средств-кандидатов, и ссылка на «нейротоксин клостридий» включает ссылку на один или несколько нейротоксинов клостридий и их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и т.д.

Изобретение в настоящее время описано, только в качестве примера, применительно к следующим фигурам и примерам.

ФИГУРЫ

Фигура 1 - Последовательности VAMP с участками расщепления нейротоксином клостридий. (A) последовательности VAMP1, VAMP2 и VAMP3 человека и крысы с участками расщепления BoNT/F5 и BoNT/FA, BoNT/F, BoNT/D и BoNT/DC, BoNT/B, BoNT/G, TeNT и BoNT/X. (B) последовательности VAMP4, VAMP5 и YKT6 человека и крысы с участками расщепления BoNT/X.

Фигура 2 - Последовательности VAMP с эпитопами Ab (т.е. областями иммуногенных эпитопов) и участками расщепления BoNT/F, BoNT/D и BoN/B. Последовательности VAMP1, VAMP2 и VAMP3 человека и крысы показаны для сравнения. Последовательности VAMP2 человека и крысы являются идентичными в выбранных областях эпитопов. Участки расщепления указаны стрелками: точки расщепления VAMP2 для BoNT/F и BoNT/D локализованы на соседних аминокислотах, Q58-K59 и K59-L60 соответственно, в то время как точка расщепления для BoNT/B локализована на аминокислотах Q76-F77 (на основании положения аминокислоты в последовательности VAMP2 человека).

Фигура 3 - Бесклеточное расщепление рекомбинантного VAMP2-GFP с использованием MBP-LF и LHND. Рекомбинантный VAMP2-GFP инкубировали с 0,01 мкг/мкл LHND или MBP-LF в течение 1 час при 37°C. Добавляли равные объемы буфера для образцов, и 0,5 мкг (Кумасси) и 0,3 мкг (блоты) белка разделяли посредством SDS-PAGE и либо окрашивали с использованием Кумасси, либо подвергали блоттингу с использованием различных антител против VAMP2. Рисунок показывает локализацию эпитопов антитела. Представление рекомбинантного белка и линейная длина эпитопов приведены не в масштабе. 1 - BSA, 2 - VAMP2-GFP, 3 - Расщепленный VAMP2-GFP (ак.59/60-конец), 4 - Расщепленный VAMP2-GFP (ак.1-58/59).

Фигура 4 - Расщепление VAMP in vitro после обработки BoNT/F и BoNT/D. Кортикальные нейроны крысы, выращенные в 96-луночных планшетах до DIV18-21, обрабатывали в течение 24 часов с использованием либо BoNT/F (A), либо BoNT/D (B). Лизаты разделяли посредством SDS-PAGE и подвергали блоттингу с использованием полученных на заказ антител против VAMP2: против Pep1, против Pep2 или против Pep3, или с использованием коммерческого антитела ab181869. 1 - полноразмерный VAMP2, 2 - расщепленный VAMP2. Данные для антитела против pep 2 показывают зависимое от дозы исчезновение полноразмерного VAMP2 и появление расщепленного фрагмента с более низкой молекулярной массой. Сигналы обеих полос использовали для количественной оценки зависимого от дозы процента расщепления VAMP2 посредством BoNT/F (C) и BoNT/D (D).

Фигура 5 - (A) Кортикальные нейроны крысы обрабатывали природным BoNT/F1 (≤),природным BoNT/A1 (•) или рекомбинантным BoNT/FA (Δ) в течение 24 часов. Клетки лизировали, разделяли посредством SDS-PAGE и подвергали блоттингу по расщеплению VAMP-2 или SNAP-25. Процент расщепления SNARE определяли по соотношению полноразмерного к расщепленному белку посредством денситометрического анализа. Соответствие данных определяли с использованием четырех-параметрического логистического уравнения, и определяли концентрацию BoNT, необходимую для 50% от максимального расщепления SNARE (pEC50) (B). Данные представляют собой среднее±s.e.m. (n=3 (BoNT/F1 и BoNT/A1) или 4 (BoNT/FA) независимых эксперимента в трех повторах).

Фигура 6 - Расщепление VAMP in vitro после обработки BoNT/B и BoNT/F. Кортикальные нейроны крысы, выращиваемые до DIV18-21, обрабатывали в течение 24 часов с использованием либо BoNT/F, либо BoNT/B. Лизаты разделяли посредством SDS-PAGE и подвергали блоттингу с использованием нового полученного на заказ антитела против VAMP2 (антитела против Pep4), специфического для расщепления BoNT/B антитела против VAMP2 или антител против Pep1, против Pep2 или против Pep3.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: детекция протеолитического расщепления VAMP посредством BoNT/D и BoNT/F

A - Способы

1. Получение антител

Антитела получали в Eurogentec с использованием 28-суточной быстрой программы производителя (https://secure.eurogentec.com/product/research-anti-protein-28-day-speedy-polyclonal-packages.html?country=gbr). Двух кроликов на пептид иммунизировали с использованием следующих пептидов:

- VAMP PEP1: H2N- SNR RLQ QTQ AQV DEC -CONH2 (SEQ ID NO:39);

- VAMP PEP2: AcNH - KLS ELD DRA DAL Q - CONH2 (SEQ ID NO:15); или

- VAMP PEP3: H2N - CLQ AGA SQ - CONH2 (SEQ ID NO:40).

Животных подвергали первой иммунизации и трем последующим бустер-иммунизациям. Проводили отбор крови до иммунизации, промежуточный отбор и конечный отбор.

2. Расщепление рекомбинантного белка

Активные конструкции, содержащие домен легкой цепи и домен транслокации BoNT/D, или эквивалентные домены BoNT/F, слитые со связывающим мальтозу белком (MPB), получали, как описано ранее (Masuyer et al., «Structure and activity of a functional derivative of Clostridium botulinum neurotoxin B. J Struct Biol», 174, p52-57, 2011; Sutton et al., «Preparation of specifically activatable endopeptidase derivatives of Clostridium botulinum toxins type A, B, and C and their applications». Protein Expression and Purification 40:31-41, 2005). Кратко, либо LHND (SEQ ID NO: 35), либо слитый белок, называемый MBP-LF (SEQ ID NO: 36) (последний представляет собой слитый белок MBP с легкой цепью BoNT/F1 и C-концевым 6-гистидиновым мотивом; MPB и 6-гистидиновый мотив являются общеизвестными аффинными метками), разводили до 0,01 мкг/мкл в буфере для анализа (50 мМ HEPES pH7,2, 200 мкМ ZnCl2, 1 мкг/мкл BSA, 10 мМ DTT). VAMP2-GFP (SEQ ID NO: 37) (слитый белок из аминокислот 2-94 VAMP2 человека и поддающегося детекции маркера зеленого флуоресцентного белка (GFP)) разводили до 8 мкМ в буфере для анализа (50 мМ HEPES pH7,2, 200 мкМ ZnCl2, 1 мкг/мкл BSA, 10 мМ DTT). Равные объемы LHND или MBP-LF и VAMP2-GFP (SEQ ID NO: 37) (8 мкМ) объединяли и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Реакции останавливали посредством добавления 2x восстанавливающего буфер для образцов (буфер для образцов LDS NuPage, 100 мМ DTT).

3. Культура кортикальных нейронов крысы

Кортикальные нейроны крысы получали из эмбрионов крыс CD E17-E18. Разрезанную ткань коры головного мозга собирали в ледяной сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS) без Ca2+ или Mg2+ и затем подвергали диссоциации в растворе папаина в течение 40 минут при 37°C, следуя инструкциям производителя (Worthington Biochemical, NJ, US). Кортикальные клетки рассевали в покрытые поли-L-орнитином (PLO) 96-луночные планшеты при плотности 20000 клеток/лунку в 125 мкл среды Neurobasal, содержащей 2% добавку B27, 0,5 мМ GlutaMAX, 1% фетальную бычью сыворотку (FBS) и 100 ед./мл пенициллина/стрептомицина. Клетки поддерживали при 37°C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2. Дополнительные 125 мкл среды Neurobasal, содержащей 2% B27, 0,5 мМ GlutaMAX, добавляли на DIV (сутки in vitro) 4. Клетки поддерживали посредством замены половины среды два раза в неделю. На DIV 11, 1,5 мкМ цитозин β-D-арабинофуранозид (AraC) добавляли в среду для предотвращения пролиферации не относящихся к нейрональным клеток.

4. Обработка BoNT

Кортикальные нейроны крысы на DIV 18-21 обрабатывали с использованием диапазона концентраций нативного BoNT/F1 (Metabiologics, US) (1 нМ - 0,1 пМ), или BoNT/D (Metabiologics, US) (10 нМ - 1 пМ) в лунках в трех повторах в течение 24 часов при 37°C. Среды удаляли, и клетки промывали один раз с использованием PBS. Клетки лизировали в 40 мкл буфера для образцов LDS (буфер LDS NuPage, 1 мМ DTT, 1:500 бензоназы) в течение 10 минут при комнатной температуре.

5. SDS-PAGE и Вестерн-блоттинг

Лизаты нейронов кипятили при 90°C в течение 5 минут. 15 мкл лизатов загружали на дорожку 12% Bis-Трис-гелей и разделяли в буфере MES при 200 В в течение 50 мин. Белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны посредством Transblot Turbo (Biorad) с использованием программы для низкой MW. Мембраны блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре с использованием 5% обезжиренного молока/PBS-Tween и затем инкубировали с полученными на заказ первичными антителами против VAMP2: против Pep1, против Pep2 или против Pep3, или с коммерческими антителами против VAMP2 (Abcam ab3347 и ab181869), в течение ночи при 4°C. Мембраны промывали 3 раза в PBS-Tween и инкубировали с вторичным антителом против антител кролика с HRP в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембраны промывали 3×5 мин в PBS-Tween, затем проявляли с использованием хемилюминесцентного субстрата SuperSignal West Femto и визуализировали с использованием системы Syngene PXi.

B - Результаты

Оценка детекции рекомбинантного белка

Области трех выбранных пептидных эпитопов из VAMP2 относительно участков расщепления BoNT показаны на фигуре 2. Последовательности VAMP1, VAMP2 и VAMP3 человека и крысы показаны для сравнения. Последовательности VAMP2 человека и крысы являются идентичными в выбранных областях эпитопов. Участки расщепления для BoNT/B и BoNT/D локализованы на соседних аминокислотах.

Первоначально, антитела тестировали в бесклеточном анализе с использованием рекомбинантного VAMP2-GFP. Заменители BoNT/F и BoNT/D (MBP-LF и LHND), содержащие ферментные домены легкой цепи токсина, использовали для расщепления белка VAMP (фигура 3). Кроме того, два других коммерчески доступных антитела против VAMP2 использовали в качестве сравнения; ab3347 (эпитоп ак.1-18) и ab181869 (эпитоп внутри ак.1-100). На фигуре 3 показано, что антитело против Pep1 детектировало полноразмерный VAMP2 и N-концевую расщепленную часть (ак.1-58/59) с сильно уменьшенным сигналом. Как и ожидали, не присутствовало детекции C-концевого продукта расщепления посредством этого антитела, поскольку его эпитоп не локализован в этой части. Антитела против Pep2 и против Pep3 детектировали как полноразмерный белок, так и C-концевые продукты расщепления VAMP2-GFP. Ab3347 детектировало только полноразмерный VAMP2, а не N-концевой фрагмент расщепления, в то время как ab181869 детектировало оба.

Эти первые результаты показывают, что антитела являлись способными детектировать полноразмерный рекомбинантный VAMP2 и ожидаемые продукты его расщепления. Исключением являлось ab3347, которое детектировало только полноразмерный VAMP2, а не N-концевой фрагмент расщепления.

Оценка детекции эндогенного белка

Следующим вопросом являлось то, могут ли эти антитела детектировать какие-либо продукты расщепления в анализе нейрональных клеток, в которых могут присутствовать эндогенные протеазы. Первичные кортикальные нейроны крысы обрабатывали либо BoNT/F, либо BoNT/D, и лизировали для анализа WB (фигура 4). Антитело против Pep1 узнавало только полноразмерный белок, и не присутствовало поддающегося детекции продукта расщепления. Антитело против Pep 2 детектировало как полноразмерный, так и C-концевой продукт расщепления. Для антитела против Pep3 показан слабый сигнал с очень плохой аффинностью для мономера VAMP в лизате клеток, и оно детектировало молекулы с более высокой молекулярной массой, которые, наиболее вероятно, представляли собой димеры и другие белки (данные не представлены). Сигнал для полноразмерного мономера являлся очень низким, однако, присутствовала полоса для расщепленного BoNT/F и BoNT/D C-концевого продукта. Иными словами, антитело против Pep3 не детектировало полноразмерный VAMP, но слабо детектировало расщепленный BoNT/F и BoNT/D C-концевой фрагмент. Это отличалось от более ранних результатов для бесклеточной системы, в которых показан сильный сигнал для полноразмерного и расщепленного рекомбинантного VAMP. Коммерческое антитело Ab3347 не тестировали in vitro из-за отсутствия детекции расщепленного белка в бесклеточном анализе. Несмотря на положительное связывание с N-концевым расщепленным рекомбинантным фрагментом в бесклеточном анализе, коммерческое антитело ab181869 детектировало полноразмерный VAMP2 в лизатах коры головного мозга, но не расщепленный фрагмент в лизатах коры головного мозга. Данные для Pep 2 использовали для количественной оценки зависимого от дозы расщепления VAMP2 посредством BoNT/F (фигура 4C) и BoNT/D (фигура 4D).

Авторы изобретения первоначально показали, что в бесклеточной системе можно детектировать оба продукта расщепления рекомбинантного VAMP. Однако, при переходе к лизату клеток, авторы изобретения показали также, что N-концевой продукт не поддается детекции, однако, в этом случае могут быть вовлечены другие механизмы, помимо деградации, которые еще неизвестны. В отличие от этого, авторы изобретения показали, что C-концевой фрагмент VAMP, который все еще связан с мембраной везикулы, не является деградированным или измененным таким образом, который может предотвращать связывание антитела и детекцию посредством Вестерн-блоттинга. Эпитоп Pep2 является соседним с участком расщепления BoNT/D и BoNT/F, и антитело, полученное против этого пептида, детектирует как полноразмерный VAMP, так и продукт расщепления. В отличие от этого, антитело против Pep3, полученное против более короткого эпитопа вдали от участка расщепления BoNT F/D, также детектирует, хотя и слабо, продукт расщепления.

Пример 2: Детекция протеолитического расщепления VAMP посредством BoNT/FA и BoNT/F1 в кортикальных нейронах крысы

A - Способы

1. Культура кортикальных нейронов крысы

Кортикальные нейроны крысы получали, как подробно описано в примере 1.

2. Обработка BoNT

Кортикальные нейроны крысы на DIV 18-21 обрабатывали с использованием диапазона концентраций (1 пМ - 1 фМ) рекомбинантного BoNT/FA (SEQ ID NO: 38) или диапазона концентраций (1 нМ - 1 пМ) нативного BoNT/F1 (Metabiologics, US), или диапазона концентраций (1 нМ - 1 фМ) нативного BoNT/A1 (List Biological Laboratories Inc., US), в лунках в трех повторах, в течение 24 часов, при 37°C. Среды удаляли, и клетки промывали один раз с использованием PBS. Клетки лизировали в 40 мкл буфера для образцов (буфер LDS NuPage, 1 мМ DTT, 1:500 бензоназы) в течение 10 минут при комнатной температуре.

3. SDS-PAGE и Вестерн-блоттинг кортикальных нейронов крысы

Кортикальные нейроны крысы лизировали в 40 мкл буфера для лизиса (буфер для образцов LDS NuPage, 1 мМ DTT и 1:500 бензоназы) в течение 10 минут при комнатной температуре. Образцы кипятили при 90°C в течение 5 минут, и 15 мкл лизатов загружали на дорожку 12% Bis-Трис-гелей и разделяли либо в буфере MOPS при 200 В в течение 80 мин (SNAP-25), либо в буфере MES при 200 В в течение 50 мин (VAMP2). Белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны посредством Transblot Turbo (Biorad) с использованием программ для смешанной MW (SNAP25) или низкой MW (VAMP2). Мембраны блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре с использованием 5% обезжиренного молока/PBS-Tween и затем инкубировали либо с антителом против SNAP25 (Sigma S9684 1:4000), либо с антителом против Pep2 (1:500), полученным на заказ антителом против VAMP2 (Eurogentec), как описано в примере 1; каждое первичное антитело инкубировали в течение ночи при 4°C. Мембраны промывали 3 раза в PBS-Tween и инкубировали с вторичным антителом против антител кролика с HRP в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембраны промывали 3×5 мин в PBS-Tween, затем проявляли с использованием хемилюминесцентного субстрата SuperSignal West Dura или West Femto и визуализировали с использованием системы Syngene Pxi. Денситометрию полос анализировали с использованием программного обеспечения Genetools, и % расщепления белка определяли с использованием соотношения полноразмерного белка к продукту расщепления как для SNAP-25, так и для VAMP2.

B - Результаты

После обработки с использованием BoNT/F1, BoNT/A1 или BoNT/FA в течение 24 часов, кортикальные нейроны крысы лизировали, разделяли посредством SDS-PAGE и анализировали посредством Вестерн-блоттинга по VAMP-2 (BoNT/F1 и BoNT/FA) или SNAP-25 (BoNT/A1). Процент расщепления SNARE определяли из соотношения полноразмерного к расщепленному белку посредством денситометрического анализа.

Результаты представлены на фигуре 5. Рекомбинантный BoNT/FA расщеплял VAMP-2 с активностью pEC50=12,75±0,14, n=4. Природный BoNT/F1 расщеплял VAMP-2 с активностью pEC50=10,77±0,12, n=3. Природный BoNT/A1 расщеплял SNAP-25 с активностью pEC50=12,38±0,14, n=3.

Пример 3: Детекция протеолитического расщепления VAMP посредством BoNT/B в кортикальных нейронах крысы

A - Способы

1. Получение антитела

Моноклональное антитело получали в Abcam с использованием кроликов, иммунизированных пептидом Pep4: FETSAAKLKRKYWWK (SEQ ID NO:49).

Специфическое для расщепления BoNT/B антитело против VAMP2 (Kegel et al., Toxicology in Vitro; 2007, 21: p1641-1649) использовали для сравнительного исследования.

2. Культура кортикальных нейронов крысы

Кортикальные нейроны крысы получали из эмбрионов крыс CD E17-E18. Разрезанную ткань коры головного мозга собирали в ледяной сбалансированный солевой раствор Хенкса (HBSS) без Ca2+ или Mg2+, и затем подвергали диссоциации в растворе папаина в течение 40 минут при 37°C, следуя инструкциям производителя (Worthington Biochemical, NJ, US). Кортикальные клетки рассевали в покрытые поли-L-орнитином (PLO) 96-луночные планшеты при плотности 20000 клеток/лунку в 125 мкл среды Neurobasal, содержащей 2% добавку B27, 0,5 мМ GlutaMAX, 1% фетальную бычью сыворотку (FBS) и 100 ед./мл пенициллина/стрептомицина. Клетки поддерживали при 37°C в увлажненной атмосфере, содержащей 5% CO2. Дополнительные 125 мкл среды Neurobasal, содержащей 2% B27, 0,5 мМ GlutaMAX, добавляли на DIV (сутки in vitro) 4. Клетки поддерживали посредством замены половины среды два раза в неделю. На DIV 11, 1,5 мкМ цитозин β-D-арабинофуранозид (AraC) добавляли в среду для предотвращения пролиферации не относящихся к нейрональным клеток.

3. Обработка BoNT

Кортикальные нейроны крысы культивировали в флаконах T25 и обрабатывали с использованием 1нМ и 10 пМ BoNT/B (полученного из List Biological Laboratories, Inc.) (SEQ ID NO:2) в течение 24 часов при 37°C. Среды удаляли, и клетки промывали один раз с использованием PBS. Клетки лизировали в 1,5 мл буфера для образцов NuPage (буфер LDS NuPage, 1 мМ DTT, 1:500 бензоназы) в течение 10 минут при комнатной температуре.

4. SDS-PAGE и Вестерн-блоттинг

Лизаты нейронов кипятили при 90°C в течение 5 минут. 15 мкл лизатов загружали на дорожку 12% Bis-Трис-гелей и разделяли в буфере MES при 200 В в течение 50 мин. Белки переносили на нитроцеллюлозные мембраны посредством Transblot Turbo (Biorad) с использованием программы для низкой MW. Мембраны блокировали в течение 1 часа при комнатной температуре с использованием 5% обезжиренного молока/PBS-Tween и затем инкубировали с полученными на заказ антителами против Pep1, против Pep2, против Pep3 или против Pep4, или со специфическим для расщепления BoNT-B антителом, в течение ночи при 4°C. Мембраны промывали 3 раза в PBS-Tween и инкубировали с вторичным антителом против антител кролика с HRP в течение 1 часа при комнатной температуре. Мембраны промывали 3×5 мин в PBS-Tween, затем проявляли с использованием хемилюминесцентного субстрата SuperSignal West Femto и визуализировали с использованием системы Syngene PXi.

B - Результаты

На основании результатов, полученных в описанных выше примерах 1 и 2, подразумевающих, что локализация эпитопа являлась ключевой для детекции расщепленного VAMP in vitro, получено новое моноклональное антитело против эпитопа, соседнего с участком расщепления BoNT/B, локализованного с C-концевой стороны.

Это антитело тестировали в таком же анализе коры головного мозга крысы после обработки BoNT/B и BoNT/F, и сравнивали с антителом против Pep1, против Pep2, против Pep3 и антителом, специфическим для расщепления BoNT/B (фигура 6). Области эпитопов для всех сравниваемых антител были локализованы с N-концевой стороны от участка расщепления BoNT/B. На фигуре 6 показано, что локализация эпитопа нового антитела, нацеленного против Pep4, позволяет детекцию полноразмерного VAMP2, так же как продуктов расщепления для обработки как BoNT/B, так и BoNT/F. В отличие от этого, антитела против Pep2 и против Pep3 детектировали только продукт расщепления BoNT/F, но не продукт расщепления BoNT/B. Антитело против Pep1 не детектировало никаких продуктов расщепления, как ожидали. Специфическое для расщепления BoNT/B антитело также не детектировало никаких продуктов расщепления BoNT/B в этих лизатах клеток.

В целом, настоящие данные показывают, что важным фактором, который необходимо учитывать для детекции расщепленного VAMP, является локализация эпитопа антитела. Только антитела, образованные против эпитопов, локализованных в связанном с мембраной фрагменте VAMP, после расщепления, являлись способными детектировать этот фрагмент. Посредством локализации эпитопа моноклонального антитела на C-конце VAMP, выдвинули гипотезу, что эта область должна присутствовать в фрагментах VAMP, полученных посредством расщепляющих VAMP нейротоксинов серотипов B, D и F. Доказано, что это является обстоятельством, позволяющим получать одиночное антитело (Mab против Pep4), обеспечивающее положительные результаты для обработанных BoNT/B и BoNT/F нейронов. Помимо этого, поскольку TeNT разделяет такой же участок расщепления, как участок расщепления BoNT/B и BoNT/D, расположенный в непосредственной близости от участка расщепления BoNT/F, ожидают, что это антитело можно использовать также при расщеплении TeNT и BoNT/D.

Дополнительным преимуществом области эпитопа Pep4 является то, что антитела, нацеленные против этой области, могут детектировать как полноразмерный, так и расщепленный VAMP, со сходной чувствительностью. Способность одновременно детектировать обе формы белка в одном и том же образце обеспечивает надежный инструмент для нормализации, без необходимости блоттинга дополнительных белков домашнего хозяйства. Это обеспечивает очень полезный и имеющий прямое накопление сигнала анализ Вестерн-блоттинга для количественной оценки активности BoNT в моделях на клетках.

Настоящие данные показывают также различия в детекции VAMP между бесклеточными анализами рекомбинантного белка и моделью на цельной клетке. Именно эта неспособность детектировать клеточный расщепленный VAMP сформировала основу гипотезы, что деградация VAMP в клетке происходит очень быстро (Foran et al., «Evaluation of the therapeutic usefulness of botulinum neurotoxin B, C1, E and F compared with the long-lasting type A». J. Biol Chem 278 (2) pp1363-1371 2003). В отличие от антител по настоящему изобретению, большинство коммерчески доступных антител против VAMP получены против эпитопов в N-концевой области белка, и таким образом, на N-концевом фрагменте VAMP были сфокусированы эти более ранние исследования. Хотя в настоящем описании показано, что меньший C-концевой фрагмент VAMP не деградирован в клетке, больший N-концевой фрагмент также не был детектирован. Однако, интересно отметить, что результаты авторов настоящего изобретения в бесклеточной системе показывают, что не все коммерческие антитела являются способными детектировать ожидаемый N-концевой фрагмент, даже когда он присутствует в бесклеточной системе, лишенной каких-либо протеаз. Из настоящих данных, можно заключить, что гипотеза о деградации VAMP, без сомнения, относится только к N-концевому фрагменту, и что C-концевой фрагмент VAMP не является деградированным и остается связанным с мембраной везикулы.

ИНФОРМАЦИЯ О ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

• SEQ ID NO: 1 - BoNT/A1 - Номер доступа в UniProtKB P10845 (Clostridium botulinum)

MPFVNKQFNYKDPVNGVDIAYIKIPNAGQMQPVKAFKIHNKIWVIPERDTFTNPEEGDLNPPPEAKQVPVSYYDSTYLSTDNEKDNYLKGVTKLFERIYSTDLGRMLLTSIVRGIPFWGGSTIDTELKVIDTNCINVIQPDGSYRSEELNLVIIGPSADIIQFECKSFGHEVLNLTRNGYGSTQYIRFSPDFTFGFEESLEVDTNPLLGAGKFATDPAVTLAHELIHAGHRLYGIAINPNRVFKVNTNAYYEMSGLEVSFEELRTFGGHDAKFIDSLQENEFRLYYYNKFKDIASTLNKAKSIVGTTASLQYMKNVFKEKYLLSEDTSGKFSVDKLKFDKLYKMLTEIYTEDNFVKFFKVLNRKTYLNFDKAVFKINIVPKVNYTIYDGFNLRNTNLAANFNGQNTEINNMNFTKLKNFTGLFEFYKLLCVRGIITSKTKSLDKGYNKALNDLCIKVNNWDLFFSPSEDNFTNDLNKGEEITSDTNIEAAEENISLDLIQQYYLTFNFDNEPENISIENLSSDIIGQLELMPNIERFPNGKKYELDKYTMFHYLRAQEFEHGKSRIALTNSVNEALLNPSRVYTFFSSDYVKKVNKATEAAMFLGWVEQLVYDFTDETSEVSTTDKIADITIIIPYIGPALNIGNMLYKDDFVGALIFSGAVILLEFIPEIAIPVLGTFALVSYIANKVLTVQTIDNALSKRNEKWDEVYKYIVTNWLAKVNTQIDLIRKKMKEALENQAEATKAIINYQYNQYTEEEKNNINFNIDDLSSKLNESINKAMININKFLNQCSVSYLMNSMIPYGVKRLEDFDASLKDALLKYIYDNRGTLIGQVDRLKDKVNNTLSTDIPFQLSKYVDNQRLLSTFTEYIKNIINTSILNLRYESNHLIDLSRYASKINIGSKVNFDPIDKNQIQLFNLESSKIEVILKNAIVYNSMYENFSTSFWIRIPKYFNSISLNNEYTIINCMENNSGWKVSLNYGEIIWTLQDTQEIKQRVVFKYSQMINISDYINRWIFVTITNNRLNNSKIYINGRLIDQKPISNLGNIHASNNIMFKLDGCRDTHRYIWIKYFNLFDKELNEKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYVDVNNVGIRGYMYLKGPRGSVMTTNIYLNSSLYRGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSALEIPDVGNLSQVVVMKSKNDQGITNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIERSSRTLGCSWEFIPVDDGWGERPL

• SEQ ID NO: 2 - BoNT/B1 - Номер доступа в UniProtKB P10844 (Clostridium botulinum)

MPVTINNFNYNDPIDNNNIIMMEPPFARGTGRYYKAFKITDRIWIIPERYTFGYKPEDFNKSSGIFNRDVCEYYDPDYLNTNDKKNIFLQTMIKLFNRIKSKPLGEKLLEMIINGIPYLGDRRVPLEEFNTNIASVTVNKLISNPGEVERKKGIFANLIIFGPGPVLNENETIDIGIQNHFASREGFGGIMQMKFCPEYVSVFNNVQENKGASIFNRRGYFSDPALILMHELIHVLHGLYGIKVDDLPIVPNEKKFFMQSTDAIQAEELYTFGGQDPSIITPSTDKSIYDKVLQNFRGIVDRLNKVLVCISDPNININIYKNKFKDKYKFVEDSEGKYSIDVESFDKLYKSLMFGFTETNIAENYKIKTRASYFSDSLPPVKIKNLLDNEIYTIEEGFNISDKDMEKEYRGQNKAINKQAYEEISKEHLAVYKIQMCKSVKAPGICIDVDNEDLFFIADKNSFSDDLSKNERIEYNTQSNYIENDFPINELILDTDLISKIELPSENTESLTDFNVDVPVYEKQPAIKKIFTDENTIFQYLYSQTFPLDIRDISLTSSFDDALLFSNKVYSFFSMDYIKTANKVVEAGLFAGWVKQIVNDFVIEANKSNTMDKIADISLIVPYIGLALNVGNETAKGNFENAFEIAGASILLEFIPELLIPVVGAFLLESYIDNKNKIIKTIDNALTKRNEKWSDMYGLIVAQWLSTVNTQFYTIKEGMYKALNYQAQALEEIIKYRYNIYSEKEKSNINIDFNDINSKLNEGINQAIDNINNFINGCSVSYLMKKMIPLAVEKLLDFDNTLKKNLLNYIDENKLYLIGSAEYEKSKVNKYLKTIMPFDLSIYTNDTILIEMFNKYNSEILNNIILNLRYKDNNLIDLSGYGAKVEVYDGVELNDKNQFKLTSSANSKIRVTQNQNIIFNSVFLDFSVSFWIRIPKYKNDGIQNYIHNEYTIINCMKNNSGWKISIRGNRIIWTLIDINGKTKSVFFEYNIREDISEYINRWFFVTITNNLNNAKIYINGKLESNTDIKDIREVIANGEIIFKLDGDIDRTQFIWMKYFSIFNTELSQSNIEERYKIQSYSEYLKDFWGNPLMYNKEYYMFNAGNKNSYIKLKKDSPVGEILTRSKYNQNSKYINYRDLYIGEKFIIRRKSNSQSINDDIVRKEDYIYLDFFNLNQEWRVYTYKYFKKEEEKLFLAPISDSDEFYNTIQIKEYDEQPTYSCQLLFKKDEESTDEIGLIGIHRFYESGIVFEEYKDYFCISKWYLKEVKRKPYNLKLGCNWQFIPKDEGWTE

• SEQ ID NO: 3 - BoNT/C1 - Номер доступа в UniProtKB P18640 (Clostridium botulinum)

MPITINNFNYSDPVDNKNILYLDTHLNTLANEPEKAFRITGNIWVIPDRFSRNSNPNLNKPPRVTSPKSGYYDPNYLSTDSDKDPFLKEIIKLFKRINSREIGEELIYRLSTDIPFPGNNNTPINTFDFDVDFNSVDVKTRQGNNWVKTGSINPSVIITGPRENIIDPETSTFKLTNNTFAAQEGFGALSIISISPRFMLTYSNATNDVGEGRFSKSEFCMDPILILMHELNHAMHNLYGIAIPNDQTISSVTSNIFYSQYNVKLEYAEIYAFGGPTIDLIPKSARKYFEEKALDYYRSIAKRLNSITTANPSSFNKYIGEYKQKLIRKYRFVVESSGEVTVNRNKFVELYNELTQIFTEFNYAKIYNVQNRKIYLSNVYTPVTANILDDNVYDIQNGFNIPKSNLNVLFMGQNLSRNPALRKVNPENMLYLFTKFCHKAIDGRSLYNKTLDCRELLVKNTDLPFIGDISDVKTDIFLRKDINEETEVIYYPDNVSVDQVILSKNTSEHGQLDLLYPSIDSESEILPGENQVFYDNRTQNVDYLNSYYYLESQKLSDNVEDFTFTRSIEEALDNSAKVYTYFPTLANKVNAGVQGGLFLMWANDVVEDFTTNILRKDTLDKISDVSAIIPYIGPALNISNSVRRGNFTEAFAVTGVTILLEAFPEFTIPALGAFVIYSKVQERNEIIKTIDNCLEQRIKRWKDSYEWMMGTWLSRIITQFNNISYQMYDSLNYQAGAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNEFDRNTKAKLINLIDSHNIILVGEVDKLKAKVNNSFQNTIPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNNINDSKILSLQNRKNTLVDTSGYNAEVSEEGDVQLNPIFPFDFKLGSSGEDRGKVIVTQNENIVYNSMYESFSISFWIRINKWVSNLPGYTIIDSVKNNSGWSIGIISNFLVFTLKQNEDSEQSINFSYDISNNAPGYNKWFFVTVTNNMMGNMKIYINGKLIDTIKVKELTGINFSKTITFEINKIPDTGLITSDSDNINMWIRDFYIFAKELDGKDINILFNSLQYTNVVKDYWGNDLRYNKEYYMVNIDYLNRYMYANSRQIVFNTRRNNNDFNEGYKIIIKRIRGNTNDTRVRGGDILYFDMTINNKAYNLFMKNETMYADNHSTEDIYAIGLREQTKDINDNIIFQIQPMNNTYYYASQIFKSNFNGENISGICSIGTYRFRLGGDWYRHNYLVPTVKQGNYASLLESTSTHWGFVPVSE

• SEQ ID NO: 4 - BoNT/D - Номер доступа в UniProtKB P19321 (Clostridium botulinum)

MTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCLRLTKNSRDDSTCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNSINDSKILSLQNKKNALVDTSGYNAEVRVGDNVQLNTIYTNDFKLSSSGDKIIVNLNNNILYSAIYENSSVSFWIKISKDLTNSHNEYTIINSIEQNSGWKLCIRNGNIEWILQDVNRKYKSLIFDYSESLSHTGYTNKWFFVTITNNIMGYMKLYINGELKQSQKIEDLDEVKLDKTIVFGIDENIDENQMLWIRDFNIFSKELSNEDINIVYEGQILRNVIKDYWGNPLKFDTEYYIINDNYIDRYIAPESNVLVLVQYPDRSKLYTGNPITIKSVSDKNPYSRILNGDNIILHMLYNSRKYMIIRDTDTIYATQGGECSQNCVYALKLQSNLGNYGIGIFSIKNIVSKNKYCSQIFSSFRENTMLLADIYKPWRFSFKNAYTPVAVTNYETKLLSTSSFWKFISRDPGWVE

• SEQ ID NO: 5 - BoNT/E - Номер доступа WP_003372387 (Clostridium botulinum)

MPKINSFNYNDPVNDRTILYIKPGGCQEFYKSFNIMKNIWIIPERNVIGTTPQDFHPPTSLKNGDSSYYDPNYLQSDEEKDRFLKIVTKIFNRINNNLSGGILLEELSKANPYLGNDNTPDNQFHIGDASAVEIKFSNGSQDILLPNVIIMGAEPDLFETNSSNISLRNNYMPSNHGFGSIAIVTFSPEYSFRFNDNSMNEFIQDPALTLMHELIHSLHGLYGAKGITTKYTITQKQNPLITNIRGTNIEEFLTFGGTDLNIITSAQSNDIYTNLLADYKKIASKLSKVQVSNPLLNPYKDVFEAKYGLDKDASGIYSVNINKFNDIFKKLYSFTEFDLATKFQVKCRQTYIGQYKYFKLSNLLNDSIYNISEGYNINNLKVNFRGQNANLNPRIITPITGRGLVKKIIRFCKNIVSVKGIRKSICIEINNGELFFVASENSYNDDNINTPKEIDDTVTSNNNYENDLDQVILNFNSESAPGLSDEKLNLTIQNDAYIPKYDSNGTSDIEQHDVNELNVFFYLDAQKVPEGENNVNLTSSIDTALLEQPKIYTFFSSEFINNVNKPVQAALFVSWIQQVLVDFTTEANQKSTVDKIADISIVVPYIGLALNIGNEAQKGNFKDALELLGAGILLEFEPELLIPTILVFTIKSFLGSSDNKNKVIKAINNALKERDEKWKEVYSFIVSNWMTKINTQFNKRKEQMYQALQNQVNAIKTIIESKYNSYTLEEKNELTNKYDIKQIENELNQKVSIAMNNIDRFLTESSISYLMKLINEVKINKLREYDENVKTYLLNYIIQHGSILGESQQELNSMVTDTLNNSIPFKLSSYTDDKILISYFNKFFKRIKSSSVLNMRYKNDKYVDTSGYDSNININGDVYKYPTNKNQFGIYNDKLSEVNISQNDYIIYDNKYKNFSISFWVRIPNYDNKIVNVNNEYTIINCMRDNNSGWKVSLNHNEIIWTLQDNAGINQKLAFNYGNANGISDYINKWIFVTITNDRLGDSKLYINGNLIDQKSILNLGNIHVSDNILFKIVNCSYTRYIGIRYFNIFDKELDETEIQTLYSNEPNTNILKDFWGNYLLYDKEYYLLNVLKPNNFIDRRKDSTLSINNIRSTILLANRLYSGIKVKIQRVNNSSTNDNLVRKNDQVYINFVASKTHLFPLYADTATTNKEKTIKISSSGNRFNQVVVMNSVGNNCTMNFKNNNGNNIGLLGFKADTVVASTWYYTHMRDHTNSNGCFWNFISEEHGWQEK

• SEQ ID NO: 6 - BoNT/F - Номер доступа в UniProtKB YP_001390123 (Clostridium botulinum)

MPVVINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTDPSDFDPPASLENGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGEVLLQEISYAKPYLGNEHTPINEFHPVTRTTSVNIKSSTNVKSSIILNLLVLGAGPDIFENSSYPVRKLMDSGGVYDPSNDGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGYNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYKETIKVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSRVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTEIDLANKFKVKCRNTYFIKYGFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQNIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFCKSVIPRKGTKAPPRLCIRVNNRELFFVASESSYNENDINTPKEIDDTTNLNNNYRNNLDEVILDYNSETIPQISNQTLNTLVQDDSYVPRYDSNGTSEIEEHNVVDLNVFFYLHAQKVPEGETNISLTSSIDTALSEESQVYTFFSSEFINTINKPVHAALFISWINQVIRDFTTEATQKSTFDKIADISLVVPYVGLALNIGNEVQKENFKEAFELLGAGILLEFVPELLIPTILVFTIKSFIGSSENKNKIIKAINNSLMERETKWKEIYSWIVSNWLTRINTQFNKRKEQMYQALQNQVDAIKTVIEYKYNNYTSDERNRLESEYNINNIREELNKKVSLAMENIERFITESSIFYLMKLINEAKVSKLREYDEGVKEYLLDYISEHRSILGNSVQELNDLVTSTLNNSIPFELSSYTNDKILILYFNKLYKKIKDNSILDMRYENNKFIDISGYGSNISINGDVYIYSTNRNQFGIYSSKPSEVNIAQNNDIIYNGRYQNFSISFWVRIPKYFNKVNLNNEYTIIDCIRNNNSGWKISLNYNKIIWTLQDTAGNNQKLVFNYTQMISISDYINKWIFVTITNNRLGNSRIYINGNLIDEKSISNLGDIHVSDNILFKIVGCNDTRYVGIRYFKVFDTELGKTEIETLYSDEPDPSILKDFWGNYLLYNKRYYLLNLLRTDKSITQNSNFLNINQQRGVYQKPNIFSNTRLYTGVEVIIRKNGSTDISNTDNFVRKNDLAYINVVDRDVEYRLYADISIAKPEKIIKLIRTSNSNNSLGQIIVMDSIGNNCTMNFQNNNGGNIGLLGFHSNNLVASSWYYNNIRKNTSSNGCFWSFISKEHGWQEN

• SEQ ID NO: 7 - BoNT/G - Номер доступа в UniProtKB WP_039635782 (Clostridium botulinum)

MPVNIKNFNYNDPINNDDIIMMEPFNDPGPGTYYKAFRIIDRIWIVPERFTYGFQPDQFNASTGVFSKDVYEYYDPTYLKTDAEKDKFLKTMIKLFNRINSKPSGQRLLDMIVDAIPYLGNASTPPDKFAANVANVSINKKIIQPGAEDQIKGLMTNLIIFGPGPVLSDNFTDSMIMNGHSPISEGFGARMMIRFCPSCLNVFNNVQENKDTSIFSRRAYFADPALTLMHELIHVLHGLYGIKISNLPITPNTKEFFMQHSDPVQAEELYTFGGHDPSVISPSTDMNIYNKALQNFQDIANRLNIVSSAQGSGIDISLYKQIYKNKYDFVEDPNGKYSVDKDKFDKLYKALMFGFTETNLAGEYGIKTRYSYFSEYLPPIKTEKLLDNTIYTQNEGFNIASKNLKTEFNGQNKAVNKEAYEEISLEHLVIYRIAMCKPVMYKNTGKSEQCIIVNNEDLFFIANKDSFSKDLAKAETIAYNTQNNTIENNFSIDQLILDNDLSSGIDLPNENTEPFTNFDDIDIPVYIKQSALKKIFVDGDSLFEYLHAQTFPSNIENLQLTNSLNDALRNNNKVYTFFSTNLVEKANTVVGASLFVNWVKGVIDDFTSESTQKSTIDKVSDVSIIIPYIGPALNVGNETAKENFKNAFEIGGAAILMEFIPELIVPIVGFFTLESYVGNKGHIIMTISNALKKRDQKWTDMYGLIVSQWLSTVNTQFYTIKERMYNALNNQSQAIEKIIEDQYNRYSEEDKMNINIDFNDIDFKLNQSINLAINNIDDFINQCSISYLMNRMIPLAVKKLKDFDDNLKRDLLEYIDTNELYLLDEVNILKSKVNRHLKDSIPFDLSLYTKDTILIQVFNNYISNISSNAILSLSYRGGRLIDSSGYGATMNVGSDVIFNDIGNGQFKLNNSENSNITAHQSKFVVYDSMFDNFSINFWVRTPKYNNNDIQTYLQNEYTIISCIKNDSGWKVSIKGNRIIWTLIDVNAKSKSIFFEYSIKDNISDYINKWFSITITNDRLGNANIYINGSLKKSEKILNLDRINSSNDIDFKLINCTDTTKFVWIKDFNIFGRELNATEVSSLYWIQSSTNTLKDFWGNPLRYDTQYYLFNQGMQNIYIKYFSKASMGETAPRTNFNNAAINYQNLYLGLRFIIKKASNSRNINNDNIVREGDYIYLNIDNISDESYRVYVLVNSKEIQTQLFLAPINDDPTFYDVLQIKKYYEKTTYNCQILCEKDTKTFGLFGIGKFVKDYGYVWDTYDNYFCISQWYLRRISENINKLRLGCNWQFIPVDEGWTE

• SEQ ID NO: 8 - TeNT - Номер доступа в UniProtKB P04958 (Clostridium tetani)

MPITINNFRYSDPVNNDTIIMMEPPYCKGLDIYYKAFKITDRIWIVPERYEFGTKPEDFNPPSSLIEGASEYYDPNYLRTDSDKDRFLQTMVKLFNRIKNNVAGEALLDKIINAIPYLGNSYSLLDKFDTNSNSVSFNLLEQDPSGATTKSAMLTNLIIFGPGPVLNKNEVRGIVLRVDNKNYFPCRDGFGSIMQMAFCPEYVPTFDNVIENITSLTIGKSKYFQDPALLLMHELIHVLHGLYGMQVSSHEIIPSKQEIYMQHTYPISAEELFTFGGQDANLISIDIKNDLYEKTLNDYKAIANKLSQVTSCNDPNIDIDSYKQIYQQKYQFDKDSNGQYIVNEDKFQILYNSIMYGFTEIELGKKFNIKTRLSYFSMNHDPVKIPNLLDDTIYNDTEGFNIESKDLKSEYKGQNMRVNTNAFRNVDGSGLVSKLIGLCKKIIPPTNIRENLYNRTASLTDLGGELCIKIKNEDLTFIAEKNSFSEEPFQDEIVSYNTKNKPLNFNYSLDKIIVDYNLQSKITLPNDRTTPVTKGIPYAPEYKSNAASTIEIHNIDDNTIYQYLYAQKSPTTLQRITMTNSVDDALINSTKIYSYFPSVISKVNQGAQGILFLQWVRDIIDDFTNESSQKTTIDKISDVSTIVPYIGPALNIVKQGYEGNFIGALETTGVVLLLEYIPEITLPVIAALSIAESSTQKEKIIKTIDNFLEKRYEKWIEVYKLVKAKWLGTVNTQFQKRSYQMYRSLEYQVDAIKKIIDYEYKIYSGPDKEQIADEINNLKNKLEEKANKAMININIFMRESSRSFLVNQMINEAKKQLLEFDTQSKNILMQYIKANSKFIGITELKKLESKINKVFSTPIPFSYSKNLDCWVDNEEDIDVILKKSTILNLDINNDIISDISGFNSSVITYPDAQLVPGINGKAIHLVNNESSEVIVHKAMDIEYNDMFNNFTVSFWLRVPKVSASHLEQYGTNEYSIISSMKKHSLSIGSGWSVSLKGNNLIWTLKDSAGEVRQITFRDLPDKFNAYLANKWVFITITNDRLSSANLYINGVLMGSAEITGLGAIREDNNITLKLDRCNNNNQYVSIDKFRIFCKALNPKEIEKLYTSYLSITFLRDFWGNPLRYDTEYYLIPVASSSKDVQLKNITDYMYLTNAPSYTNGKLNIYYRRLYNGLKFIIKRYTPNNEIDSFVKSGDFIKLYVSYNNNEHIVGYPKDGNAFNNLDRILRVGYNAPGIPLYKKMEAVKLRDLKTYSVQLKLYDDKNASLGLVGTHNGQIGNDPNRDILIASNWYFNHLKDKILGCDWYFVPTDEGWTND

• SEQ ID NO: 9 - VAMP1_крысы (Q63666)

MSAPAQPPAEGTEGAAPGGGPPGPPPNTTSNRRLQQTQAQVEEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASVFESSAAKLKRKYWWKNCKMMIMLGAICAIIVVVIVIYIFT

• SEQ ID NO: 10 - VAMP1_человека (P23763)

MSAPAQPPAEGTEGTAPGGGPPGPPPNMTSNRRLQQTQAQVEEVVDIIRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFESSAAKLKRKYWWKNCKMMIMLGAICAIIVVVIVIYFFT

• SEQ ID NO: 11 - VAMP2_крысы (P63045)

MSATAATVPPAAPAGEGGPPAPPPNLTSNRRLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKRKYWWKNLKMMIILGVICAIILIIIIVYFST

• SEQ ID NO: 12 - VAMP2_человека (P63027)

MSATAATAPPAAPAGEGGPPAPPPNLTSNRRLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKRKYWWKNLKMMIILGVICAIILIIIIVYFST

• SEQ ID NO: 13 - VAMP3_крысы (P63025)

MSTGVPSGSSAATGSNRRLQQTQNQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKRKYWWKNCKMWAIGISVLVIIVIIIIVWCVS

• SEQ ID NO: 14 - VAMP3_человека (Q15836)

MSTGPTAATGSNRRLQQTQNQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKRKYWWKNCKMWAIGITVLVIFIIIIIVWVVSS

• SEQ ID NO: 15 - эпитоп VAMP

KLSELDDRADALQ

• SEQ ID NO: 16 - эпитоп VAMP

QKLSELDDRADALQ

• SEQ ID NO: 17 - эпитоп VAMP

KLSELDDRAD

• SEQ ID NO: 18 - эпитоп VAMP

KLSELDDRADALQAGAS

• SEQ ID NO: 19 - эпитоп VAMP

LSELDDRADALQ

• SEQ ID NO: 20 - эпитоп VAMP

LSELDDRADA

• SEQ ID NO: 21 - эпитоп VAMP

LSELDDRADALQAGAS

• SEQ ID NO: 22 - эпитоп VAMP

FETSAAKLKRKYW

• SEQ ID NO: 23 - эпитоп VAMP

FESSAAKLKRKYW

• SEQ ID NO: 24 - эпитоп VAMP

QFETSAAKLKRKYW

• SEQ ID NO: 25 - эпитоп VAMP

FETSAAKLKR

• SEQ ID NO: 26 - эпитоп VAMP

FETSAAKLKRKYWWKN

• SEQ ID NO: 27 - эпитоп VAMP

AKLKRKYWWKN

• SEQ ID NO: 28 - эпитоп VAMP

AAKLKRKYWWKN

• SEQ ID NO: 29 - эпитоп VAMP

AKLKRKYWWKNCKM

• SEQ ID NO: 30 - эпитоп VAMP

AKLKRKYWWKNLKM

• SEQ ID NO: 31 - эпитоп VAMP

DQKLSELDDRADALQ

• SEQ ID NO: 32 - эпитоп VAMP

ERDQKLSELDDRA

• SEQ ID NO: 33 - эпитоп VAMP

LERDQKLSELDDRA

• SEQ ID NO: 34 - эпитоп VAMP

VLERDQKLSELDDRA

• SEQ ID NO: 35- LHND

MGSMTWPVKDFNYSDPVNDNDILYLRIPQNKLITTPVKAFMITQNIWVIPERFSSDTNPSLSKPPRPTSKYQSYYDPSYLSTDEQKDTFLKGIIKLFKRINERDIGKKLINYLVVGSPFMGDSSTPEDTFDFTRHTTNIAVEKFENGSWKVTNIITPSVLIFGPLPNILDYTASLTLQGQQSNPSFEGFGTLSILKVAPEFLLTFSDVTSNQSSAVLGKSIFCMDPVIALMHELTHSLHQLYGINIPSDKRIRPQVSEGFFSQDGPNVQFEELYTFGGLDVEIIPQIERSQLREKALGHYKDIAKRLNNINKTIPSSWISNIDKYKKIFSEKYNFDKDNTGNFVVNIDKFNSLYSDLTNVMSEVVYSSQYNVKNRTHYFSRHYLPVFANILDDNIYTIRDGFNLTNKGFNIENSGQNIERNPALQKLSSESVVDLFTKVCVDKSEEKLYDDDDKDRWGSSLQCIKVKNNRLPYVADKDSISQEIFENKIITDETNVQNYSDKFSLDESILDGQVPINPEIVDPLLPNVNMEPLNLPGEEIVFYDDITKYVDYLNSYYYLESQKLSNNVENITLTTSVEEALGYSNKIYTFLPSLAEKVNKGVQAGLFLNWANEVVEDFTTNIMKKDTLDKISDVSVIIPYIGPALNIGNSALRGNFNQAFATAGVAFLLEGFPEFTIPALGVFTFYSSIQEREKIIKTIENCLEQRVKRWKDSYQWMVSNWLSRITTQFNHINYQMYDSLSYQADAIKAKIDLEYKKYSGSDKENIKSQVENLKNSLDVKISEAMNNINKFIRECSVTYLFKNMLPKVIDELNKFDLRTKTELINLIDSHNIILVGEVDRLKAKVNESFENTMPFNIFSYTNNSLLKDIINEYFNLEAHHHHHHHHHH

• SEQ ID NO: 36 - MBP-LF

MKIEEGKLVIWINGDKGYNGLAEVGKKFEKDTGIKVTVEHPDKLEEKFPQVAATGDGPDIIFWAHDRFGGYAQSGLLAEITPDKAFQDKLYPFTWDAVRYNGKLIAYPIAVEALSLIYNKDLLPNPPKTWEEIPALDKELKAKGKSALMFNLQEPYFTWPLIAADGGYAFKYENGKYDIKDVGVDNAGAKAGLTFLVDLIKNKHMNADTDYSIAEAAFNKGETAMTINGPWAWSNIDTSKVNYGVTVLPTFKGQPSKPFVGVLSAGINAASPNKELAKEFLENYLLTDEGLEAVNKDKPLGAVALKSYEEELAKDPRIAATMENAQKGEIMPNIPQMSAFWYAVRTAVINAASGRQTVDEALKDAQTNSSSNNNNNNNNNNLGIEGRISEFGSMPVAINSFNYNDPVNDDTILYMQIPYEEKSKKYYKAFEIMRNVWIIPERNTIGTNPSDFDPPASLKNGSSAYYDPNYLTTDAEKDRYLKTTIKLFKRINSNPAGKVLLQEISYAKPYLGNDHTPIDEFSPVTRTTSVNIKLSTNVESSMLLNLLVLGAGPDIFESCCYPVRKLIDPDVVYDPSNYGFGSINIVTFSPEYEYTFNDISGGHNSSTESFIADPAISLAHELIHALHGLYGARGVTYEETIEVKQAPLMIAEKPIRLEEFLTFGGQDLNIITSAMKEKIYNNLLANYEKIATRLSEVNSAPPEYDINEYKDYFQWKYGLDKNADGSYTVNENKFNEIYKKLYSFTESDLANKFKVKCRNTYFIKYEFLKVPNLLDDDIYTVSEGFNIGNLAVNNRGQSIKLNPKIIDSIPDKGLVEKIVKFAVDKLAAALEHHHHHH

• SEQ ID NO:37 (рекомбинантный VAMP2-GFP)

GPLGSSATAATAPPAAPAGEGGPPAPPPNLTSNRRLQQTQAQVDEVVDIMRVNVDKVLERDQKLSELDDRADALQAGASQFETSAAKLKRKYWWKNLKLENVSKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYK

• SEQ ID NO: 38 - рекомбинантный BoNT/FA

MPVVINSFNYDDPVNDNTIIYIRPPYYETSNTYFKAFQIMDNVWIIPERYRLGIDPSLFNPPVSLKAGSDGYFDPNYLSTNTEKNKYLQIMIKLFKRINSKPAGQILLEEIKNAIPYLGNSYTQEEQFTTNNRTVSFNVKLANGNIVQQMANLIIWGPGPDLTTNKTGGIIYSPYQSMEATPYKDGFGSIMTVEFSPEYATAFNDISIASHSPSLFIKDPALILMHELIHVLHGLYGTYITEYKITPNVVQSYMKVTKPITSAEFLTFGGRDRNIVPQSIQSQLYNKVLSDYKRIASRLNKVNTATALINIDEFKNLYEWKYQFAKDSNGVYSVDLNKFEQLYKKIYSFTEFNLAYEFKIKTRLGYLAENFGPFYLPNLLDDSIYTEVDGFNIGALSINYQGQNIGSDINSIKKLQGQGVVSRVVRLCKSVIPRKGTKAPPRLCITVNNRDLFFIASQESYGENTINTYKEIDDTTTLDPSFEDILDKVILNFNEQVIPQMPNRNVSTDIQKDNYIPKYDYNRTDIIDSYEVGRNYNTFFYLNAQKFSPNESNITLTSSFDTGLLEGSKVYTFFSSDFINNINKPVQALLFIEWVKQVIRDFTTEATKTSTVDKLKDISLVVPYIGLALNIGDEIYKQHFAEAVELVGAGLLLEFSPEFLIPTLLIFTIKGYLTGSIRDKDKIIKTLDNALNVRDQKWKELYRWVVSKWLTTINTQFNKRKEQMYKALKNQATAIKKIIENKYNNYTTDEKSKIDSSYNINEIERTLNEKINLAMKNIEQFITESSIAYLINIINNETIQKLKSYDDLVRRYLLGYIRNHSSILGNSVEELNSKVNNHLDNGIPFELSSYTNDSLLIRYFNKNYGELKYNCILNIKYEMDRDKLVDSSGYRSRINIGTGVKFSEIDKNQVQLSNLESSKIEVILNNGVIYNSMYENFSTSFWIRIPKYFRNINNEYKIISCMQNNSGWEVSLNFSNMNSKIIWTLQDTEGIKKTVVFQYTQNINISDYINRWIFVTITNNRLSNSKIYINGRLINEESISDLGNIHASNNIMFKLDGCRDPHRYIWIKYFNLFDKELNKKEIKDLYDNQSNSGILKDFWGDYLQYDKPYYMLNLYDPNKYLDVNNVGIRGYMYLKGPRGRIVTTNIYLNSTLYMGTKFIIKKYASGNKDNIVRNNDRVYINVVVKNKEYRLATNASQAGVEKILSAVEIPDVGNLSQVVVMKSENDQGIRNKCKMNLQDNNGNDIGFIGFHQFNNIAKLVASNWYNRQIGKASRTFGCSWEFIPVDDGWGESSLHHHHHHHHHH

• SEQ ID NO: 39 - Pep1

SNRRLQQTQAQVDEC

• SEQ ID NO: 40 - Pep3

CLQAGASQ

• SEQ ID NO:41 - BoNT/X, номер доступа в Genbank BAQ12790 (Clostridium botulinum)

MKLEINKFNYNDPIDGINVITMRPPRHSDKINKGKGPFKAFQVIKNIWIVPERYNFTNNTNDLNIPSEPIMEADAIYNPNYLNTPSEKDEFLQGVIKVLERIKSKPEGEKLLELISSSIPLPLVSNGALTLSDNETIAYQENNNIVSNLQANLVIYGPGPDIANNATYGLYSTPISNGEGTLSEVSFSPFYLKPFDESYGNYRSLVNIVNKFVKREFAPDPASTLMHELVHVTHNLYGISNRNFYYNFDTGKIETSRQQNSLIFEELLTFGGIDSKAISSLIIKKIIETAKNNYTTLISERLNTVTVENDLLKYIKNKIPVQGRLGNFKLDTAEFEKKLNTILFVLNESNLAQRFSILVRKHYLKERPIDPIYVNILDDNSYSTLEGFNISSQGSNDFQGQLLESSYFEKIESNALRAFIKICPRNGLLYNAIYRNSKNYLNNIDLEDKKTTSKTNVSYPCSLLNGCIEVENKDLFLISNKDSLNDINLSEEKIKPETTVFFKDKLPPQDITLSNYDFTEANSIPSISQQNILERNEELYEPIRNSLFEIKTIYVDKLTTFHFLEAQNIDESIDSSKIRVELTDSVDEALSNPNKVYSPFKNMSNTINSIETGITSTYIFYQWLRSIVKDFSDETGKIDVIDKSSDTLAIVPYIGPLLNIGNDIRHGDFVGAIELAGITALLEYVPEFTIPILVGLEVIGGELAREQVEAIVNNALDKRDQKWAEVYNITKAQWWGTIHLQINTRLAHTYKALSRQANAIKMNMEFQLANYKGNIDDKAKIKNAISETEILLNKSVEQAMKNTEKFMIKLSNSYLTKEMIPKVQDNLKNFDLETKKTLDKFIKEKEDILGTNLSSSLRRKVSIRLNKNIAFDINDIPFSEFDDLINQYKNEIEDYEVLNLGAEDGKIKDLSGTTSDINIGSDIELADGRENKAIKIKGSENSTIKIAMNKYLRFSATDNFSISFWIKHPKPTNLLNNGIEYTLVENFNQRGWKISIQDSKLIWYLRDHNNSIKIVTPDYIAFNGWNLITITNNRSKGSIVYVNGSKIEEKDISSIWNTEVDDPIIFRLKNNRDTQAFTLLDQFSIYRKELNQNEVVKLYNYYFNSNYIRDIWGNPLQYNKKYYLQTQDKPGKGLIREYWSSFGYDYVILSDSKTITFPNNIRYGALYNGSKVLIKNSKKLDGLVRNKDFIQLEIDGYNMGISADRFNEDTNYIGTTYGTTHDLTTDFEIIQRQEKYRNYCQLKTPYNIFHKSGLMSTETSKPTFHDYRDWVYSSAWYFQNYENLNLRKHTKTNWYFIPKDEGWDED

• SEQ ID NO: 42 - VAMP4_крысы (D4A560)

MPPKFKRHLNDDDVTGSVKSERRNLLEDDSDEEEDFFLRGPSGPRFGPRNDKIKHVQNQVDEVIDVMQENITKVIERGERLDELQDKSESLSDNATAFSNRSKQLRRQMWWRGCKIKAIMALAAAILLLMIITQIILHLKK

• SEQ ID NO: 43 - VAMP4_человека (O75379)

MPPKFKRHLNDDDVTGSVKSERRNLLEDDSDEEEDFFLRGPSGPRFGPRNDKIKHVQNQVDEVIDVMQENITKVIERGERLDELQDKSESLSDNATAFSNRSKQLRRQMWWRGCKIKAIMALVAAILLLVIIILIVMKYRT

• SEQ ID NO: 44 - VAMP5_крысы (Q9Z2J5)

MAGKELERCQRQADQVTEIMLNNFDKVLERDGKLSELQQRSDQLLDMSSAFSKTTKTLAQQKRWENIRCRVYLGLAVAGGLLLILVVLLVIFLPSGEDSSKP

• SEQ ID NO: 45 - VAMP5_человека (O95183)

MAGIELERCQQQANEVTEIMRNNFGKVLERGVKLAELQQRSDQLLDMSSTFNKTTQNLAQKKCWENIRYRICVGLVVVGVLLIILIVLLVVFLPQSSDSSSAPRTQDAGIASGPGN

• SEQ ID NO: 46 - YKT6_крысы (Q5EGY4)

MKLYSLSVFYKGEPKAVLLKAAYDVSSFSFFQRSSVQEFMTFTSQLIVERSAKGSRASVKEQEYLCHVYVRSDSLAGVVIADSEYPSRVAFTLLEKVLDEFSKQVDRIDWPVGSPATIHYTALDGHLSRYQNPREADPMSKVQAELDETKIILHNTMESLLERGEKLDDLVSKSEVLGTQSKAFYKTARKQNSCCAIM

• SEQ ID NO: 47 -YKT6_человека (O15498)

MKLYSLSVLYKGEAKVVLLKAAYDVSSFSFFQRSSVQEFMTFTSQLIVERSSKGTRASVKEQDYLCHVYVRNDSLAGVVIADNEYPSRVAFTLLEKVLDEFSKQVDRIDWPVGSPATIHYPALDGHLSRYQNPREADPMTKVQAELDETKIILHNTMESLLERGEKLDDLVSKSEVLGTQSKAFYKTARKQNSCCAIM

• SEQ ID NO: 48 - эпитоп VAMP

ETSAAKLKRKYWWK

• SEQ ID NO: 49 - эпитоп VAMP

FETSAAKLKRKYWWK

• SEQ ID NO: 50 -эпитоп VAMP

QFESSAAKLKRKYW

• SEQ ID NO: 51 -эпитоп VAMP

FESSAAKLKR

• SEQ ID NO: 52 -эпитоп VAMP

FESSAAKLKRKYWWK

• SEQ ID NO: 53 -эпитоп VAMP

ADALQAGASQF

• SEQ ID NO: 54 -эпитоп VAMP

ADALQAGASQ

• SEQ ID NO: 55 -эпитоп VAMP

RADALQAGASQF

• SEQ ID NO: 56-эпитоп VAMP

ADALQAGASQFE

• SEQ ID NO: 57-эпитоп VAMP

ADALQAGASVF

• SEQ ID NO: 58-эпитоп VAMP

ADALQAGASV

• SEQ ID NO: 59-эпитоп VAMP

ADALQAGASVFE

• SEQ ID NO: 60 -эпитоп VAMP

RADALQAGASVF

• SEQ ID NO: 61 -эпитоп VAMP

RADALQAGAS

• SEQ ID NO: 62 -эпитоп VAMP

SESLSDNATAF

• SEQ ID NO: 63 -эпитоп VAMP

SESLSDNATA

• SEQ ID NO: 64 -эпитоп VAMP

KSESLSDNATAF

• SEQ ID NO: 65 -эпитоп VAMP

SESLSDNATAFS

• SEQ ID NO: 66 -эпитоп VAMP

SDQLLDMSSTF

• SEQ ID NO: 67 -эпитоп VAMP

SDQLLDMSST

• SEQ ID NO: 68 -эпитоп VAMP

RSDQLLDMSSTF

• SEQ ID NO: 69 -эпитоп VAMP

SDQLLDMSSTFN

• SEQ ID NO: 70 -эпитоп VAMP

SDQLLDMSSAF

• SEQ ID NO: 71 -эпитоп VAMP

SDQLLDMSSA

• SEQ ID NO: 72 -эпитоп VAMP

RSDQLLDMSSAF

• SEQ ID NO: 73 -эпитоп VAMP

SDQLLDMSSAFS

• SEQ ID NO: 74 -эпитоп VAMP

RSDQLLDMSS

• SEQ ID NO: 75 -эпитоп VAMP

SEVLGTQSKAF

• SEQ ID NO: 76 -эпитоп VAMP

SEVLGTQSKA

• SEQ ID NO: 77 -эпитоп VAMP

KSEVLGTQSKAF

• SEQ ID NO: 78 -эпитоп VAMP

SEVLGTQSKAFY

Похожие патенты RU2807994C2

название год авторы номер документа
СРЕДСТВА И СПОСОБЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ПОЛИПЕПТИДОВ НЕЙРОТОКСИНА В КЛЕТКАХ 2014
  • Брюнн Корнелия
RU2704808C2
КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ИСПЫТАНИЙ НА ТОКСИКОГЕННОСТЬ 2012
  • Джонсон Эрик Артур
  • Пеллетт Сабин
  • Уайтмарш Регина Клэр Мейер
  • Тепп Уилльям Говард
RU2616281C2
МЕЧЕННЫЕ СОРТАЗОЙ НЕЙРОТОКСИНЫ КЛОСТРИДИЙ 2020
  • Лосс, Омар
  • Эллиот, Марк
RU2801120C2
СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИ ПРОЦЕССИРОВАННОГО ПОЛИПЕПТИДА 2012
  • Руммель Андреас
RU2673910C2
ГАНГЛИОЗИДЫ ДЛЯ СТАНДАРТИЗАЦИИ И ПОВЫШЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ КЛЕТОК К НЕЙРОТОКСИНАМ БОТУЛИЗМА В ТЕСТ-СИСТЕМАХ IN VITRO 2015
  • Эйзеле Карл-Хайнц
  • Мандер Герд
RU2694191C2
СПОСОБЫ ПРОИЗВОДСТВА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИ ПРОЦЕССИРОВАННЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ 2018
  • Руммель, Андреас
RU2719164C1
СПОСОБЫ ПОВЫШЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ЗАХВАТА БОТУЛИНОВЫХ НЕЙРОТОКСИНОВ КЛЕТКАМИ 2016
  • Яцке Клаудия
  • Эйзеле Карл-Хайнц
  • Мандер Герд
  • Финк Клаус
RU2684404C2
СПОСОБЫ ПРОИЗВОДСТВА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИ ПРОЦЕССИРОВАННЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ 2019
  • Руммель, Андреас
RU2727402C1
НЕЙРОТОКСИНЫ, ПРОЯВЛЯЮЩИЕ УКОРОЧЕННУЮ БИОЛОГИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ 2012
  • Шмидт Михаэль
  • Фреверт Юрген
  • Хофманн Фред
  • Гроэр Герхард
RU2646110C2
СИСТЕМА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕПРОЦЕССИРОВАННОГО И ЧАСТИЧНО ПРОЦЕССИРОВАННОГО НЕЙРОТОКСИНА ТИПА А 2010
  • Тэйлор Харольд В.
  • Айзеле Карл-Хайнц
  • Брюнн Корнелиа
RU2545825C9

Иллюстрации к изобретению RU 2 807 994 C2

Реферат патента 2023 года АНАЛИЗ РАСЩЕПЛЕНИЯ КЛЕТОЧНОГО VAMP

Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая способ получения поликлонального антитела (варианты). В одном варианте реализации способ включает выделение и дополнительную очистку поликлонального антитела, способного связываться с полноразмерным VAMP и C-концевым продуктом расщепления VAMP в лизате клеток, где C-концевой продукт расщепления VAMP получен расщеплением VAMP клостридиальным нейротоксином из крови, полученной от животного. Изобретение расширяет арсенал способов получения поликлональных антител, связывающихся с полноразмерным VAMP и C-концевым продуктом расщепления VAMP в лизате клеток. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл., 3 пр.

Формула изобретения RU 2 807 994 C2

1. Способ получения поликлонального антитела, включающий выделение и дополнительную очистку поликлонального антитела, способного связываться с полноразмерным VAMP и C-концевым продуктом расщепления VAMP в лизате клеток, где C-концевой продукт расщепления VAMP получен расщеплением VAMP клостридиальным нейротоксином, из:

крови, полученной от животного, которому были введены:

i. антигенный полипептид, причем антигенный полипептид включает эпитоп мембранного белка, ассоциированного с везикулами (VAMP), причем указанный антигенный полипептид состоит из 10-17 аминокислотных остатков, причем указанный эпитоп VAMP содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательность VAMP, содержащей по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, которые находятся непосредственно на С-конце от сайта расщепления клостридиальным нейротоксином в указанном VAMP;

ii. полипептид, содержащий антигенный полипептид, причем антигенный полипептид включает эпитоп VAMP, где указанный антигенный полипептид состоит из 10-17 аминокислотных остатков, причем указанный эпитоп VAMP содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности VAMP, содержащей по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, которые находятся непосредственно на С-конце от сайта расщепления клостридиальным нейротоксином в указанном VAMP, и где полипептид не содержит области из более чем 17 последовательных аминокислот, имеющих 100% идентичность последовательности с природной аминокислотной последовательностью VAMP; или

iii. антигенный белок, содержащий ковалентно связанный с носителем:

а) антигенный полипептид, где антигенный полипептид включает эпитоп VAMP, причем указанный антигенный полипептид состоит из 10-17 аминокислотных остатков, причем указанный эпитоп VAMP содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности VAMP, содержащей по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, которые находятся непосредственно на С-конце от сайта расщепления клостридиальным нейротоксином в указанном VAMP; или

полипептид, содержащий антигенный полипептид, где антигенный полипептид включает эпитоп VAMP, где указанный антигенный полипептид состоит из 10-17 аминокислотных остатков, причем указанный эпитоп VAMP содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности VAMP, содержащей по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, которые находятся непосредственно на С-конце от сайта расщепления клостридиальным нейротоксином в указанном VAMP, и где полипептид не содержит области из более чем 17 последовательных аминокислот, имеющих 100% идентичность последовательности с природной аминокислотной последовательностью VAMP.

2. Способ получения поликлонального антитела, включающий выделение и дополнительную очистку поликлонального антитела, способного связываться с полноразмерным VAMP и С-концевым продуктом расщепления VAMP в лизате клеток, где С-концевой продукт расщепления VAMP получен путем расщепления VAMP клостридиальным нейротоксином из яйца, полученного от животного, причем в яйцо введен:

i. антигенный полипептид, где антигенный полипептид включает эпитоп VAMP, причем указанный антигенный полипептид состоит из 10-17 аминокислотных остатков, причем указанный эпитоп VAMP содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности VAMP, содержащей по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, которые находятся непосредственно на С-конце от сайта расщепления клостридиальным нейротоксином в указанном VAMP;

ii. полипептид, содержащий антигенный полипептид, где антигенный полипептид включает эпитоп VAMP, где указанный антигенный полипептид состоит из 10-17 аминокислотных остатков, причем указанный эпитоп VAMP содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности VAMP, содержащей по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, которые находятся непосредственно на С-конце от сайта расщепления клостридиальным нейротоксином в указанном VAMP, и причем полипептид не содержит области из более чем 17 последовательных аминокислот, имеющих 100% идентичность последовательности с природной аминокислотной последовательностью VAMP; или

iii. антигенный белок, содержащий ковалентно связанный с носителем:

а) антигенный полипептид, где антигенный полипептид включает эпитоп VAMP, причем указанный антигенный полипептид состоит из 10-17 аминокислотных остатков, причем указанный эпитоп VAMP содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности VAMP, содержащей по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, которые находятся непосредственно на С-конце от сайта расщепления клостридиальным нейротоксином в указанном VAMP; или

b) полипептид, содержащий антигенный полипептид, причем антигенный полипептид содержит эпитоп VAMP, где указанный антигенный полипептид состоит из 10-17 аминокислотных остатков, где указанный эпитоп VAMP содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности VAMP, содержащей по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, которые находятся непосредственно с C-конца от участка расщепления нейротоксином клостридий в указанном VAMP, и причем полипептид не содержит области из более чем 17 последовательных аминокислот, имеющих 100% идентичность последовательности с природной аминокислотной последовательностью VAMP.

3. Способ получения моноклонального антитела, включающий:

(а) слияние клеток, продуцирующих антитела, с линией бессмертных клеток с использованием подходящего агента слияния с образованием клеток гибридомы, причем клетки, продуцирующие антитела:

i. были выделены от животного-хозяина, подвергшегося одной или более инъекций:

а) антигенного полипептида, причем антигенный полипептид включает эпитоп мембранного белка, ассоциированного с везикулами (VAMP), причем указанный антигенный полипептид состоит из 10-17 аминокислотных остатков, причем указанный эпитоп VAMP содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательность VAMP, содержащей по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, которые находятся непосредственно на С-конце от сайта расщепления клостридиальным нейротоксином в указанном VAMP;

b) полипептида, содержащего антигенный полипептид, где антигенный полипептид включает эпитоп VAMP, где указанный антигенный полипептид состоит из 10-17 аминокислотных остатков, причем указанный эпитоп VAMP содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности VAMP, содержащей по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, которые находятся непосредственно на С-конце от сайта расщепления клостридиальным нейротоксином в указанном VAMP, и причем полипептид не содержит области из более чем 17 последовательных аминокислот, имеющих 100% идентичность последовательности с природной аминокислотной последовательностью VAMP; или

с) антигенного белка, содержащего ковалентно связанный с носителем:

А. антигенный полипептид, где антигенный полипептид включает эпитоп VAMP, причем указанный антигенный полипептид состоит из 10-17 аминокислотных остатков, причем указанный эпитоп VAMP содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности VAMP, содержащей по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, которые находятся непосредственно на С-конце от сайта расщепления клостридиальным нейротоксином в указанном VAMP; или

В. полипептид, содержащий антигенный полипептид, где антигенный полипептид включает эпитоп VAMP, где указанный антигенный полипептид состоит из 10-17 аминокислотных остатков, причем указанный эпитоп VAMP содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности VAMP, содержащей по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, которые находятся непосредственно на С-конце от сайта расщепления клостридиальным нейротоксином в указанном VAMP, и где полипептид не содержит области из более чем 17 последовательных аминокислот, имеющих 100% идентичность последовательности с природной аминокислотной последовательностью VAMP; или

ii. представляют собой лимфоциты, иммунизированные in vitro:

a) антигенным полипептидом, где антигенный полипептид включает эпитоп VAMP, причем указанный антигенный полипептид состоит из 10-17 аминокислотных остатков, причем указанный эпитоп VAMP содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности VAMP, содержащей по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, которые находятся непосредственно на С-конце от сайта расщепления клостридиальным нейротоксином в указанном VAMP;

b) полипептидом, содержащим антигенный полипептид, где антигенный полипептид включает эпитоп VAMP, где указанный антигенный полипептид состоит из 10-17 аминокислотных остатков, причем указанный эпитоп VAMP содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности VAMP, содержащей по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, которые находятся непосредственно на С-конце от сайта расщепления клостридиальным нейротоксином в указанном VAMP, и где полипептид не содержит области из более чем 17 последовательных аминокислот, имеющих 100% идентичность последовательности с природной аминокислотной последовательностью VAMP; или

с) антигенным белком, содержащим ковалентно связанный с носителем:

А. антигенный полипептид, где антигенный полипептид включает эпитоп VAMP, причем указанный антигенный полипептид состоит из 10-17 аминокислотных остатков, причем указанный эпитоп VAMP содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности VAMP, содержащей по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, которые находятся непосредственно на С-конце от сайта расщепления клостридиальным нейротоксином в указанном VAMP; или

В. полипептид, содержащий антигенный полипептид, где антигенный полипептид включает эпитоп VAMP, где указанный антигенный полипептид состоит из 10-17 аминокислотных остатков, причем указанный эпитоп VAMP содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90% идентична последовательности VAMP, содержащей по меньшей мере 8 аминокислотных остатков, которые находятся непосредственно на С-конце от сайта расщепления клостридиальным нейротоксином в указанном ВАМР, и где полипептид не содержит области из более чем 17 последовательных аминокислот, имеющих 100% идентичность последовательности с природной аминокислотной последовательностью VAMP;

(b) идентификацию гибридомных клеток, которые продуцируют моноклональное антитело, способное связываться с полноразмерным VAMP и C-концевым продуктом расщепления VAMP в клеточном лизате, где C-концевой продукт расщепления VAMP получают путем расщепления VAMP клостридиальным нейротоксином;

(с) выделение клональной клеточной линии, экспрессирующей моноклональное антитело, с использованием процедур ограничивающего разведения; и

(d) получение моноклонального антитела.

4. Способ по любому из пп. 1-3, где указанный антигенный полипептид состоит из 10-16 аминокислотных остатков.

5. Способ по любому из пп. 1-4, где указанный антигенный полипептид состоит из 10-15 аминокислотных остатков.

6. Способ по любому из пп. 1-5, где указанный VAMP выбран из VAMP1, VAMP2, VAMP3, VAMP4, VAMP5 и/или YKT6.

7. Способ по любому из пп. 1-6, где указанный эпитоп VAMP содержит или состоит из аминокислотной последовательности, по меньшей мере на 90% идентичной последовательности VAMP, выбранной из: SEQ ID NO: 15 - SEQ ID NO: 34, и SEQ ID NO: 48 - SEQ ID NO: 78.

8. Способ по любому из пп. 1-7, где указанный эпитоп VAMP представляет собой эпитоп VAMP1, VAMP2 и/или VAMP3 и выбран из:

- эпитопа VAMP для BoNT/F или BoNT/D, содержащего или состоящего из KLSELDDRADALQ (SEQ ID NO: 15);

- эпитопа VAMP для BoNT/F5 или BoNT/FA, содержащего или состоящего из ERDQKLSELDDRA (SEQ ID NO: 32);

- эпитопа VAMP для BoNT/B или TeNT, содержащего или состоящего из FETSAAKLKRKYW (SEQ ID NO: 22) или FETSAAKLKRKYWWK (SEQ ID NO: 49); и

- эпитопа VAMP для BoNT/X, содержащего или состоящего из ADALQAGASQF (SEQ ID NO: 53).

9. Способ по любому из пп. 1-8, где полипептид, содержащий антигенный полипептид, не содержит область из более 16 или 15 последовательных аминокислот, имеющих 100% идентичности последовательности с аминокислотной последовательностью природного VAMP.

10. Способ по любому из пп. 1-9, где KD между указанным антителом и указанным эпитопом ниже, чем 10-7 M.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2023 года RU2807994C2

MOGHADDAM MM et al
Аппарат для очищения воды при помощи химических реактивов 1917
  • Гордон И.Д.
SU2A1
Способ сужения чугунных изделий 1922
  • Парфенов Н.Н.
SU38A1
Способ обработки грубых шерстей на различных аппаратах для мериносовой шерсти 1920
  • Меньшиков В.Е.
SU113A1
Экструзионная головка 1977
  • Бегишев Валерий Павлович
  • Бурштейн Бронислава Иосифовна
  • Славнов Евгений Владимирович
  • Шахов Сергей Владимирович
SU763131A1
US 8940477 B2 27.01.2015
ЯКУБКЕ Х.-Д
И ДР
Аминокислоты,

RU 2 807 994 C2

Авторы

Грэй, Бриони

Кадд, Верити

Биэрд, Мэттью

Даты

2023-11-21Публикация

2017-10-18Подача