Способ экспериментального моделирования сахарного диабета 2 типа в сочетании с менопаузой у самок крыс стока Wistar Российский патент 2023 года по МПК G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии и экспериментальной биологии, и предназначено для моделирования сахарного диабета (СД) 2 типа в сочетании с менопаузой у самок крыс стока Wistar.

Наиболее ранние данные о применении овариэктомии у крыс описаны в статье 1946 года Korenchevsky и Jones, (Korenchevsky V, Jones. VE. The effects of androsterone, oestradiol, and thyroid hormone on the artificial premature climacteric of pure gonadal origin produced by ovariectomy in rats; effects on weights of organs. J Gerontol. 1946;1(3 Pt 1):319-335. doi:10.1093/geronj/1.3_part_1.319), где авторы использовали овариэктомию для последующего изучения эффекта половых и тиреоидных гормонов. Безусловно, самые ранние исследования положили начало многочисленным экспериментам на овариэктомизированных животных.

Российские исследователи (Маградзе Р.Н., Лисовский А.Д., Лисовский Д.А., Попковский Н.А., Бобков П.С., Байрамов А.А., Дробленков А.В. Моделирование женского гипогонадизма путем ишемизации яичника и его морфофункциональное обоснование // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. 2022. Т. 20. № 3. С. 289-295.) для индукции менопаузы применяли ишемизацию яичников путем перевязки сосудов, а также последовательно вводили животным препараты эстрадиола и прогестерон для синхронизации цикла перед овариэктомией.

Что касается моделирования СД, наиболее изученной моделью является аллоксановая модель (Altunkaynak BZ, Unal D, Altunkaynak ME, et al. Effects of diabetes and ovariectomy on rat hippocampus (a biochemical and stereological study) // Gynecolndocrinol.2012;28(3):228-233. oi:10.3109/09513590.2011.593662). В данном эксперименте использовали самок крыс Sprague Dawley, а для моделирования СД применяли аллоксана моногидрат 150 мг/кг.

Российские исследователи (Паштаев Н.П., Поздеева Н.А., Мадянов И.В., Школьник Г.С., Гаглоев Б.В., Крестов Д.С., Максимов А.А. Влияние краткосрочной заместительной инсулинотерапии на концентрацию VEGF-а фактора во внутриглазной жидкости при аллоксановой модели сахарного диабета 2 типа у крыс // Вестник ВолГМУ. 2018; 4(68): 25-25. Doi 10.19163/1994-9480-2018-4(68)-25-27) применяли аллоксан в дозе 170 мг/кг. Препарат обладает высокой токсичностью, что обуславливает большой процент смертности среди испытуемых животных.

Liu и соавторы (Liu B, Feng W, Hasegawa T, Amizuka N, Li M. Type 1 diabetes mellitus induced low bone turnover in ovariectomized rats. Histol Histopathol. 2019;34(1):57-67. doi:10.14670/HH-18-024) в своем исследовании костного ремоделирования при сочетании СД 1 типа и менопаузы, а также Souza с группой исследователей в эксперименте по изучению эффекта физической активности на сердечно-сосудистую смертность выполняли самкам Wistar двустороннюю овариэктомию и затем моделировали СД 1 типа путем введения стрептозотоцина 50 мг/кг. Bansal и Chopra также применяли достаточно низкие дозы стрептозотоцина (45 мг/кг) у самок крыс Sprague Dawley после индукции менопаузы для изучения роли эстрогеновых рецепторов в эндотелиальной дисфункции. Lee с группой авторов в исследовании эффекта бисфосфонатов и модуляторов эстрогеновых рецепторов при сочетании СД 1 типа и менопаузы использовали более высокие дозы стрептозотоцина (100 мг/кг), а до выполнения овариэктомии крысы Wistar потребляли корм со сниженным содержанием фитоэстрогенов и были ограничены в физической активности. Данные исследователи в своих работах получили модель менопаузы при СД 1 типа. Однако, среди больных с СД более 90 процентов пациентов составляют больные СД 2 типа. СД 2 типа наиболее распространен среди населения старшего возраста, в том числе среди женщин в менопаузе. Все это диктует необходимость создания экспериментальной модели СД 2 типа в сочетании с менопаузой.

В исследовании эффекта физических нагрузок (Habibi P, Ahmadiasl N, Nourazarian A, Yousefi H. Swimming exercise improves SIRT1, NF-κB, and IL-1β protein levels and pancreatic tissue injury in ovariectomized diabetic rats. Horm Mol Biol Clin Investig. 2022;43(3):345-352. Published 2022 Apr 7. doi:10.1515/hmbci-2021-0069) авторы получили модель СД 2 типа и менопаузы, поскольку в их исследовании самки Wistar перед введением в эксперимент получали высокожировой корм, а СД моделировался с использованием ещё более низких доз стрептозотоцина (30 мг/кг).

Из известных способов в качестве прототипа к заявленному методу выбрано экспериментальное исследование российских авторов (Bayrasheva VK, Babenko AY, Dobronravov VA, Dmitriev Y V, Chefu SG, Pchelin IY, et al. Uninephrectomized High-Fat-Fed Nicotinamide-Streptozotocin-Induced Diabetic Rats: A Model for the Investigation of Diabetic Nephropathy in Type 2 Diabetes. 2016; Available from: http://dx.doi.org/10.1155/2016/8317850 http://dx.doi.org/10.1155/2016/8317850). Ученые создали модель, наиболее близкую к СД 2 типа, поскольку не только использовали достаточно низкие дозы стрептозотоцина (65 мг/кг), но и предварительно вводили животным панкреатопротектор никотинамид 230 мг/кг. Перед исследованием крысы Wistar получали высокожировой корм (коммерческий корм в смеси с животным жиром). Данная модель была успешно использована и в эксперименте (Simanenkova A, Minasian S, Karonova T, Vlasov T, Timkina N, Shpilevaya O, et al. Comparative evaluation of metformin and liraglutide cardioprotective effect in rats with impaired glucose tolerance. Sci Rep. 2021;11(1):1–12.) при изучении кардиопротективных свойств метформина и лираглутида.

Технический результат изобретения заключается в получении модели сахарного диабета СД 2 типа в сочетании с менопаузой у самок крыс стока Wistar, позволяющей воспроизвести модель пациента: женщина в менопаузе с СД 2 типа.

Технический результат достигается тем, что предварительно моделируют менопаузу путем двусторонней овариэктомии под анестезией золетилом 30 мг/кг и ксилазина гидрохлоридом 6 мг/кг: удаляют рога матки с окружающей их жировой тканью, яичниками и яйцеводами, рану ушивают; по истечении 2-х недель после проведения двусторонней овариэктомии моделируют СД 2 типа: сначала в течение 4-х недель крыс содержат на неограниченном потреблении высокожирового корма с обменной энергией 2690 ккал/кг, жира 22%, протеина 20%, далее вводят внутрибрюшинно раствор панкреатопротектора никотинамида в дозе 230 мг/кг и через 15 мин – раствор панкреатотоксина стрептозотоцина в дозе 60 мг/кг; на 2 и 3 сутки после введения препаратов определяют уровень глюкозы в случайной точке путем пункции хвостовой вены, при гликемии ≥11,1 ммоль/л диагностируют СД, при пограничных значениях гликемии ≥6,1ммоль/л и <11,1 ммоль/л проводят пероральный глюкозотолерантный тест, при котором определяют исходный уровень глюкозы, после чего перорально вводят 40% раствор глюкозы в количестве 3 г/кг и проводят повторные измерения гликемии через 15, 30, и 60 минут после введения раствора, СД подтверждают при значении гликемии в любой из точек ≥11,1 ммоль/л.

Применение заявленного способа путем проведения овариэктомии перед стрептозотоцин-никотинамид-индуцированном СД 2 типа позволяет, в отличие от аналогов, моделировать СД 2 типа в менопаузе, близкую к клинической практике, а именно развитие СД 2 типа у женщины в менопаузе.

Проводимые исследования подтверждаются иллюстрациями, где:

на фиг. 1 – представлен дизайн экспериментального исследования;

на фиг. 2 – представлены графики уровней гликемии (А) и веса (В) во время эксперимента;

на фиг. 3 – представлены диаграммы концентраций кальция и фосфора крыс Wistar в конце эксперимента;

на фиг. 4 – представлены диаграммы: А) Концентрации остеокальцина крыс Wistar в конце эксперимента, нг/мл; Б) Концентрации склеростина крыс Wistar в конце эксперимента, пмоль/л;

на фиг. 5 – представлены диаграммы: А) Концентрации RANKL крыс Wistar в конце эксперимента, пг/мл; Б) Концентрации остеопротегерина крыс Wistar в конце эксперимента, пмоль/л; В) Соотношение остеопротегерин/RANKL крыс Wistar в конце эксперимента;

на фиг. 6 – представлены фотографии эпифизарной области бедренной кости с костными балками крыс Wistar после эвтаназии;

на фиг. 7 – представлены диаграммы параметров гистоморфометрии костной ткани крыс Wistar.

Исследование выполнено на базе института экспериментальной медицины ФГБУ «Национального Медицинского Исследовательского Центра им. В.А. Алмазова» Минздрава РФ (Санкт-Петербург) в центре доклинических и трансляционных исследований.

В качестве экспериментальной модели использовались самки крыс стока Wistar массой 250-300 г. Всего было включено 18 самок крыс (n=18).  Акклиматизационный период составлял 14 дней с ежедневным осмотром животных на предмет состояния кожи, слизистых, поведения, двигательной активности, а также с еженедельным взвешиванием. После акклиматизационного периода в клетке содержалось от 2 до 5 крыс, потребление корма и воды было неограниченным. Также поддерживался постоянный температурный (22-25°C) и световой (свет с 8 до 20 ч) режимы и влажность воздуха (50-70%). Вес крыс измерялся 1 раз в 2 дня.

Изначально все животные получали стандартный корм (ЗАО «Тосненский комбикормовый завод»). Моделирование менопаузы проводилось путем двусторонней овариэктомии под анестезией золетилом (тилетамина гидрохлорид 30 мг/кг и золазепама гидрохлорид 30 мг/кг) и ксилазина гидрохлоридом 6 мг/кг. После обработки операционного поля раствором бетадина производился надрез кожи в области поясницы, тупым путем разделялись мышцы, острым путем – париетальная брюшина. После проникновения в брюшную полость захватывался сальник, яичник и яйцеводом и рог матки. Рог матки вместе с окружающей его жировой тканью перевязывался и отрезался вместе с яичником и яйцеводом. Затем процедура повторялась с другой стороны.

Через 2 недели после овариэктомии производилось моделирование СД 2 типа. В течение 4 недель и далее на протяжении всего эксперимента животные получали высокожировой корм («Про Корм», БиоПро, г. Новосибирскс обменной энергией 2690 ккал/кг, жир 22%, протеин 20%). Через 4 недели от начала содержания на высокожировой диете внутрибрюшинно вводился раствор панкреатопротектора никотинамида в дозе 230 мг/кг (Nicotimamide, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, США) и через 15 мин – раствор панкреатотоксина стрептозотоцина в дозе 60 мг/кг (Streptozocin, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, США). На 2 и 3 сутки после введения указанных препаратов определялся уровень глюкозы в случайной точке (не натощак, путем пункции хвостовой вены при помощи прибора определения кетонемии и гликемии (StatStrip, Nova Biomedical, США). СД 2 типа диагностировался при гликемии равной или более 11,1 ммоль/л, зафиксированной в двух измерениях в разные дни. При пограничных значениях гликемии (более или равной 6,1 ммоль/л и менее 11,1 ммоль/л) проводился пероральный глюкозотолерантный тест (ПГТТ). В ходе ПГТТ уровень глюкозы определялся исходно, после чего перорально вводился 40% раствор глюкозы в количестве 3 г/кг. Повторное измерение гликемии проводилось на 15, 30 и 60 минуте теста. СД 2 типа диагностировался при гликемии равной или больше 11,1 ммоль/л в любой из точек. При развитии абсолютной инсулиновой недостаточности или в случае, если СД 2 типа не развивался, животные исключались из эксперимента. Далее животные, которым вводился стрептозотоцин, находились на высокожировом корме на протяжении 4 недель. Повторное измерение гликемии производилось через 4 недели после процедур, и затем животные были разделены на группы: «Контроль» (самки без каких-либо вмешательств, получавшие стандартный корм, n=5), «ОЭ» (самки после овариэктомии, получавшие стандартный корм, n=5), «СД» (самки с СД 2 типа, получавшие высокожировой корм, n=4), «ОЭ+CД» (самки после овариэктомии с СД 2 типа, получавшие высокожировой корм, n=4). У животных без СД гликемию измеряли на 4, 8, 10, 12, 14 и 16 неделе исследования, в группах с СД 2 типа - на 2-й и 3-й день после введения стрептозотоцина, далее - в конце 8, 10, 12, 14 и 16 недели эксперимента. Измерение гликемии проводилось не натощак. Наблюдение за животными, включающее в себя осмотр, а также измерение гликемии и веса, продолжалось еще 8 недель, суммарная длительность опыта - 16 недель.

Проводимые наблюдения подтверждаются показателями (фиг. 2) гликемии и веса самок Wistar на протяжении эксперимента, где:

Контроль - самки без вмешательств, получавшие стандартный корм;

СД - самки без овариэктомии с СД 2 типа;

ОЭ - самки после овариэктомии;

ОЭ+СД - самки после овариэктомии с СД 2 типа.

Через 16 недель от начала эксперимента у животных под общей анестезией (методика описана ранее) забирали кровь из каудальной вены. В сыворотке крови исследовались следующие показатели: кальций общий, фосфор неорганический, остеокальцин, остеопротегерин (ОПГ), лиганд активатора рецептора ядерного фактора каппа-В (RANKL) с вычислением соотношения ОПГ/RANKL, склеростин, фактор роста фибробластов-23 (ФРФ-23). После эвтаназии биоматериал бедренных костей исследовался гистологически.

В результате достоверных отличий в концентрации общего кальция между группами не было. Уровень фосфора был значимо ниже как в группе «ОЭ» (1,63 [1,58; 1,65] ммоль/л), так и в группе «СД» (2,81 [2,57; 2,83] ммоль/л) по сравнению с группой «Контроль» (3,12 [2,55; 3,24] ммоль/л) (р <0,001 и р=0,014 соответственно). Однако, данный показатель был значимо выше в группе «ОЭ+СД» (2,79 [2,46; 2,81] ммоль/л) по сравнению с группой «ОЭ» (2,79 [2,46; 2,81] ммоль/л), р=0,025. Корреляции между концентрацией фосфора и показателем гликемии (а также между уровнем кальция и уровнем глюкозы) найдено не было. Стоит отметить, что изменение уровня фосфора не сопровождалось изменением концентрации ФРФ-23

Проводимые наблюдения (фиг. 3) представлены показателями фосфорно-кальциевого обмена крыс Wistar в конце эксперимента, где: А) Уровень кальция сыворотки, ммоль/л; Б) Уровень фосфора сыворотки, ммоль/л; В) Уровень ФРФ-23 сыворотки, пмоль/л

Контроль - самки без вмешательств

ОЭ - самки после овариэктомии

СД - самки с СД 2 типа

ОЭ+СД - самки после овариэктомии с СД 2 типа

* – p <0,05 по сравнению с группой «Контроль»

** – p <0,05 по сравнению с группой «ОЭ»

Уровень остеокальцина был достоверно ниже в группе «СД» (8,11 [7,84; 9,19] нг/мл) по сравнению с группой «Контроль» (16,97 [14,07; 17,07] нг/мл), р=0,005). Найдена слабая отрицательная корреляция (-0,536) между уровнем глюкозы и уровнем остеокальцина (р=0,03). Статистически значимых отличий в уровне склеростина между группами установлено не было

Проводимые наблюдения (фиг. 4) представлены показателями концентрации уровня остеокальцина и склеростина в сыворотке крови крыс Wistar в конце эксперимента, где: А) Концентрация остеокальцина, нг/мл; Б) Концентрация склеростина, пмоль/л.

Контроль - самки без вмешательств

ОЭ - самки после овариэктомии

СД - самки с СД 2 типа

ОЭ+СД - самки после овариэктомии с СД 2 типа

* p <0,05 по сравнению с группой «Контроль»

Уровень RANKL был значимо ниже в группе «ОЭ+СД» (278,1 [273,1; 289,7] пг/мл) по сравнению с группой «ОЭ», (400,6 [394,5; 415,1] пг/мл), а соотношение ОПГ/RANKL – выше (0,03 [0,02; 0,035] и 0,01 [0,004; 0,014] соответственно), р=0,05. В группе «ОЭ» получен более низкий уровень ОПГ (5,1 [1,5; 5,6] пмоль/л) и соотношения ОПГ/RANKL (0,01 [0,003; 0,014]), чем в группе «Контроль» (12,3 [8,8; 14,2] пмоль/л и (0,34 [0,33; 0,41], р=0,025 и р=0,07 соответственно. Корреляции данных показателей с уровнем гликемии не найдено.

Проводимые наблюдения (фиг. 5) - представлены показателями RANKL и остеопротегерина в сыворотке крыс Wistar и соотношение остеопротегерин/RANKL в конце эксперимента, где: А) RANKL, пг/мл, Б) Остеопротегерин, пмоль/л В) соотношение остеопротегерин/RANKL.

Контроль - самки без вмешательств

ОЭ - самки после овариэктомии

СД - самки с СД 2 типа

ОЭ+СД - самки после овариэктомии с СД 2 типа

* p <0,05 по сравнению с группой «Контроль»

** p <0,05 по сравнению с группой «ОЭ»

После эвтаназии биоматериал бедренных костей исследовался гистологически.

Площадь костных балок в зоне эпифиза была наибольшей в группе «Контроль» (42% [39; 45]) различия достоверны по сравнению с группой «ОЭ» (29 % [25; 33], p=0,011) и группой «ОЭ+СД» (30 % [23; 25], p=0,016). Площадь костных балок в зоне метаэпифиза также была наибольшей в группе «Контроль» (49% [46; 52]) по сравнению с группами «ОЭ» (35% [25; 39]), «СД» (31% [26; 34]), «ОЭ+СД» (35% [33; 38]), p <0,001. Различий в толщине костных балок между группами выявлено не было

Проводимые гистологические исследования биоматериала (фиг. 6) представлены эпифизарной областью бедренной кости с костными балками крыс Wistar, где:

Контроль - самки без вмешательств: в зоне эпифиза бедренной кости трабекулярное строение сохранено, костные балки формируют крупно-петлистую сеть, заполняющую пространство всей эпифизарной зоны. Площадь костных балок равна 42%. Метаэпифизарная пластинка выражена, представлена зрелыми и растущими костными балками, преимущественно с ровными краями, выражены линии цементации. Площадь костных балок в зоне метаэпифиза 49%. Средняя толщина костных балок 100,4 рх. Пространство между балками заполнено клеточным костным мозгом и адипоцитами в равном соотношении.

ОЭ - самки после овариэктомии: в зоне эпифиза бедренной кости трабекулярное строение сохранено, костные балки формируют крупно-петлистую сеть, заполняющую пространство всей эпифизарной зоны. Площадь костных балок по данным морфометрического исследования равна 29,3%. Метаэпифизарная пластинка выражена, представлена зрелыми и растущими костными балками, преимущественно с ровными краями. Площадь костных балок в зоне метаэпифиза 35,2%. Средняя толщина костных балок 99,3 рх. Пространство между балками заполнено клеточным костным мозгом и адипоцитами в равном соотношении.

СД - самки с СД 2 типа: в зоне эпифиза бедренной кости трабекулярное строение сохранено, костные балки формируют крупно-петлистую сеть, заполняющую пространство всей эпифизарной зоны. Площадь костных балок равна 37,9%. Метаэпифизарная пластинка выражена, преобладают зрелые костные балки. Площадь костных балок в зоне метаэпифиза 31,1%. Средняя толщина костных балок 89,6 рх. Пространство между балками заполнено клеточным костным мозгом и адипоцитами в равном соотношении.

ОЭ+СД - самки после овариэктомии с СД 2 типа: в зоне эпифиза бедренной кости трабекулярное строение сохранено, костные балки формируют крупно-петлистую сеть. Площадь костных балок равна 30,4%. Метаэпифизарная пластинка выражена, представлена зрелыми костными балками, встречаются балки с неровными краями и трещинами в костном матриксе, растущие балки практически не встречаются. Площадь костных балок в зоне метаэпифиза 35,4%. Средняя толщина костных балок 80,3 рх. Пространство между балками заполнено клеточным костным мозгом и адипоцитами в равном соотношении.

Параметры гистоморфометрии костной ткани крыс Wistar представлены на фиг. 7, где: А) Площадь костных балок в зоне эпифиза, %; Б) Площадь костных балок в зоне метаэпифиза; В) Толщина кортикальных балок, px.

ОЭ - самки после овариэктомии

СД - самки с СД 2 типа

ОЭ+СД - самки после овариэктомии с СД 2 типа

* p <0,05 по сравнению с группой «Контроль».

Изобретение относится к медицине, а именно к эндокринологии и экспериментальной биологии, и предназначено для моделирования сахарного диабета СД 2 типа в сочетании с менопаузой у самок крыс стока Wistar. Для этого моделируют менопаузу путем двусторонней овариэктомии под анестезией: удаляют рога матки с окружающей их жировой тканью, яичниками и яйцеводами, рану ушивают. По истечении 2-х недель после проведения двусторонней овариэктомии моделируют СД 2 типа: в течение 4-х недель крыс содержат на неограниченном потреблении высокожирового корма с обменной энергией 2690 ккал/кг, жира 22%, протеина 20%. Далее вводят внутрибрюшинно раствор панкреатопротектора никотинамида в дозе 230 мг/кг и через 15 мин – раствор панкреатотоксина стрептозотоцина в дозе 60 мг/кг. На 2 и 3 сутки после введения препаратов определяют уровень глюкозы в случайной точке путем пункции хвостовой вены. При гликемии ≥11,1 ммоль/л диагностируют СД. При пограничных значениях гликемии ≥6 ммоль/л и <11,1 ммоль/л проводят пероральный глюкозотолерантный тест, при котором определяют исходный уровень глюкозы, после чего перорально вводят 40% раствор глюкозы в количестве 3 г/кг и проводят повторные измерения гликемии через 15, 30 и 60 минут после введения раствора. СД подтверждают при значении гликемии в любой из точек ≥11,1 ммоль/л. Способ обеспечивает возможность получения модели пациента: женщина в менопаузе с СД 2 типа. 7 ил.

Способ экспериментального моделирования сахарного диабета (СД) 2 типа в сочетании с менопаузой у самок крыс стока Wistar, заключающийся в том, что предварительно моделируют менопаузу путем двусторонней овариэктомии под анестезией золетилом 30 мг/кг и ксилазина гидрохлоридом 6 мг/кг: удаляют рога матки с окружающей их жировой тканью и яичник с яйцеводами, рану ушивают; по истечении 2-х недель после проведения двусторонней овариэктомии моделируют СД 2 типа: в течение 4-х недель крыс содержат на неограниченном потреблении высокожирового корма с обменной энергией 2690 ккал/кг, жира 22%, протеина 20%, далее вводят внутрибрюшинно раствор панкреатопротектора никотинамида в дозе 230 мг/кг и через 15 мин – раствор панкреатотоксина стрептозотоцина в дозе 60 мг/кг; на 2 и 3 сутки после введения препаратов определяют уровень глюкозы в случайной точке путем пункции хвостовой вены; при гликемии ≥11,1 ммоль/л диагностируют СД, при пограничных значениях гликемии ≥6,1 ммоль/л и <11,1 ммоль/л проводят пероральный глюкозотолерантный тест, при котором определяют исходный уровень глюкозы, после чего перорально вводят 40% раствор глюкозы в количестве 3 г/кг и проводят повторные измерения гликемии через 15, 30, и 60 минут после введения раствора, СД подтверждают при значении гликемии в любой из точек ≥11,1 ммоль/л.