СПОСОБ, КОМПОЗИЦИЯ И НАБОР ДЛЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПЦР И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/686 

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к области молекулярно-биологической детекции, и в частности, к области флуоресцентной количественной ПЦР-детекции.

Предшествующий уровень техники

Технология полимеразной цепной реакции нуклеиновых кислот (ПЦР) представляет собой технологию молекулярной биологии, используемую для амплификации определенных фрагментов нуклеиновых кислот (ДНК/РНК), так что количество фрагментов гена увеличивается в десятки тысяч раз. Ее основной принцип заключается в том, что праймер с флуоресцентным зондом связывается и гибридизуется с комплементарной последовательностью в одноцепочечной ДНК-матрице с образованием частичной двойной цепи, а синтез ДНК осуществляется под действием ДНК-полимеразы. Связывание праймера c флуоресцентным зондом с одноцепочечной ДНК-матрицей основано на принципе спаривания оснований: спаривание оснований следует принципу спаривания оснований Уотсона-Крика G (гуанин): C (цитозин), A (аденин): T (тимин)/U (урацил). ПЦР широко используется в медицинской диагностике, научных исследованиях, биоинженерии, сельском хозяйстве и других дисциплинах. Количественная ПЦР в реальном времени (кПЦР) — это метод измерения общего количества продуктов после каждого цикла ПЦР с использованием флуоресцентных химических веществ в реакциях амплификации нуклеиновых кислот. Это также метод количественного анализа определенной последовательности ДНК в образце, подлежащем тестированию, с помощью внутреннего или внешнего эталонного метода. Для количественной ПЦР детекцию в реальном времени выполняют в процессе ПЦР посредством флуоресцентных сигналов во время процесса ПЦР амплификации. Поскольку существует линейная зависимость между значением Ct матрицы и исходным числом копий матрицы в экспоненциальном периоде ПЦР-амплификации, оно становится основой для количественного определения. Флуоресцентные индикаторы для кПЦР детекции в основном делятся на две категории: одна - это флуоресцентные зонды, такие как зонды Taqman и зонды молекулярных маяков; а вторая - это флуоресцентные красители, которые могут связываться с двухцепочечной ДНК, такие как SYBR Green и Eva Green.

Еще в 1970-х годах ученый Korana выдвинул идею амплификации нуклеиновых кислот in vitro. В 1983 году американский ученый Kery Mullis вдохновился идеей амплификации нуклеиновых кислот in vitro, когда он изучал методы секвенирования нуклеиновых кислот: использование пробирок для имитации естественного процесса репликации ДНК in vivo. При обеспечении ряда подходящих условий, включая ДНК-матрицу, праймеры с флуоресцентным зондом, ДНК-полимеразу, подходящую буферную систему, температуру и время для денатурации, восстановления и удлинения ДНК, молекула ДНК с известными последовательностями на обоих концах может быть амплифицирована в геометрической прогрессии. Такая технология амплификации ДНК in vitro претерпела ряд последующих оптимизаций и улучшений и была успешно применена в первом в мире патенте на изобретение по ПЦР, патенте США 4683202, в 1987 году.

С тех пор, с использованием и продвижением технологии ПЦР в клинических и научных исследованиях, последующие патенты продолжали обогащать и оптимизировать детали технологии ПЦР. В 1992 году Higuchi et al. впервые предложили использовать метод динамической ПЦР и метод закрытого сбора флуоресценции для детекции и анализа количества генов-мишеней, то есть технологию количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени. Флуоресцентный количественный ПЦР-анализ в реальном времени можно использовать для количественного анализа путем определения количества амплифицированных продуктов (интенсивности флуоресценции меченого продукта), которое напрямую связано с количеством исходного гена-мишени. Значение номера цикла Ct (порогового цикла), при котором повышенный сигнал флуоресценции амплифицированного продукта достигает логарифмической фазы, имеет отрицательную линейную зависимость от логарифма исходного числа копий матрицы, то есть количество циклов амплификации, необходимое для удвоения начального разведения матрицы для достижения той же логарифмической фазы интенсивности флуоресценции увеличивается на один цикл (Ct). Повышенный сигнал амплифицированного продукта можно отображать с помощью флуоресцентного красителя ДНК продукта, такого как Sybr Green I, или выявлять с помощью флуоресцентного зонда с гасящей группой, такого как зонд Taqman. Зонды с группами гашения флуоресценции включают флуоресцентно-меченые зонды, гидролизованные ферментом Taq в технологии кПЦР, и зонды MGB, повышающие эффективность связывания на основе гидролизованных флуоресцентных зондов. Разнообразные типы зондов последовательной гибридизации, такие как гибридизационные зонды со структурой стебель-петля, зонды с двумя гибридизациями (FRET) и другие новые зонды, имеют сходные применения, но все они имеют большие ограничения в области применения, и чувствительность этих зондов все еще необходимо повысить.

Кроме того, при использовании клинических тестов часто возникают ложноотрицательные результаты из-за низкой чувствительности метода детекции. В частности, ген ORF1ab SARS-CoV-2 легко пропустить из-за низкой чувствительности метода детекции вследствие низкого уровня его экспрессии.

Поэтому в данной области техники существует потребность в способе и продукте, которые позволяют улучшить чувствительность ПЦР и уменьшить количество ложноотрицательных результатов.

Изложение сущности изобретения

Ввиду вышеизложенного, в первом аспекте настоящее изобретение предлагает способ флуоресцентной количественной ПЦР, включающий:

1) смешивание пары из прямого и обратного праймеров, флуоресцентного зонда и реагента для ПЦР амплификации; и

2) проведение флуоресцентной количественной ПЦР,

где флуоресцентный зонд имеет две гасящие группы, в которых первая гасящая группа расположена на 3'-конце, а вторая гасящая группа присоединена на основании Т и отстоит от первой гасящей группы на 10-15 нуклеотидов.

С помощью метода флуоресцентной количественной ПЦР по настоящему изобретению фоновые сигналы в флуоресцентной количественной ПЦР могут быть уменьшены, и, кроме того, может быть улучшена чувствительность ПЦР, может быть уменьшено количество ложноотрицательных результатов при детекции, а также может быть улучшена эффективность амплификации флуоресцентной количественной ПЦР.

Без ограничения какой-либо теорией, отметим, что одна гасящая группа не полностью гасит флуоресценцию флуорофора, что приводит к более высокому фоновому сигналу. Использование флуоресцентного зонда по настоящему изобретению, имеющего две гасящих группы, как определено выше, дополнительно успешно снижает фоновые сигналы, не влияя на ход реакции, тем самым повышая чувствительность ПЦР и увеличивая эффективность ПЦР амплификации.

В предпочтительных вариантах осуществления способ дополнительно включает смешивание дополнительной добавки, а дополнительная добавка представляет собой любой один или несколько из формамида, додецилсульфата натрия и антибиотика Проклина.

Дополнительная добавка по настоящему изобретению может дополнительно взаимодействовать с флуоресцентным зондом, имеющим две гасящих группы, так что чувствительность дополнительно улучшается, а результат детекции становится более точным.

В некоторых конкретных вариантах осуществления дополнительная добавка, используемая в настоящем изобретении, имеет значение рН от 7,0 до 8,8, и более предпочтительно реагент для ПЦР амплификации, используемый в настоящем изобретении, имеет значение рН 7,5.

В конкретном варианте осуществления дополнительная добавка представляет собой формамид, ДСН и Проклин 300, которые имеют конечную концентрацию от 0,01% до 0,05% (об./об.) после добавления к реакционному раствору ПЦР.

Кроме того, флуоресцентный зонд имеет длину 18-35 п.н. и более предпочтительно флуоресцентный зонд имеет длину 22-28 п.н.

Кроме того, флуоресцентный зонд имеет значение Tm 55-70°С, и более предпочтительно флуоресцентный зонд имеет значение Tm 65-70°С.

Кроме того, второй флуоресцентный зонд имеет содержание GC, не превышающее 60%.

Гасящие группы могут быть выбраны из BHQ1, BHQ2 и MGB, но не ограничиваются ими.

В конкретном варианте осуществления первая гасящая группа и вторая гасящая группа представляют собой одну и ту же гасящую группу. Как первую, так и вторую гасящую группы можно пометить с использованием способов, хорошо известных специалистам в данной области техники.

Флуоресцентный зонд также имеет флуоресцентную группу, и флуоресцентная группа может быть выбрана из FAM, HEX, ROX, VIC, CY5, 5-TAMRA, TET, CY3 и JOE, но не ограничивается ими.

«Количественная флуоресцентная ПЦР», упомянутая в настоящем изобретении, представляет собой способ измерения общего количества продуктов после каждого цикла полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием флуоресцентных химических веществ в реакциях амплификации нуклеиновых кислот. Это также метод количественного анализа конкретной последовательности нуклеиновой кислоты в подлежащем тестированию образце с помощью внутреннего или внешнего эталонного метода.

«Реагент для ПЦР амплификации», упомянутый в настоящем изобретении, относится к реагенту, используемому для детекции флуоресцентной количественной амплификации нуклеиновых кислот в реальном времени. Специалистам в данной области техники понятно, что реагент для амплификации кПЦР обычно содержит ДНК-полимеразу, дНТФ (дезоксинуклеозидтрифосфат), буфер для ПЦР, и т.д. Например, когда объектом детекции является РНК, реагент может дополнительно включать обратную транскриптазу. Нетрудно понять, что специалисты в данной области техники могут определить состав и концентрацию реагента для ПЦР амплификации в соответствии с конкретными потребностями (такими как тип и содержание образцов).

Во втором аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ одноэтапной количественной флуоресцентной ПЦР, включающий:

1) смешивание высвобождающего образец агента, пары из прямого и обратного праймеров, флуоресцентного зонда, реагента для ПЦР амплификации, и образца; и

2) проведение флуоресцентной количественной ПЦР,

где флуоресцентный зонд имеет две гасящие группы, в которых первая гасящая группа расположена на 3'-конце, а вторая гасящая группа присоединена на основании Т и отстоит от первой гасящей группы на 10-15 нуклеотидов; и

способ не включает этапов очистки и/или экстракции нуклеиновой кислоты.

«Высвобождающий образец агент», упомянутый в настоящем изобретении, относится к химическому реагенту, который может высвобождать нуклеиновую кислоту в образце и может использоваться для ПЦР без необходимости очистки и/или экстракции нуклеиновой кислоты, такой как сильнокислотный или основной химический реагент. Пример высвобождающего образец агента может включать один или несколько из 0,01-0,5 ммоль/л сурфактина, 100-200 ммоль/л калия хлорида, 50-200 ммоль/л лития хлорида, триэтаноламина лаурилсульфата, имеющего отношение массы к объему от 0,1% до 1%, Nonidet P-40 (NP-40) с объемным отношением от 0,1% до 1%, натрия додецилсульфоната с отношением массы к объему от 0,01% до 2%, этанола с объемным отношением 0,05-1%, и другие компоненты. Однако настоящее изобретение не ограничивается этим.

«Одноэтапный способ», упомянутый в настоящем изобретении, относится к технологии высвобождения и амплификации нуклеиновых кислот без экстракции (EFNART). Технология относится к прямой детекции амплификации нуклеиновой кислоты в образце непосредственно с помощью высвобождающего нуклеиновую кислоту агента с сильными щелочными свойствами и высоко совместимой системы амплификации без необходимости экстракции нуклеиновой кислоты или очистки образца.

Использование способа по настоящему изобретению позволяет улучшить чувствительность «одноэтапного метода», устранить недостатки низкой чувствительности и неточных результатов детекции «одноэтапного метода» и избежать возникновения ложноотрицательных результатов. Кроме того, использование одноэтапного метода также экономит время, завершает детекцию нуклеиновой кислоты за очень короткое время и повышает эффективность детекции (например, предоставление пациентам точных результатов диагностики и планов лечения как можно раньше, а также играет ключевую роль в предотвращении распространения основных инфекционных заболеваний).

«Образец», упомянутый в настоящем изобретении, относится к веществу, содержащему подлежащую тестированию нуклеиновую кислоту. Образец может включать, помимо прочего, животные и растительные клетки, бактерии, вирусы, грибы и т.д., а также жидкости организма, ткани, органы и т.д., содержащие их.

В частности, образцы, упомянутые в настоящем изобретении, представляют собой слизь, мокроту, гной и мочу и т.д., и поскольку такие образцы необходимо сохранять в консервирующем растворе, содержащем некоторые мешающие вещества, такие как антибиотики и поверхностно-активные вещества, чувствительность обычно низкая, когда используется метод детекции без экстракции нуклеиновых кислот.

В третьем аспекте настоящее изобретение обеспечивает композицию для флуоресцентной количественной ПЦР, включающую пару из прямого и обратного праймеров, флуоресцентный зонд и реагент для ПЦР-амплификации;

при этом флуоресцентный зонд имеет две гасящие группы, в которых первая гасящая группа расположена на 3'-конце, а вторая гасящая группа присоединена на основании Т и отстоит от первой гасящей группы на 10-15 нуклеотидов.

Кроме того, композиция также включает дополнительную добавку, и дополнительная добавка представляет собой любой один или несколько из формамида, додецилсульфата натрия и антибиотиков Проклина.

В некоторых конкретных вариантах осуществления дополнительная добавка, используемая в композиции, имеет значение рН от 7,5 до 8,8, и более предпочтительно реагент для ПЦР амплификации, используемый в настоящем изобретении, имеет значение рН 8,5.

В конкретном варианте осуществления дополнительная добавка представляет собой ДСН и Проклин 300, которые имеют конечную концентрацию от 0,01% до 0,05% (об./об.) после добавления к реакционному раствору ПЦР.

Кроме того, флуоресцентный зонд имеет длину 18-35 п.н., и более предпочтительно флуоресцентный зонд имеет длину 22-28 п.н.

Кроме того, флуоресцентный зонд имеет значение Tm 55-70°С и, более предпочтительно, флуоресцентный зонд имеет значение Tm 55-70°С.

Кроме того, флуоресцентный зонд имеет содержание GC не более 60%.

Гасящие группы могут быть выбраны из BHQ1, BHQ2 и MGB, но не ограничиваются ими.

В конкретном варианте осуществления первая гасящая группа и вторая гасящая группа представляют собой одну и ту же гасящую группу.

Флуоресцентный зонд также имеет флуоресцентную группу, и флуоресцентная группа может быть выбрана из FAM, HEX, ROX, VIC, CY5, 5-TAMRA, TET, CY3 и JOE, но не ограничивается ими.

В четвертом аспекте настоящее изобретение обеспечивает применение вышеупомянутой композиции для приготовления набора для флуоресцентной количественной ПЦР.

Кроме того, настоящее изобретение обеспечивает использование вышеупомянутой композиции для приготовления набора для одноэтапной количественной флуоресцентной ПЦР.

В пятом аспекте настоящее изобретение обеспечивает набор для флуоресцентной количественной ПЦР, включающий указанную выше композицию.

Краткое описание чертежей

Фигуры 1-6 показывают результаты детекции SARS-CoV-2 композицией по настоящему изобретению и композицией из сравнительных примеров.

Подробное описание изобретения

Далее настоящее изобретение подробно описано со ссылкой на конкретные варианты осуществления и примеры, и из них можно более ясно представить преимущества и различные эффекты настоящего изобретения. Специалистам в данной области техники должно быть понятно, что эти конкретные варианты осуществления и примеры предназначены для иллюстрации настоящего изобретения, а не для его ограничения.

Пример 1. Флуоресцентный зонд, имеющий две гасящих группы по настоящему изобретению, улучшает чувствительность ПЦР.

Чтобы оценить применение способа конструирования зонда с двойным гашением в настоящем изобретении, исследовали его влияние на ПЦР. Метод двойного гашения с зондом по настоящему изобретению сравнивали с зондом, имеющим одну гасящую группу в реагенте для ПЦР амплификации. Исходя из того, что последовательности праймеров и компоненты амплификации не изменялись, была исследована детекция нуклеиновых кислот в слабоположительных образцах с использованием различных конструкций зондов в одной и той же системе ПЦР амплификации. Метод сравнения заключался в использовании клинически диагностированного положительного образца с низкой концентрацией респираторно-синцитиального вируса (RSV) для детекции, и один и тот же образец был подвергнут анализу 10 раз для проверки эффективности положительной детекции образца. Конкретные компоненты каждой группы показаны в Таблице 1.

Таблица 1. Специфические компоненты различных схем конструкции зонда

Схема амплификации 1 из настоящего изобретения Схема амплификации 2 из настоящего изобретения Контрольная схема амплификации Последовательность прямого праймера GCAAATATGGAAACATACGTGAACA Последовательность обратного праймера RGATGAYTGGAACATRGGCACC Последовательность зонда Taqman 5'-FAM-CAGCWGCTGTGTAT(T-
BHQ1)GTGGAGCCYTCG
TGA-3'-BHQ1 5'-FAM-CAGCWGCTGTGT
ATGT(T-
BHQ1)GGAGCCY
TCGTGA-3'-
BHQ1 5'-FAM-CAGCWGCTGTGTA
TGTGGAGCCYTCG
TGA-3'-BHQ1 Доза прямого праймера 10 пмоль Доза обратного праймера 10 пмоль Доза зонда 5 пмоль Mg2+ 2 пмоль дНТФ 2 пмоль Смесь ферментов 4 мкл ПЦР буфер 24,65 мкл Доза образца 20 мкл Общий объем реакции 50 мкл

В упомянутых выше сравнительных экспериментах исследовали конструкцию зонда с двойным гашением, особенно сравнивали конструкции в различных положениях основания и зонда, имеющего одну гасящую группу. Результаты испытаний показывают (Таблица 2), что конструкции зондов схемы амплификации 1 и схемы амплификации 2 по настоящему изобретению могут значительно повысить эффективность детекции образцов с низкой концентрацией RSV по сравнению с традиционной сравнительной схемой амплификации без двойного гашения. Однако при сравнении способов амплификации 1 и 2 по настоящему изобретению, несмотря на то, что вторая гасящая группа сконструирована на другой основе, почти нет разницы во влиянии на эффективность детекции амплификации, и нет существенной разницы в эффективности детекции из 10 образцов. Экспериментальные результаты этой группы показывают, что при размещении двух гасящих групп на одном и том же зонде размещение в разных положениях не имеют существенной разницы в эффективности детекции.

Таблица 2. Сравнительные результаты амплификации различных процедур амплификации для 10 образцов нуклеиновых кислот с низкой концентрацией

Схема амплификации 1 из настоящего изобретения 35,14 35,65 34,98 36,02 36,54 3579 35,15 36,74 36,54 35,27 Схема амплификации 2 из настоящего изобретения 35,15 35,31 35,69 36,46 36,93 35,82 35,25 36,47 36,75 35,46 Схема амплификации контроля 38,84 38,18 38,12 Нет Ct Нет Ct 37,89 37,95 38,86 Нет Ct 39,12

Пример 2. Флуоресцентный зонд, имеющий две гасящие группы и дополнительные добавки по настоящему изобретению, улучшает чувствительность ПЦР

Для оценки применения зонда двойного гашения и его компонентов реагента для ПЦР амплификации (0,02% формамида (об./об.), 0,03% ДСН (масс./об.) и 0,01% Проклина 300 (об./об.)) согласно настоящему изобретению тот же принцип конструкции зонда использовали для сравнения и модификации конструкции флуоресцентного зонда для респираторно-синцитиального вируса (RSV), и исходя из того, что последовательность оснований зонда оставалась неизменной, детекцию нуклеиновой кислоты в слабоположительных образцах в той же самой системе ПЦР амплификации выполняли с использованием схемы двойной группы гашения по настоящему изобретению и стандартной конструкции зонда (специфическая последовательность зонда для 5'-FAM-3'-BHQ1). Метод сравнения представлял собой пошаговое градиентное разведение клинически диагностированного положительного образца RSV: 10-кратное разведение (1:9, об./об.), 100-кратное разведение (1:99, об./об.), 1000-кратное разведение (1:999, об./об.) и 10000-кратное разведение (1:9999, об./об.). Метод детекции представлял собой метод детекции прямой амплификации образца без экстракции нуклеиновой кислоты. Принятый метод представлял собой прямую амплификацию образца в системе образец: агент для разделения образца: реакционный раствор для количественной ПЦР = 10:10:30 (об./об./об.) с общим объемом 50 мкл. Процедура амплификации показана в Таблице 3. Конкретные компоненты каждой группы показаны в Таблице 4.

Таблица 3. Процедура детекции амплификации нуклеиновой кислоты, принятая в настоящем изобретении.

Этап Температура Время Номер циклов Обратная транскрипция 50 °С 30 мин 1 Пре-денатурация 95 °С 1 мин 1 Денатурация 95 °С 15 сек 40-45 Отжиг, удлинение и сбор данных флуоресценции 60 °С 30 сек

Таблица 4. Специфические компоненты различных схем конструкции зонда

Результаты сравнения в Таблице 5 показывают, что для дополнительных компонентов в системе ПЦР амплификации по настоящему изобретению чувствительность амплификации образца RSV без экстракции значительно улучшается. Исходя из того, что последовательность праймера для зонда и основные компоненты системы ПЦР амплификации остаются неизменными, оптимизация схемы модификации гашения зонда значительно улучшает способность детекции нуклеиновых кислот.

Таблица 5. Схема сравнения чувствительности детекции, основанная на градиентном разбавлении образца.

Схема конструкции с зондом из настоящего изобретения Схема конструкции обычного флуоресцентного зонда Значение Ct детекции образца RSV Значение Ct детекции образца RSV 10-кратное разведение образца 29,64 31,89 100-кратное разведение образца 32,89 35,32 1,000-кратное разведение образца 36,07 38,03 10,000-кратное разведение образца 39,46 Нет Ct

Пример 3. Флуоресцентный зонд, имеющий две гасящие группы и дополнительные добавки по настоящему изобретению, улучшает чувствительность ПЦР

Чтобы оценить схему конструкции праймера-зонда и применение дополнительных компонентов (формамида, ДСН и Проклина 300) в настоящем изобретении, был проведен сравнительный анализ реакции с праймером-зондом и добавкой для ПЦР по настоящему изобретению и обычной 3'-концевой одиночной гасящей группой (BHQ1) без схемы праймера-зонда по настоящему изобретению. Метод сравнения заключался в использовании трех образцов нуклеиновых кислот SARS-CoV-2 (образец 01, образец 02 и образец 03), которые были клинически диагностированы как положительные, для проведения сравнительного теста в виде 45 мкл раствора реакции ПЦР + 5 мкл образца нуклеиновой кислоты. Процедура обнаружения флуоресцентной количественной ПЦР в реальном времени показана в Таблице 3. Конкретные компоненты каждой группы показаны в Таблице 6.

Таблица 6. Конкретные компоненты различных схем конструкции зонда

Из результатов сравнения амплификации на Фигурах 1-6 и в Таблице 7, исходя из той же дозы матрицы нуклеиновой кислоты и дозировки праймера и зонда, только из-за изменения режима мечения зонда и необходимых дополнительных компонентов, между ними значительно улучшается эффективность амплификации, особенно гена ORF 1ab на основе FAM канала. Таким образом, способ модификации зонда по настоящему изобретению имеет очевидные преимущества в улучшении чувствительности детекции реагентов на основе нуклеиновых кислот.

Таблица 7. Сравнение результатов эффектов амплификации схемы настоящего изобретения и контрольной схемы на трех образцах нуклеиновых кислот

Результаты сравнения в Таблице 7 показывают, что при модификации зонда и дополнительных компонентов в настоящем изобретении чувствительность ПЦР значительно повышается. Детектирующая способность набора отрицательно коррелирует со значением порогового цикла (Ct), то есть при одной и той же концентрации чем меньше значение Ct, тем выше детекционная способность; чем больше значение Ct, тем ниже детекционная способность; а «Нет Ct» означает отсутствие амплификации. Модификация зонда и добавки в настоящем изобретении позволяют значительно улучшить способность к детекции нуклеиновых кислот, но для разных образцов существуют различия между образцами в эффекте улучшения от ПЦР-добавок.

Пример 4. Флуоресцентный зонд, имеющий две гасящие группы, и дополнительные добавки по настоящему изобретению улучшают чувствительность одноэтапной ПЦР.

В процессе диспансеризации респираторные образцы являются высоко инфекционными, например, SARS-CoV-2, SARS, коронавирус MERS и др., а также распространенные вирусы гриппа А и В, все из которых являются высоко патогенными. Таким образом, завершение детекции вируса в очень короткие сроки позволяет предоставить пациентам результаты диагностики и планы лечения как можно раньше. Схема зонда с двойным гашением и соответствующих дополнительных компонентов ПЦР амплификации в настоящем изобретении также может быть использована в применении для быстрой детекции образцов. Основные особенности процедуры включают два основных аспекта: оба представляют собой прямую амплификацию образцов без обработки нуклеиновой кислоты и, соответственно: (1) учитывая отсутствие выделения и очистки нуклеиновой кислоты, прямую инактивацию собранных образцов с использованием агента для высвобождения образца с функцией инактивации, и высвобождение нуклеиновой кислоты в вирусе, а также использование соответствующих компонентов реагента для ПЦР амплификации для прямой детекции амплификации; и (2) применение процедуры обратной транскрипции и процедуры ПЦР амплификации за очень короткое время для завершения детекции вируса и получения результата детекции в течение 15-35 минут. Способ детекции представлял собой способ детекции прямой амплификации без экстракции нуклеиновой кислоты из образца. Принятый способ представлял собой прямую амплификацию образца в системе образец: агент для разделения образца: реакционный раствор для количественной ПЦР = 10:10:30 (об./об./об.) с общим объемом 50 мкл. Чтобы сравнить эффекты детекции при быстрой детекции и обычной детекции, в этой экспериментальной схеме были использованы условия реакции по настоящему изобретению при процедуре быстрой амплификации и обычной процедуре амплификации, а также схема конструкции обычного зонда при обычной процедуре амплификации для сравнения эффективности детекции образцов нуклеиновой кислоты с низкой концентрацией и отрицательных образцов SARS-CoV-2.

Таблица 8. Одноэтапная ПЦР и обычная ПЦР в схеме настоящего изобретения

Таблица 9. Результаты сравнения амплификации различных процедур амплификации для 10 образцов с низкой концентрацией нуклеиновой кислоты

Схема из настоящего изобретения, обычная амплификация 32,42 32,46 32,59 31,76 32,77 32,92 31,83 32,74 32,09 32,40 Схема из настоящего изобретения, быстрая амплификация 33,15 32,84 32,16 32,56 32,98 33,23 33,75 32,47 32,95 32,63 Контрольная схема, обычная амплификация 35,84 36,18 36,28 35,98 36,32 35,45 36,74 36,12 36,29 36,83 Контрольная схема, быстрая амплификация 38,84 39,18 Нет
Ct Нет
Ct Нет
Ct Нет
Ct 38,74 39,42 Нет Ct Нет Ct

Как видно из результатов детекции 10 образцов с низкой концентрацией, все образцы с низкой концентрацией были выявлены с использованием схемы из настоящего изобретения. Кроме того, результат детекции, полученный с использованием раствора для быстрой амплификации, не отличался от результата, полученного при использовании обычной процедуры амплификации. Таким образом, экспериментальные результаты доказывают, что схема детекции амплификации, основанная на конструкции зонда с двойным гашением, может использоваться как в обычной процедуре амплификации кПЦР, так и в быстрой процедуре амплификации кПЦР, и нет существенной разницы между двумя разными процедурами амплификации. Схему по настоящему изобретению можно использовать для быстрой детекции вирусов. В контрольной схеме были приняты традиционная конструкция зонда и состав реакции без двойной гасящей группы по настоящему изобретению, и в обычной процедуре амплификации были выявлены все 10 образцов, но значения Ct амплификации были уменьшены. Однако в процедуре быстрой амплификации только четыре из 10 образцов были обнаружены как положительные, поэтому способность к детекции была явно низкой. Следовательно, результаты сравнения показывают, что схему настоящего изобретения можно использовать для экспресс-диагностики нуклеиновых кислот РНК-вирусов.

Пример 5. Флуоресцентный зонд, имеющий две гасящие группы и дополнительные добавки по настоящему изобретению, улучшают чувствительность ПЦР

Чтобы оценить применение зонда двойного гашения и его реагирующих компонентов для ПЦР амплификации (формамида, ДСН и Проклина 300) в настоящем изобретении, тот же принцип конструкции зонда использовали для сравнения и модификации конструкции флуоресцентного зонда для респираторного аденовируса (ADV), и исходя из того, что последовательность оснований зонда осталась неизменной, определение нуклеиновой кислоты в слабоположительных образцах в одной и той же системе ПЦР амплификации проводили путем сравнения схем амплификации из схемы с двойной гасящей группой по настоящему изобретению и контрольной схемы.

Конструкции четырех схем (как показано в Таблице 11):

- схема из настоящего изобретения: реагент для амплификации, содержащий флуоресцентный зонд двойного гашения и дополнительные компоненты;

- контрольная схема 1: обычный реагент для амплификации, содержащий только флуоресцентный зонд с двойным гашением;

- контрольная схема 2: реагент для амплификации, содержащий флуоресцентный зонд с одинарным гашением и добавку;

- контрольная схема 3: обычный реагент для амплификации, содержащий только флуоресцентный зонд с одинарным гашением.

Способ сравнения представлял собой пошаговое градиентное разведение клинически диагностированного положительного образца ADV: 10-кратное разведение (1:9, об./об.), 100-кратное разведение (1:99, об./об.) и 1000-кратное разведение (1:999, об./об.). Метод детекции представлял собой метод детекции прямой амплификации без экстракции нуклеиновой кислоты для образца. Принятый метод представлял собой прямую амплификацию образца в схеме образец: агент для разделения образца: реакционный раствор для количественной ПЦР = 10:10:30 (об./об./об.) с общим объемом 50 мкл. Процедура амплификации показана в Таблице 10.

Таблица 10. Процедура детекции амплификации нуклеиновой кислоты, принятая в настоящем изобретении.

Таблица 11. Специфические компоненты различных схем конструкции зонда

Результаты сравнения в Таблице 12 показывают, что наблюдается значительное улучшение чувствительности амплификации образца ADV без экстракции, а эффективность амплификации по настоящему изобретению является наилучшей и явно превосходит схемы, основанные на обычной конструкции флуоресцентного зонда и обычных компонентах реагентов для ПЦР амплификации.

Кроме того, результаты сравнения в Таблице 12 также доказывают, что оптимизационный эффект добавок на две гасящие группы значительно лучше, чем на одну гасящую группу. В системе двойного гашения увеличение значения Ct добавкой больше 1 (при разнице на порядок, разница в 1 в значении Ct эквивалентна разнице в однократное количество матрицы), а в системе с одной гасящей группой увеличение значения Ct за счет добавки составляет менее 0,5 (фактически эквивалентно отсутствию увеличения).

Таблица 12. Сравнение чувствительности раствора для детекции на основе градиентного разбавления образца.

Изобретение относится к биотехнологии. Описан способ флуоресцентной количественной ПЦР. Смешивают пары из прямого и обратного праймеров, флуоресцентного зонда и реагента для ПЦР амплификации. Проводят флуоресцентную количественную ПЦР. При этом флуоресцентный зонд имеет две гасящие группы, где первая гасящая группа расположена на 3'-конце, а вторая гасящая группа присоединена на основании Т и находится на расстоянии 10-15 нуклеотидов от первой гасящей группы. В смесь вносят дополнительную добавку, и дополнительная добавка представляет собой любой один или несколько из формамида, ДСН и антибиотиков Проклина. Раскрыт способ одноэтапной флуоресцентной количественной ПЦР. Смешивают агент для высвобождения образца, дополнительную добавку, пары из прямого и обратного праймеров, флуоресцентного зонда, реагент для ПЦР амплификациии и образец. Проводят флуоресцентную количественную ПЦР. При этом флуоресцентный зонд имеет две гасящие группы, где первая гасящая группа расположена на 3'-конце, а вторая гасящая группа присоединена на основании Т и находится на расстоянии 10-15 нуклеотидов от первой гасящей группы. Способ не включает этапов очистки и/или экстракции нуклеиновой кислоты. Дополнительная добавка представляет собой любой один или несколько из формамида, ДСН и антибиотиков Проклина. Представлена композиция для флуоресцентной количественной ПЦР, содержащая пару из прямого и обратного праймеров, флуоресцентный зонд и реагент для ПЦР амплификации, где флуоресцентный зонд имеет две гасящие группы, где первая гасящая группа расположена на 3'-конце, а вторая гасящая группа присоединена на основании Т и находится на расстоянии 10-15 нуклеотидов от первой гасящей группы, где композиция содержит дополнительную добавку, представляющую собой любой один или несколько из формамида, ДСН и антибиотиков Проклина. Также представлен набор для флуоресцентной количественной ПЦР, содержащий указанную композицию. Изобретение позволяет улучшить чувствительность ПЦР и уменьшить количество ложноотрицательных результатов. 4 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 ил., 12 табл., 5 пр.

1. Способ флуоресцентной количественной ПЦР, включающий:

1) смешивание пары из прямого и обратного праймеров, флуоресцентного зонда и реагента для ПЦР амплификации; и

2) проведение флуоресцентной количественной ПЦР;

где флуоресцентный зонд имеет две гасящие группы, где первая гасящая группа расположена на 3'-конце, а вторая гасящая группа присоединена на основании Т и находится на расстоянии 10-15 нуклеотидов от первой гасящей группы, также в смесь на стадии (1) вносят дополнительную добавку, и дополнительная добавка представляет собой любой один или несколько из формамида, ДСН и антибиотиков Проклина.

2. Способ по п.1, где дополнительной добавкой является формамид, ДСН и Проклин 300, которые имеют конечную концентрацию от 0,01 до 0,05% (об./об.) после добавления к реакционному раствору ПЦР.

3. Способ одноэтапной флуоресцентной количественной ПЦР, включающий:

1) смешивание агента для высвобождения образца, дополнительной добавки, пары из прямого и обратного праймеров, флуоресцентного зонда, реагента для ПЦР амплификациии и образца; и

2) проведение флуоресцентной количественной ПЦР,

при этом флуоресцентный зонд имеет две гасящие группы, где первая гасящая группа расположена на 3'-конце, а вторая гасящая группа присоединена на основании Т и находится на расстоянии 10-15 нуклеотидов от первой гасящей группы; и

где способ не включает этапов очистки и/или экстракции нуклеиновой кислоты, и

где дополнительная добавка представляет собой любой один или несколько из формамида, ДСН и антибиотиков Проклина.

4. Композиция для флуоресцентной количественной ПЦР, содержащая пару из прямого и обратного праймеров, флуоресцентный зонд и реагент для ПЦР амплификации,

где флуоресцентный зонд имеет две гасящие группы, где первая гасящая группа расположена на 3'-конце, а вторая гасящая группа присоединена на основании Т и находится на расстоянии 10-15 нуклеотидов от первой гасящей группы, где композиция содержит дополнительную добавку, представляющую собой любой один или несколько из формамида, ДСН и антибиотиков Проклина.

5. Композиция по п.4, в которой дополнительной добавкой является формамид, ДСН и Проклин 300, которые имеют конечную концентрацию от 0,01 до 0,05% (об./об.) после добавления к реакционному раствору ПЦР.

6. Набор для флуоресцентной количественной ПЦР, содержащий композицию по любому из пп.4, 5.