Способ создания трансляционной модели диабетического фенотипа хронической сердечной недостаточности Российский патент 2024 года по МПК A61K31/133 A61K31/137 A61K31/455 A61P43/00 G09B23/28 

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной кардиологии, эндокринологии и терапии, и может быть использовано для изучения патогенетических механизмов развития, прогрессирования диабетического фенотипа хронической сердечной недостаточности (ХСН) и исследования эффективности методов ее лечения.

Актуальной тенденцией в современном здравоохранении является преобладание в структуре заболеваемости хронических страданий, генез которых имеет преимущественно мультифакторный характер, отличающийся системностью поражения и коморбидностью [Клинические рекомендации: коморбидная патология в клинической практике, 2017]. Коморбидность при ХСН, является самостоятельным сложным фактором риска летальности и повторных госпитализаций. Данный факт привел к необходимости фенотипирования пациентов с ХСН не только с учетом фракции выброса левого желудочка, но и по наличию сопутствующей патологии [Клинические рекомендации: хроническая сердечная недостаточность, 2020; Choy М. et al., 2022].

В настоящее время сочетание ХСН и сахарного диабета (СД) 2 типа считается одним из наиболее распространенных и неблагоприятных дуэтов [Багрий А.Э. и соавт., 2020]. Известно, что СД увеличивает риск преждевременной смерти у пациентов с сердечной недостаточностью [Ohkuma Т. et al., 2019]. Частота встречаемости СД 2 типа выше у больных с ХСН, чем в общей популяции [Packer М., 2018]. Результаты Фрамингемского исследования показали, что СД является независимым фактором риска ХСН, увеличивая в 2 раза вероятность ее развития у мужчин и в 5 раз у женщин [Hajar R., 2017]. Избыточная масса тела (особенно висцеральное ожирение), гипергликемия, инсулинорезистентность, хроническое низкоинтенсивное воспаление приводят к активации микрососудистой коронарной дисфункции, апоптотической гибели кардиомиоцитов (КМЦ), фиброза миокарда, неблагоприятному ремоделированию сердца и развитию ХСН [Packer М. et al., 2020]. Учитывая, что когорта пациентов с сердечной недостаточностью с сохраненной фракцией выброса, отличающаяся фенотипическим разнообразием, на сегодняшний день не имеет доказательной базы по эффективным методам лечения, влияющим на прогноз, разработка экспериментальных моделей для ее исследования является крайне перспективным направлением.

Анализ литературных данных показал, что изучение патогенетических механизмов структурно-функциональных изменений миокарда, развивающихся при ХСН и СД 2 типа, а также способов их терапевтической коррекции проводится с использованием экспериментальных моделей отдельных монопатологий (экспериментальной сердечной недостаточности, экспериментального сахарного диабета 2 типа). Сложность патогенеза ХСН, значимый вклад сопутствующих заболеваний в ее развитие, вызывает необходимость в разработке комбинированных моделей сердечной недостаточности, позволяющих имитировать многофакторные условия ее формирования у реального пациента.

По результатам анализа проведенных ранее исследований в экспериментальной кардиологии авторы изобретения не обнаружили конкретных рекомендаций и способов моделирования диабетического фенотипа хронической сердечной недостаточности. Однако известны способы моделирования экспериментальной сердечной недостаточности (ЭСН) и экспериментального сахарного диабета 2 типа (ЭСД2Т).

Все известные способы моделирования ЭСН можно разделить на хирургические, генетические и фармакологические.

Наиболее распространенными хирургическими способами являются моделирование постинфарктной сердечной недостаточности путем перевязки нисходящей ветви левой коронарной артерии [Крыжановский и соавт., 2018], также для этой цели используют формирование соустья полостей сердца или магистральных сосудов и наложение аорто-кавальной фистулы [Липатов В.А. с соавт., 2007]; создание сужения восходящей части аорты путем использования швов или наложения металлических зажимов [Gs А.К. et al., 2014]; формирование аневризмы левого желудочка [Стакан И.Н. с соавт., 2005]; введение в плевральную полость силиконового масла [Сидоров А.В., 2012]; криогенное повреждение сердца [Grisel P. et al., 2008]. Хирургические способы имеют ряд недостатков: трудоемкость и сложность выполнения (особенно на мелких экспериментальных животных), травматичность, высокая летальность, развитие тромбоэмболических и инфекционно-воспалительных осложнений.

Для формирования генетически-обусловленных моделей сердечной недостаточности используются трансгенные модели мышей и крыс с дефицитом дистрофина [Fayssoil A. et al., 2013]; с генетическими дефектами, приводящими к развитию дилатационной кардиомиопатии (КМП) с последующим формированием сердечной недостаточности [Unsold В. et al., 2012], гипертрофической КМП [de Lange W.J. et al., 2013]; генетическая модель дефицита лептина [Cle'ment К., 2006] и его рецепторов ab/db [Alex L. et al. 2018]; модель ускоренного старения мышей, полученная путем селективного инбридинга AKR/J [Karuppagounder V. et al., 2017]. Существует ряд недостатков описанных способов: они позволяют изучать только вклад отдельных генетических факторов и сигнальных путей в патогенезе ХСН (не учитывая многофакторность патологии, характерную для клинической практики) и являются экономически затратными.

Фармакологические способы моделирования сердечной недостаточности включают применение доксорубицина [Agbulut О. et al., 2003]; ангиотензина II [Shen Y. et al., 2016]; монокроталина [Казаченко А.А., с соавт., 2008]; неселективного β-адреностимулятора изопротеренола [Anamalley R. et al., 2022]. Недостатками описанных моделей являются токсическое влияния данных препаратов на миокард и отсутствие комплексного влияния факторов, запускающих важные патогенетические механизмы развития ХСН, характерные для клинической практики.

Также описан способ моделирования экспериментальной сердечной недостаточности (ЭСН) [Инчина В.И. с соавт., «Состояние миокарда в модельной ситуации активации гипертензивных механизмов», 2000; Лискова Ю.В. с соавт., «Экспериментальные модели сердечной недостаточности: состояние вопроса и результаты собственного исследования», 2014], который выполняется путем подкожного введения крысам 1% раствора мезатона в дозе 0,1 мл с последующей физической нагрузкой (плавание в резервуаре с водой 25-30 мин до глубокого утомления) ежедневно в течение 10 суток. Недостатки данного способа: моделирование монопатологии (воспроизводится сердечная недостаточность в «чистом виде»), а также вероятность развития острой сердечной недостаточности в результате длительной физической нагрузки на фоне введения альфа-адреномиметика (мезатона).

Моделирование ЭСД2Т по литературным данным возможно несколькими способами: генетическими, негенетическими (индуцированные химическими диабетогенными веществами, диетические), хирургическими и комбинированными.

Среди хирургических методов моделирования ЭСД2Т используется частичная резекция поджелудочной железы, характеризующаяся, как правило, развитием умеренной гипергликемии, не приводя к набору массы тела животного, характерного для пациентов с СД 2 типа. Кроме того, данная модель технически трудоемка, особенно для мелких лабораторных животных. Существует модифицированный метод депанкреатизации с частью двенадцатиперстной кишки и последующим наложением энтеро-энтероанастомоза для формирования СД [Sharif A. et al., 2014]. В настоящее время чаще применяется частичная панкреатэктомия в комбинации с введением диабетогенных веществ для создания СД 2 типа [Risbud M.V. et al., 2002].

Недостатками хирургических способов являются техническая сложность выполнения, высокая травматизация животного, высокий риск развития осложнений в послеоперационном периоде и высокая летальность.

Генетические методы моделирования ЭСД2Т заключаются в использовании животных инбредной линии. В 1965 году описана модель инсулиннезависимого сахарного диабета в сочетании с ожирением у мышей линии C57BL/KsJ-db/db; далее у крыс линии Otsuka Long-Evans Tokushima Fatty и без ожирения у крыс линии Goto-Kakizaki [Leiter Е.Н. et al., 1987; Chatzigeorgiou A. et al., 2009], а также ряд других [Мазо В.К. и соавт., 2015]. Недостатки генетических моделей: наличие, как правило, и других наследственных нарушений (бесплодие, нарушение иммунитета, задержка роста и т.д.), высокая стоимость, они не всегда доступны для широкого использования.

Негенетические способы моделирования СД включают применение диабетогенных веществ, изменение рациона питания или их комбинацию.

Описан способ многократного внутрижелудочного введения 40% раствора глюкозы для индукции СД [Осипова В.В. с соавт., 2019]. Модель характеризуется непродолжительным эффектом гипергликемии, техническими трудностями выполнения и отсутствием влияния дополнительных патогенетических факторов, характерных для организма человека. Кроме того, возможно использование глюкокортикоидов (преднизолона и дексаметазона) для формирования СД [Shafrir Е., 2003]. Метод доступен, технически прост.Однако существенным недостатком способа является моделирование особой формы лекарственно-индуцированного «стероидного» сахарного диабета, а не СД 2 типа. Среди цитостатических химических диабетогенных веществ описана модель с дитизоном, где в качестве наиболее оптимального объекта описаны кролики, а не мелкие лабораторные животные [Самотруева М.А. и соавт., 2019].

Известен способ формирования экспериментального СД 2 типа с использованием диабетогенного цитостатика стрептозотоцина. Описаны следующие методы: внутрибрюшинное дробное введение стрептозотоцина в дозе 70 мг/кг в течение 5 суток обеспечивает получение стабильной модели СД у крыс при практическом отсутствии их потери в процессе эксперимента [Скалецкая Г.Н. с соавт. «Стрептозотоциновая модель стабильного сахарного диабета», 2018]; однократное введение стрептозотоцина в дозе 60 мг/кг внутрибрюшинно, спустя 15 мин после введения никотинамида в дозе 230 мг/кг [Можейко Л.А. «Экспериментальные модели для изучения сахарного диабета часть II. Хирургический, стрептозотоциновый и дитизоновый диабет», 2013]; неонатальные формы СД 2 типа - внутритрибрюшинное однократное введение стрептозотоцина в дозе 100 мг/кг массы тела на вторые сутки после рождения крысам линии Вистар или в дозе 80 мг/кг стрептозотоцина 5-суточным крысятам [Чуканова Г.Н. с соавт. «Моделирование сахарного диабета 2 типа для изучения лекарственных средств с антидиабетической активностью», 2014]; модель экспериментального сахарного диабета 2 типа, основанная на частичном повреждении β-клеток поджелудочной железы в результате многократного введения низких доз стрептозотоцина (15 мг/кг) в течение 5 дней крысам-самцам линии Вистар [Bobkiewicz-Kozlowska Т. et al. «Hypoglycaemic effect of quinolizidine alkaloids - lupanine and 2-thionosparteine on non-diabetic and streptozotocin-induced diabetic rats», 2007].

Недостатки описанных методов: индуцируется диабет с выраженной инсулинопенией без ожирения, дислипидемии и инсулинорезистентности, что, как правило, не характерно для сахарного диабета 2-го типа. Использование вышеупомянутых моделей не позволяет оценить вклад ряда других значимых патогенетических механизмов, характерных для развития СД 2 типа.

Описаны комбинированные способы моделирования ЭСД2Т цитостатиками в сочетании с изменением диеты. Одним из таких способов является добавление в стандартный рацион животного фруктозы [Patel R. et al., 2015]. По методике Zhang М. et al. (2009) крысам-самцам линии Вистар в комбинации с высокожировой диетой двукратно с семидневным интервалом вводили стрептозотоцин 30 мг/кг для формирования ЭСД2Т [Zhang М. et al. «The characterization of high-fat diet and multiple low-dose streptozotocin induced type 2 diabetes rat model», 2009]. Srinivasan K. et al. (2007) моделировали ЭСД2Т путем введения стрептозотоцина 35 мг/кг внутрибрюшинно после 14-ти суток диеты с высоким содержанием жира крысам-самцам линии Sprague-Dawley [Srinivasan K. et al. «Animal models in type 2 diabetes research: An overview)), 2007]. В 2007 году Islam M. and Choi H. описали способ создания ЭСД2Т путем внутрибрюшинного введения никотинамида (230 мг/кг) и стрептозотоцина (65 мг/кг) семинедельным крысам-самцам Sprague-Dawley после предварительного двухнедельного содержания их на высокожировой диете, а также ими описан способ моделирования ЭСД2Т в результате введения СТЗ 40 мг/кг после 2-х недель диеты с высоким содержанием жира, но без введения никотинамида [Islam M.S., Choi Н. «Nongenetic model of type 2 diabetes: a comparative study)), 2007]. Среди комбинированных моделей следует отметить работу Байрашевой В.К. с соавторами (2016), где сформированы стрептозотоциновый СД 2 типа и диабетическая нефропатия, для изучения ранних стадий диабетической нефропатии и возможностей ее коррекции [Байрашева В.К. и соавт. «Новая модель сахарного диабета 2-го типа и диабетической нефропатии у крыс», 2016].

Описанные модели, сочетающие в себе высокожировое питание и введение стрептозотоцина, позволяют воспроизвести наиболее характерные метаболические нарушения (ожирение, инсулинорезистентность, гипергликемия) и естественное течение сахарного диабета 2 типа. Однако существенным недостатком представленных моделей является моделирование изолированно экспериментального СД 2 типа и на его фоне развитие диабетической кардиомиопатии, без формирования диабетического фенотипа ХСН. Это затрудняет изучение сложных молекулярных сигнальных путей развития, прогрессирования диабетического фенотипа ХСН, разработки эффективных методов целенаправленного воздействия на общие патогенетические пути, трансляции результатов в клиническую практику.

Задача изобретения заключается в создании физиологичного, низкотравматичного, доступного способа моделирования многофакторной патологии - хронической сердечной недостаточности, ассоциированной с СД 2 типа. Разработка способа требует оригинального комбинирования усовершенствованных методик моделирования экспериментального сахарного диабета и хронической сердечной недостаточности в сочетании с высокожировой диетой и максимально переносимой физической нагрузкой. Технический результат

В эксперименте на половозрелых особях крыс обоего пола линии Вистар получена новая комбинированная, полиэтиологическая модель диабетического фенотипа ХСН, в основе которой лежит каскад патогенетических механизмов повреждения миокарда, приводящих к развитию стойких метаболических нарушений и структурно-функциональных изменений сердца. Способ доступен, технически прост, осуществим в условиях любого вивария, не требует специального оборудования, крыс специальной породы с измененным генетическим аппаратом, характеризуется 100%-й воспроизводимостью у особей обоего пола, отсутствием летальности.

Предложенный способ основан на оригинальной идее комбинирования двух нозологий путем их усовершенствования и модификации, а также использования важных факторов старения крыс и высококалорийной диеты. За счет многофакторности (старение, алиментарное ожирение, инсулинорезистентность, хроническая гипергликемия, артериальная гипертензия) удается воспроизвести трансляционную модель, максимально соответствующую реальной клинической практике и часто встречающуюся у пациентов с диабетическим фенотипом ХСН. Модель имеет важное практическое значение, так как дает возможность на доклиническом этапе изучать новые сигнальные пути и молекулярные мишени патогенеза ХСН, ассоциированной с СД 2 типа и апробировать новые средства и способы ее профилактики и лечения.

Технический результат достигается путем одновременной активации нескольких звеньев патогенеза диабетического фенотипа хронической сердечной недостаточности. Моделирование на 12-месячных крысах обоего пола позволяет учитывать фактор старения в ремоделировании миокарда, а также особенности с учетом половой принадлежности. Под влиянием ВЖД отмечается стабильный набор веса крыс в течение всего периода наблюдения. Это приводит к развитию алиментарного ожирения и, как следствие, инсулинорезистентности, что является одним из ключевых звеньев патогенеза СД 2 типа. Использование в качестве цитотоксического агента СТЗ обосновано тем, что он избирательно проникает в β-клетки посредством переносчика GLUT-2. В сравнении с другими диабетогенными цитостатиками он менее панкреатотоксичен, следовательно, обеспечивается более высокая жизнеспособность исследуемых животных. Введение СТЗ в дозе 40 мг/кг обусловлено тем, что более высокие дозы (50-65 мг/кг) приводят к быстрому массивному развитию некроза β-клеток поджелудочной железы и, как правило, развитию абсолютной инсулинопении, что характерно для' патофизиологии СД 1 типа, а более низкие дозы (20-30 мг/кг) - к нестабильным нарушениям углеводного обмена, по типу нарушения толерантности к глюкозе. Самостоятельное введение СТЗ, по данным литературы, приводит к необратимому повреждению β-клеток поджелудочной железы, поэтому с целью цитопротекции перед введением СТЗ выполняется инъекция никотинамида.

Под воздействием мезатона в сочетании с регулярной физической активностью возникает активация α-адренорецепторов с развитием генерализованной вазоконстрикции, приводящей к повышению общего периферического сопротивления, а также увеличению пост- и преднагрузки и повышению системного артериального давления. Применение мезатона в комбинации с ежедневным плаванием до утомления в течение 14 дней приводит к длительной гиперактивации нейрогуморальных систем (симпатоадреналовой и ренин-ангиотензин-альдостероновой), увеличению потребности миокарда в кислороде и последующим истощением адаптационных механизмов в организме животного, стойкому ремоделированию миокарда и развитию хронической сердечной недостаточности.

Новизна изобретения заключается в том, что эксперименте на половозрелых особях крыс обоего пола линии Вистар получена не описанная ранее, комбинированная, полиэтиологическая модель диабетического фенотипа ХСН, в основе которой лежит каскад патогенетических механизмов повреждения миокарда, приводящих к развитию стойких метаболических нарушений и структурно-функциональных изменений сердца (за счет использования крыс обоего пола линии Вистар старшего возраста (12 месяцев, следовательно, учет влияния фактора старения); увеличения длительности наблюдения от момента введения стрептозотоцина (составила 42 дня); длительности высокожировой диеты (ВЖД) до 42 дней; увеличения доли жира в рационе путем добавления свиного сала (50 г/кг) и сливочного масла (10 г/кг); внутривенного введения никотинамида в высокой дозе (250 мг/кг) с целью лучшей протекции β-клеток поджелудочной железы; изменения способа введения стрептозотоцина (СТЗ) на внутривенный; изменения дозы мезатона (0,5 мл/кг) и способа введения на внутримышечный; увеличения продолжительности введения мезатона до 14 дней; сокращения длительности до 15 минут и увеличения продолжительности физической нагрузки до 14 дней). Кроме того, представленный авторами способ позволяет воспроизвести естественное развитие диабетического фенотипа ХСН с учетом патогенетических особенностей его формирования, подобных тем, что присутствуют у пациентов в клинической практике. Предлагаемый способ дает возможность изучать механизмы структурно-функциональных изменений миокарда, развивающихся под влиянием ожирения, инсулинорезистентности, хронической гипергликемии, СД 2 типа, старения, гипертонии. Также способ позволяет исследовать механизмы медикаментозного и немедикаментозного воздействия различных средств и факторов на доклиническом этапе.

Сущность изобретения.

Для моделирования диабетического фенотипа ХСН авторы предлагают способ, который включает содержание 12-месячных крыс-самцов и крыс-самок линии Вистар на высококалорийной диете (основной корм и дополнительно по 50 г/кг свиного сала и по 10 г/кг сливочного масла ежедневно) в течение 42 суток, однократное внутривенное введение 2,5% раствора никотинамида в дозе 250 мг/кг и стрептозотоцина в дозе 40 мг/кг на 21 сутки высококалорийной диеты, а также ежедневное введение 1% раствора мезатона в дозе 0,5 мл/кг внутримышечно на фоне физической нагрузки (плавание) в течение 15 минут с 28-х по 42-е сутки эксперимента (на протяжении 14-ти суток). На 42-е сутки животных выводили из эксперимента, полученный миокард был подвергнут комплексному гистологическому исследованию (световая микроскопия, иммуногистохимия, морфометрия).

Осуществление изобретения

Способ моделирования диабетического фенотипа ХСН осуществляется по следующей методике. До достижения 12-месячного возраста всех исследуемых животных (n=32) содержат в стандартных условиях вивария. Затем случайным образом формируются 2 группы: 12 животных (6 самцов и 6 самок) - группа контроля; 20 животных (10 самцов и 10 самок) - основная группа (для моделирования диабетического фенотипа ХСН). В течение 42-х суток животные основной группы получают диету с высоким содержанием жира. Повышение калорийности рациона крысам обеспечивается ежедневным добавлением к основному корму 50 г свиного сала и 10 г сливочного масла из расчета на 1000 г массы животного. Жировая нагрузка, увеличивающая общую калорийность рациона, приводит к развитию алиментарного ожирения, как следствие, инсулинорезистентности и способствует нарушению углеводного обмена в организме крыс. Помимо высокой жировой диеты модель включает в себя однократное введение СТЗ, а также инъекции раствора мезатона в течение 14 суток в сочетании с динамической физической нагрузкой (в виде плавания в резервуаре с водой в течение 15 минут).

Экспериментальная работа выполнена на половозрелых крысах-самцах и крысах-самках линии Вистар (возраст 12 месяцев). До достижения 12-месячного возраста все исследуемые животные (n=32) содержались в стандартных условиях вивария. Затем животных разделили на 2 группы случайным образом: 1-я группа (n=12) - интактные животные (6 самок и 6 самцов); 2-я группа (n=20) - для моделирования диабетического фенотипа ХСН (10 самок и 10 самцов).

Крысы первой (контрольной) группы получали стандартное питание вивария, по окончании эксперимента были декапитированы с использованием эфирного рауш-наркоза.

Крысы основной группы в течение 42 суток получали высококалорийное питание (основной корм + 50 г свиного сала и 10 г сливочного масла на 1000 г веса). На 21-ые сутки высокожировой диеты была выполнена инъекция 2,5% раствора никотинамида («Sigma Aldrich», США) внутривенно в дозе 250 мг/кг веса животного. Через 15 мин внутривенно был введен раствор стрептозотоцина («Sigma Aldrich», США) в дозе 40 мг/кг веса животного. С 28-ых суток высокожировой диеты (на 7-е сутки после введения стрептозотоцина) в течение 14 суток внутримышечно вводили 1% раствор мезатона («Гедеон Рихтер», Венгрия) в дозе 0,5 мл/кг веса животного с последующим плаванием до утомления (15 минут).

Животных взвешивали перед началом высокожировой диеты, на 14-й, 21-й и 42-й сутки высококалорийного питания, определяя прирост массы тела. Измерение уровня глюкозы крови производилось перед введением стрептозотоцина, а также на 1-е, 3-й, 7-е, 14-е, 21-е сутки после введения стрептозотоцина глюкометром «One Touch Select plus» с использованием соответствующих тест-полосок («LifeScan», США), фиксировался уровень гликемии (отмечалась стойкая умеренная гипергликемия). Определение уровня N-концевого натрийуретического пептида (NTproBNP) проводили до проведения эксперимента, на 35-е и 42-е сутки от начала высокожировой диеты иммуноферментным анализом («Cloud-Clone Corp», Китай) путем забора крови из хвостовой вены. Также перед выполнением эксперимента и на 42-е сутки наблюдения (от начала высокожирового питания) выполнялась трансторакальная эхокардиография (ультразвуковой сканер «Chinson», Китай) с целью определения фракции выброса левого желудочка (ФВ ЛЖ). Отмечалось умеренное снижение ФВ ЛЖ на 10-12% в сравнении с группой контроля (интактные животные). На 42-е сутки животных выводили из эксперимента путем декапитации под эфирным рауш-наркозом. Осуществляли измерение массы сердца, измерение толщины задней стенки (ТЗС) ЛЖ и забор органов (сердце, печень, поджелудочная железа) для дальнейшего гистологического исследования. Полученный материал был фиксирован в 10% забуференном растворе формалина, обезвожен и пропитан парафином. Срезы толщиной 4-5 мкм были выполнены на микротоме «Leica SM2000 R» (Германия), фиксированы на стекла с поли-Ь-лизиновым покрытием («БиоВитрум», Россия) и окрашены гематоксилином Майера и эозином. Также гистопрепараты были инкубированы с моноклональными антителами к caspase-3, bcl-2 в разведении 1:50 («Cloud-Clone Corp», Китай). Изучение микроскопической структуры срезов, иммуногистохимический анализ микропрепаратов [Kumar G.L., 2011] и фотографирование срезов выполнялось на тринокулярном микроскопе МХ-300Т «MikroOptix» (Австрия) при увеличении ^×400. На экран внешнего компьютера изображение выводилось через насадку «Touptek Photonics». Анализ морфометрических показателей проводили в соответствии с разработанными стандартами [Автандилов Г.Г., 1984] с определением диаметра кардиомиоцитов (КМЦ) и их ядер, объемной плотности (ОП) КМЦ, стромы, капилляров, с расчетом трофического индекса (ТИ) с использованием программы «ImageJ 1.48v» (США). Число caspase-3 и bcl-2 иммунопозитивных КМЦ определяли, как отношение к общему числу клеток в случайно выбранных 20 полях зрения, умноженное на 100%. Полученные данные были статистически обработаны с использованием программы «Statistica 12.0» (StatSoft, США). Для сравнения количественных признаков применяли t-критерий Стьюдента. Различия считали статистически значимыми при р≤0,05.

Результаты исследования.

Клиническая оценка состояния интактных животных не выявила признаков патологии. Оценка состояния животных 2-й группы обнаружила появление признаков сердечной недостаточности (одышка, синюшность кончика носа, лап, ушек (акроцианоз), пастозность нижних конечностей после введения мезатона и плавания; изменения в пищевом поведении (возросла потребность в воде после введения СТЗ, увеличение количества и кратности приемов пищи); снижение подвижности и активности по мере увеличения массы тела (ожирение). Прирост массы тела к 42-му дню высокожировой диеты составил в среднем 155,7% у самцов и 114,8%» у самок. У животных с диабетическим фенотипом ХСН установлены увеличение массы сердца и толщина задней стенки ЛЖ (табл. 1).

Показатели уровня глюкозы крови у животных группы контроля были в пределах нормы. У крыс исследуемой группы отмечалась стойкая умеренная гипергликемия на протяжении всего исследования (табл.2). Измерение уровня NTproBNP в крови выявило его увеличение у крыс с ХСН в сочетании с СД 2 типа в сравнении с группой контроля (табл. 2).

При проведении эхокардиографического исследования обнаружено умеренное снижение ФВ ЛЖ у крыс с экспериментальной сердечной недостаточностью и СД 2 типа. У крыс группы контроля ФВ ЛЖ была в пределах физиологической нормы (табл. 3).

Для оценки выраженности ремоделирования миокарда на тканевом и клеточном уровнях после моделирования диабетического фенотипа ХСН проводилось комплексное гистологическое исследование сердца.

У животных контрольной группы при световой микроскопии миокарда ЛЖ патологических изменений выявлено не было (Фиг. 1): определялись КМЦ с четкими контурами, овальными ядрами, расположенными преимущественно центрально (1); сохранялась поперечная исчерченность цитоплазмы (2) равномерные прослойки рыхлой соединительной такни между сердечными миоцитами.

Миокард ЛЖ крыс с диабетическим фенотипом ХСН (Фиг. 2, Фиг. 3, Фиг. 4) характеризовался фенотипической гетероморфностью КМЦ с периферическим расположением ядер, с вакуолизированной парануклеарной цитоплазмой (3), наблюдалась выраженная структурная перестройка и разрушение комплексов сердечных миоцитов (3, 6), разволокнение, отек миокарда, фиброз стромальных соединительно-тканных компонентов (7); встречались участки венозного и капиллярного полнокровия (сладж эритроцитов в просвете капилляров) (4, 5, 8).

Существенные изменения были определены при морфометрическом анализе миокарда и иммуногистохимическом исследовании (ИГХ) при оценке экспрессии маркеров апоптоза caspase-3 и bcl-2 у животных с диабетическим фенотипом ХСН (табл. 4).

Установлено снижение ОП КМЦ, ОП капилляров, увеличение ОП стромальных соединительнотканных компонентов и активация апоптотических механизмов в миокарде у животных основной группы (табл. 4).

Пример применения №1.

По предложенному способу создания трансляционной модели диабетического фенотипа хронической сердечной недостаточности, у крысы-самца №23 после введения стрептозотоцина (на 28-е сутки эксперимента) наблюдались изменения в пищевом поведении (возросла потребность в воде, увеличение количества и кратности приемов пищи); снижение подвижности и активности по мере увеличения массы тела. После введения мезатона и плавания у животного стали нарастать признаки сердечной недостаточности (на 38 сутки эксперимента): одышка, синюшность кончика носа, лап, ушек (акроцианоз), пастозность нижних конечностей. К 42 суткам высокожировой диеты отмечался прирост массы тела: с 270,6 г до 618,3 г (прирост 128,5%). Измерение массы сердца и толщины задней стенки ЛЖ после выведения животного из эксперимента показало их увеличение в сравнении с интактными самцами: масса сердца самца №23 - 1315 г, ТЗС ЛЖ - 2,88 мм. Анализ уровня глюкозы крови показал значимое ее увеличение у самца №3 к 42 сутки эксперимента: до эксперимента - 5,3 ммоль/л, 42 сутки - 9,6 ммоль/л. Уровень NTproBNP в сыворотке крови составил 15,47 пг/мл до эксперимента, 90,88 пг/мл - на 42 сутки. При проведении трансторакальной ЭХО-КГ выявлены значимая гипертрофия миокарда, снижение ФВ ЛЖ с 70,4% до 54,1%.

При световой микроскопии миокарда ЛЖ обнаружена фенотипическая неоднородность КМЦ (гипертрофированные и атрофически измененные миоциты с преимущественно периферическим расположением ядер); выраженная структурная перестройка и разрушение комплексов сердечных миоцитов, разволокнение, отек и фиброз стромальных компонентов миокарда; участки венозного и капиллярного полнокровия. Морфометрическое исследование миокарда ЛЖ выявило снижение ОП КМЦ (77,70±5,54/49,83±4,64 контроль/диабетический фенотип ХСН соответственно, р=0,00000); увеличением ОП соединительно-тканной стромы (15,60±3,35/47,56±5,47, р=0,000000); снижением ОП капилляров (10,31±4,73/3,92±1,32, р=0,0051) в сравнении с самцами контрольной группы. ИГХ анализ установил активацию апоптоза КМЦ (экспрессия caspase-3) в сравнении группой контроля (р=0,0000001) (табл. 4). Пример применения №2.

По предложенному способу создания трансляционной модели диабетического фенотипа хронической сердечной недостаточности, у крысы-самки №12 после введения стрептозотоцина (на 28-е сутки эксперимента) появились изменения в пищевом поведении (возросла потребность в воде, увеличение количества и кратности приемов пищи), но в меньшей степени выраженности, чем у самцов той же группы; снижение подвижности и активности по мере увеличения массы тела. На 41 сутки эксперимента после введения мезатона и плавания появились выраженные признаки сердечной недостаточности одышка, акроцианоз. К 42 суткам высокожировой диеты прирост массы тела самки составил 213,9% (с 205,0 г до 438,5 г). Масса сердца (918,7 г) и ТЗС ЛЖ (1,3 мм), определяемые после окончания эксперимента, оказались достоверно выше в сравнении с интактными самками (табл. 1).

Анализ уровня глюкозы крови показал увеличение ее уровня у самки №12 к 42 суткам эксперимента: до эксперимента - 5,1 ммоль/л, на 42-е сутки - 10,4 ммоль/л. Уровень NTproBNP составил 9,68 пг/мл до эксперимента, 70,33 пг/мл-на 42 сутки. При проведении трансторакальной ЭХО-КГ выявлено умеренное снижение ФВ ЛЖ с 66,0% до 52,1%.

При световой микроскопии миокарда ЛЖ выявлены значимые изменения всех компонентов: КМЦ, стромы и сосудов микроциркуляторного русла. Обнаружены преимущественно гипертрофированные КМЦ, с вакуолизацией цитоплазмы; деструктуризация комплексов сердечных миоцитов, разволокнение, отек и фиброз стромальных компонентов; участки венозного и капиллярного полнокровия, а также увеличение толщины стенки капилляров, наличие сладжированных эритроцитов в их просвете.

Морфометрический анализ миокарда показал снижение ОП сердечных миоцитов (72,60±4,68/52,29±5,54 контроль/диабетический фенотип ХСН соответственно, р=0,00000); увеличение ОП соединительно-тканной стромы (17,95±4,93/52,29±5,54, р=0,000000); снижение ОП капилляров (10,39±3,3 9/3,38±1,43, р=0,000071) в сравнении с интактными самками. ИГХ-исследование выявило значимое увеличение проапоптотической доминанты в сравнении группой контроля (р=0,0000001) (табл. 4).

Приведенные выше факты подтверждают моделирование диабетического фенотипа экспериментальной сердечной недостаточности.

Использованная литература:

1. Автандилов Г.Г. Проблемы патогенеза и патологоанатомической диагностики болезней в аспектах морфометрии // М.: Медицина. - 1984. - 285 с.

2. Багрий А.Э., Супрун Е.В., Михайличенко Е.С, Голодников И.А. Хроническая сердечная недостаточность и сахарный диабет 2 типа: состояние проблемы. - Российский кардиологический журнал. - 2020. - №4. - С. 79-85.

3. Байрашева В.К., Бабенко А.Ю., Дмитриев Ю.В., Байрамов А.А., Чефу С.Г., Шаталов И.С., Гринева Е.Н. Новая модель сахарного диабета 2-го типа и диабетической нефропатии у крыс // Трансляционная медицина. - 2016. - №3(4). - С. 44-55.

4. Инчина В.И., Столярова В.В., Гарькин ГюГ., Тюряхина Н.А. Состояние миокарда в модельной ситуации активации гипертензивных механизмов // Тезисы докладов 2-го Российского конгресса по патофизиологии. М., 2000. - 68 с.

5. Казаченко А.А., Оковитый С.В., Куликов А.Н., Густайнис К.Р., Нагорный М.Б., Шулеин С.Н., Ерохина И.Л., Емельянова О.И. Сравнительная характеристика некоторых фармакологических моделей хронической сердечной недостаточности // Экспериментальная и клиническая фармакология. - 2008. - №6. - С. 16-19.

6. Крыжановский С.А., Цорин И.С., Ионова Е.О., Столярук В.Н., Вититнова М.Б., Барчуков В.В., Мирошкина И.А., Сорокина А.В., Кожевникова Л.М., Дурнев А.Д., Середенин СБ.; Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова» / Патент 2018126602 Российская Федерация. МПК А61В 5/02; G09B 23/28. Трансляционная модель хронической сердечной недостаточности: способ и критерии оценки формирования. - №2018126602; заявл. 19.07.2018; опубл. 15.03.2021 //Бюл. - №8.

7. Липатов В.А., Моралев Л.Н., Алехин С.А., Емельянов РА. Способ наложения аорто-кавального шунта экспериментальным животным // Эндотелиальная дисфункция и сердечно-сосудистая патология: материалы III межвузовской конференции. - Курск.: КГМУ, 2007. - С. 12-14.

8. Лискова Ю.В., Саликова С.П., Стадников А.А. Экспериментальные модели сердечной недостаточности: состояние вопроса и результаты собственного исследования // Морфологические ведомости. - 2014. - Т. 22. - №. 1. - С. 46-53.

9. Можейко Л.А. Экспериментальные модели для изучения сахарного диабета часть II. Хирургический, стрептозотоциновый и дитизоновый диабет // Журнал Гродненского государственного медицинского университета. - 2013. - №4 (44). - С. 5-10.

10. Оганов Р.Г., Денисов Е.Н., Симаненков В.И., Бакулин И.Г., Бакунина Н.В., Болдуева С.А., Шальнова С.А. Клинические рекомендации. Коморбидная патология в клинической практике. Кардиоваскулярная терапия и профилактика. - 2017. - №16(6). - С. 5-56.

11. Осипова В.В., Овсяников В.В., Скандакова М.Н., Семин Н.А. Методы моделирования «приобретенного» сахарного диабета. In СТУДЕНТ ГОДА. - 2019. - С. 123-126

12. Самотруева М.А., Сергалиева М.У. Сахарный диабет: особенности экспериментального моделирования. Астраханский медицинский журнал. - 2019. - №14(3). - С. 45-57.

13. Сидоров А.В. Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Ярославская государственная медицинская академия" Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации / Патент 2012126189/14 Российская Федерация. МПК G09B 23/28. Способ создания динамической модели хронической сердечной недостаточности. - №2012126189/14; заявл. 22.06.2012; опубл. 27.12.2013 // Бюл. - №36.

14. Скалецкая Г.Н., Скалецкий Н.Н., Волкова Е.А., Севастьянов В.И. Стрептозотоциновая модель стабильного сахарного диабета // Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2018. - Т. 20, №4. - С .83-88.

15. Стакан И.Н., Козлов О.И., Курганович С.А. и др. Экспериментальная аневризма левого желудочка как модель заболевания сердца с сердечной недостаточностью // Медицинский журнал. - Минск. - 2005. - №3

16. Терещенко С.Н., Галявич А.С, Ускач Т.М., Агеев Ф.Т., Арутюнов Г.П., Беграмбекова Ю.Л. И соавт. Хроническая сердечная недостаточность. Клинические рекомендации 2020 // Российский кардиологический журнал. - 2020. - №11. - С. 311-374.

17. Чуканова Г.Н., Дворацка М., Искакова С.С, Курмамбаев Е.Ж. Моделирование сахарного диабета 2 типа для изучения лекарственных средств с антидиабетической активностью // Наука и здравоохранение. - 2014. - №4. - С. 4-8.

18. Agbulut О., Menot M.L., Li Z., Marotte F., Paulin D., Hagege A.A., Chomienne C, Samuel J.L., Menasche P. Temporal patterns of bone marrow cell differentiation following transplantation in doxorubicin-induced cardiomyopathy // Cardiovasc Res. - 2003. №58. - C. 451-459.

19. Alex L., Russo I., Holoborodko V., Frangogiannis N.G. Characterization of a mouse model of obesity-related fibrotic cardiomyopathy that recapitulates features of human heart failure with preserved ejection fraction // Am J Physiol Heart Circ Physiol. - 2018. - №315. - C. 934-949.

20. Anamalley R., Rajassageran L., Apparoo Y. A. S., Jauri M. H., Kamisah Y., Yunos N. M., Zainalabidin S. Repeated administration of low dose isoprenaline on the rat's cardiovascular system // Sains Malays. - 2022. - №51. - C. 2147-2157.

21. Bobkiewicz-Kozlowska Т., Dworacka M., Kuczynski S. et al. Hypoglycaemic effect of quinolizidine alkaloids - lupanine and 2-thionosparteine on non-diabetic and streptozotocin-induced diabetic rats // European Journal of Pharmacology -2007. - 565. - C. 240-244.

22. Chatzigeorgiou A., Halapas A., Kalafatakis K., Kamper E. The use of animal models in the study of diabetes mellitus // In Vivo. - 2009. - 23(2). - C. 245-258

23. Choy M., Liang W., He J., Fu M., Dong, Y, He X., Liu C. Phenotypes of heart failure with preserved ejection fraction and effect of spironolactone treatment // ESC Heart Failure. - 2022. - №9(4). - C. 2567-2575.

24. Cle 'ment K. Genetics of human obesity // С R Biol. - 2006. - №329. - C. 608-622.

25. de Lange W.J., Grimes A.C., Hegge L.F., Ralphe J.C. Ablation of cardiac myosin-binding protein С accelerates contractile kinetics in engineered cardiac tissue // J Gen Physiol. - 2013. - №141. - C. 73-84.

26. Fayssoil A., Renault G., Guerchet N., Marchiol-Fournigault C, Fougerousse F., Richard I. Cardiac characterization of mdx mice using high-resolution doppler echocardiography // J Ultrasound Med. - 2013. - №32. - C. 757-761.

27. Grisel P., Meinhardt A., Lehr H.A., Kappenberger L., Barrandon Y., Vassalli G. The MRL mouse repairs both cryogenic and ischemic myocardial infarcts with scar // Cardiovasc Pathol. - 2008. - №17. - C. 14-22.

28. Gs A.K., Raj В., Santhosh K.S., Sanjay G., Kartha C.C. Ascending aortic constriction in rats for creation of pressure overload cardiac hypertrophy model. // J Vis Exp. - 2014. - e50983.

29. Hajar R. Risk factors for coronary artery disease: historical perspectives // Heart views: the official journal of the Gulf Heart Association. - 2017. - №18(3). - C. 109.

30. Islam M.S., Choi H. Nongenetic model of type 2 diabetes: a comparative study // Pharmacology. - 2007. - №79(4). - C. 243-249.

31. Karuppagounder V, Arumugam S., Babu S.S., Palaniyandi S.S., Watanabe K., Cooke J.P., Thandavarayan R.A. The senescence accelerated mouse prone 8 (SAMP8): a novel murine model for cardiac aging //Ageing Res Rev. - 2017. - №35. - C. 291-296.

32. Kumar G.L. Иммуногистохимические методы: Руководство // Rudbeck.:DAKO / Пер. с англ. под ред. Г.А. Франка и П.Г. Малькова. - М., 2011. - 224 с.

33. Leiter Е.Н., Prochazka М., Shultz L.D. Effect of immunodeficiency on diabetogenesis in getenocally diabetic (db/db) mice // J. Immunol. -1987. - 138. - C. 3224-3229.

34. Ohkuma T, Komorita Y, Peters S. A., Woodward M. Diabetes as a risk factor for heart failure in women and men: a systematic review and meta-analysis of 47 cohorts including 12 million individuals // Diabetologia. - 2019. - №62. - C. 1550-1560.

35. Packer M. Heart Failure: The Most Important, Preventable, and Treatable Cardiovascular Complication of Type 2 Diabetes // Diabetes Care. - 2018. - T. 41. - №1. - C. 11-13.

36. Packer M., Lam C.S., Lund L.H., Maurer M.S., Borlaug, B.A. Characterization of the inflammatory-metabolic phenotype of heart failure with a preserved ejection fraction: a hypothesis to explain influence of sex on the evolution and potential treatment of the disease. European Journal of Heart Failure. - 2020. - №22(9). - C. 1551-1567.

37. Patel R., Shah P., Deshpande S., Shah, G., Gohil, P. Fructose diet and low dose streptozotocin treatment induces the development of diabetic nephropathy in rats // Oriental Pharmacy and Experimental Medicine. 2015. - №15. - C. 305-312.

38. Risbud M.V., Bhonde R.R. Models of pancreatic re-generation in diabetes // Diabetes Res Clin Pract. - 2002. - 58. - C. 155-165.

39. Shafrir E. Diabetes in animals: contribution to the understanding of diabetes by study of its etiopathology in animal models. Diabetes Mellitus Textbook. - 2003. - C. 231-255.

40. Sharif A., Hecking M. de Vries APJ. et al. Proceedings from an international consensus meeting on posttransplantation diabetes mellitus: recommendations and future directions // Am J Transplant. - 2014. - №14. - 1992 - 2000.

41. Shen Y., Cheng F., Sharma M., Merkulova Y, Raithatha S.A., Parkinson L.G., Zhao H., Westendorf K., Bohunek L., Bozin Т., Hsu I., Ang L.S., Williams S.J., Bleackley R.C., Eriksson J.E., Seidman M.A., McManus B.M., Granville D.J. Granzyme В deficiency protects against angiotensin П-induced cardiac fibrosis // Am J Pathol. - 2016. №186. - C. 87-100.

42. Srinivasan K., Ramarao P. Animal models in type 2 diabetes research: An overview // Indian J Med Res. 2007-125(3). - P. 451-472.

43. Unsold В., Schotola H., Jacobshagen С, Seidler Т., Sossalla S., Emons J., Klede S., Knoll R., Guan K., El-Armouche A., Linke W.A., Kogler H., Hasenfuss G. Age-dependent changes in contractile function and passive elastic properties of myocardium from mice lacking muscle LIM protein (MLP) // Eur J Heart Fail. - 2012. - №14. - P. 430-437.

44. Zhang M., Lv X.Y., Li J., Xu Z.G., Chen L. The characterization of high-fat diet and multiple low-dose streptozotocin induced type 2 diabetes rat model // Exp.Diabetes Res. - 2009. - №2008. - P. 9

Изобретение относится к медицине, а именно к экспериментальной кардиологии, и может быть использовано для изучения патогенетических механизмов развития, прогрессирования диабетического фенотипа хронической сердечной недостаточности. Двенадцатимесячных крыс-самцов и крыс-самок содержат на высококалорийной диете, которая включает в себя основной корм и дополнительно по 50 г/кг свиного сала и по 10 г/кг сливочного масла в течение 42 суток. Во время диеты однократно внутривенно вводят 2,5% раствора никотинамида в дозе 250 мг/кг. На 21-е сутки эксперимента вводят стрептозотоцин в дозе 40 мг/кг. С 28 по 42 сутки эксперимента начинают ежедневное введение 1% раствора мезатона в дозе 0,5 мл/кг внутримышечно на фоне физической нагрузки в течение 15 минут. Способ позволяет на доклиническом этапе изучать новые сигнальные пути и молекулярные мишени патогенеза хронической сердечной недостаточности, ассоциированной с сахарным диабетом 2 типа, и апробировать новые средства и способы ее профилактики и лечения. 4 ил., 4 табл., 2 пр.

Способ создания трансляционной модели диабетического фенотипа хронической сердечной недостаточности, который включает содержание 12-месячных крыс-самцов и крыс-самок линии Вистар на высококалорийной диете: основной корм и дополнительно по 50 г/кг веса животного свиного сала и по 10 г/кг веса животного сливочного масла ежедневно - в течение 42 суток, введение внутривенно однократно 2,5% раствора никотинамида в дозе 250 мг/кг и стрептозотоцина в дозе 40 мг/кг на 21-е сутки высококалорийной диеты, а также ежедневное внутримышечное введение с 7-го дня от инъекции стрептозотоцина 1% раствора мезатона в дозе 0,5 мл/кг на фоне физической нагрузки плаванием в течение 15 минут в течение 14-ти суток.