Способ получения пористого коллагенового матрикса Российский патент 2023 года по МПК C07K14/78 C08K5/07 A61L27/24 A61L27/56 

МПК А 61К 38/39 Лекарственные препараты, содержащие пептиды - пептиды соединительной ткани, например коллаген, эластин, ламинин, фибронектин, витронектин, холодный нерастворимый глобулин (CIG),

35/56 Лекарственные препараты, содержащие вещества или продукты реакции неизвестного строения - материалы из прочих животных кроме млекопитающих или птиц

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к способам получения биомедицинских материалов, конкретно, к способам получения биодеградируемых матриксов, предназначенных для получения скаффолдов – биоматериалов, способных выступать субстратом и направляющей для регенерации поврежденных тканей, в том числе, за счет культивирования тканеспецифических клеток.

Описание уровня техники

Состав и структура матриксов для таких материалов имеет большое значение. Желательно, чтобы они обеспечивали свойства, максимально близкие к свойствам нативного межклеточного матрикса, т.е. были биосовместимыми, не имели токсических, иммуногенных и аллергогенных свойств, обладали пористой структурой, способствующей адгезии и пролиферации клеток. Из различных полимеров животного происхождения (гиалуроновая кислота, фиброин, фибрин и т.д.) наиболее широкое применение в медицине нашел коллаген, являющийся основным структурным белком соединительной ткани. Коллаген обладает кровоостанавливающими, слабыми антигенными свойствами, является биоразлагаемым и биосовместимым веществом и применяется в клинической практике для остановки кровотечений и стимуляции роста клеток. Коллагеновые материалы получают, как правило, двумя способами: а) из децеллюляризированных коллагенсодержащих тканей; б) из растворов коллагена. Для повышения механической прочности могут быть использованы композиты коллагена и синтетических полимеров [Parenteau-Bareil R., Gauvin R., Berthod F. Collagen-based biomaterials for tissue engineering applications //Materials. 2010; 3(3):1863-1887. doi:10.3390/ma3031863].

Способ получения пористого коллагенового матрикса был раскрыт во многих известных патентах. Например, в патенте US №4,193,813 измельченный коллаген при рН от 3,5 до рН 6,5 сшивают глутаровым альдегидом с последующим замораживанием при температуре от 0 до -20°C. После оттаивания вода из замороженного материала удаляется с образованием губчатой матрицы. Размер пор матрицы, образованной этим способом, составляет от 80 до 1400 мкм, что позволяет считать ее весьма неоднородной и рыхлой.

Патент US №4522753 относится к способу смешивания коллагена и хондроитинсульфата с образованием сополимерного материала. Затем материал сшивают глутаровым альдегидом и лиофилизируют с образованием пористой матрицы.

Патент US №4970298 описывает коллагеновую матрицу, полученную путем диспергирования коллагена в кислом растворе или путем смешивания дисперсии коллагена с гиалуроновой кислотой и фибронектином. Дисперсию замораживают при различных температурах, а затем лиофилизируют с образованием пористой губки, которую затем сшивают карбодиимидом или дегидротермическим способом.

Патент US №5116552 описывает способ получения губчатой коллагеновой матрицы без трещин. Кислый раствор коллагена замораживают при -40°C и лиофилизуют в губку. Затем губку инкубируют при 105 °С в течение 24 часов, а затем сшивают в течение 24 часов глутаровым альдегидом. Затем матрицу погружают в 15% спирт. После второй лиофилизации при более низкой температуре -80°С или -135°С получают губчатую матрицу без трещин.

Патент US № 5869080 описывает способ получения рассасывающегося материала для имплантата. Губчатую матрицу формируют путем добавления надлежащего количества спирта к дисперсии коллагена в гидроксиде натрия, предварительного замораживания ее при низкой температуре (около -5°C), добавления в дисперсию частиц льда, сшивания дисперсии гексаметилендиизоцианатами и последующей лиофилизации. Матрица, полученная таким способом, может содержать продукты гидролиза используемых для сшивки гексаметилендиизоцианатов.

В патенте RU № 2039766 С1 описан способ изготовления коллагеновой мембраны из шкур крупного рогатого скота, который подразумевает выделение коллагена с помощью уксусной кислоты и изготовления из него мембраны в формах. К недостаткам данного способа можно отнести, то, что структура получаемого материала может быть слишком рыхлой, неоднородной, толщина его не описывается, а так же остается вероятность остатка уксусной кислоты в изделии.

Запатентован способ RU № 2249462 С1 изготовления гетерогенного матрикса для имплантации из выделенного с помощью уксусной кислоты твердого коллагена птиц и жидкого коллагена рептилий и изготовленного на их основе конструкта. Несмотря на исследования свойств данного матрикса, в которых он продемонстрировал высокие показатели биосовместмости, не определяется его толщина, а также он не подразумевает создания монолитности изделия, что являлось бы преимуществом для удобства использования хирургами и в показателях прочности.

Описанный в патенте RU № 2532370 С2 способ для регенерации мягких тканей предлагает использовать многослойные мембраны из коллагенсодержащего тканевого сырья, ксеногенного происхождения, а также губчатый коллаген. Особенностью данной мембраны является, то, что она состоит из нескольких слоев, это требуется для того, что бы один слой был гладким и служил барьером росту ткани, а второй способствовал активной регенерации. Однако процесс изготовления такой мембраны весьма трудоемок, поскольку при формировании изделия требуется склеивание слоев.

Запатенован способ RU № 2683328 С2, предлагающий на этапе кислотной обработки коллагенодержащего сырья использование воздействия на материал угольной кислоты, полученной путем насыщения воды углекислым газом высокого давления (150-450 атм) при температуре 25-50°С в течение 12-48 часов, что требует специального оборудования.

Наиболее близким способом изготовления пористого коллагенового матрикса является способ, описанный в патенте US № 4412947, согласно которому чистый нерастворимый коллаген в виде частиц размером около 1 мм суспендируют в слабом водном растворе органической кислоты с последующим замораживанием при температуре от -60 до -70°C а затем лиофилизируют с образованием пористого коллагенового листа. Однако матрикс, полученный таким образом, не содержит поперечных сшивок частиц и поэтому не обладает достаточной прочностью при замачивании в питательных средах, необходимых для выращивания клеток.

Рассматриваемые способы предлагают использование коллагена, получаемого из шкур крупного рогатого скота, свиней, птицы, рептилий. Примеров получения матриксов с использованием коллагена, источником которого являются беспозвоночные животные, литературе не обнаружено.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 – фотография структуры коллагенового матрикса, выполненная при помощи сканирующего электронного микроскопа «QUANTA FEG 650»

Раскрытие изобретения

Технической задачей является создание способа получения пористого коллагенового матрикса на основе морского коллагена.

Исходным веществом для изготовления химически сшитого коллагенового матрикса является коллаген AKSOLAGEN marinum, выпускаемый компанией АКСЕС СВИСС РС и получаемый из глубоководного кальмара путем последовательного удаления из используемого сырья глобулярных белков, полисахаридов и липидов путем экстракции разбавленными водными растворами неорганических веществ с последующей сушкой. Используемое вещество является коллагеном I-III типа и представляет собой мелкодисперсный порошок с размером частиц 50-100 мкм.

Способ изготовления заключается в диспергировании коллагенового порошка в воде в присутствии органической кислоты (муравьиной, уксусной, взятой в количестве, необходимом для обеспечения рН 3-4) в качестве регулятора набухания, и выдерживании полученной суспензии в течение 10-12 ч. Содержание коллагена в полученной суспензии составляет 3% (масс.). Для обеспечения химической сшивки к набухшей массе, содержащей коллаген и органическую кислоту, добавляют глиоксаль в количестве 10 % от массы сухого коллагена. Для достижения эластичности готового матрикса в смесь вводят глицерин в количестве 30-50% от массы сухого коллагена и тщательно перемешивают.

Полученную смесь светло-желтого цвета разливают по формам слоем толщиной 10 мм, и подвергают лиофилизации, для чего ее сначала замораживают при -50 ^оС, затем высушивают в вакууме с остаточным давлением не выше 5 Па при температуре от -50 до -60 ^оС. Полученный пористый коллагеновый матрикс, представляющий собой губчатую гибкую мембрану толщиной около 2 мм, извлекают из формы, нарезают, упаковывают и стерилизуют.

Полученный матрикс имеет пористую структуру, подтвержденную методом электронной микроскопии при помощи сканирующего электронного микроскопа «QUANTA FEG 650» (Фиг.1).

Способ иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1.

Навеску сухого морского коллагена AKSOLAGEN marinum массой 1г диспергируют в 30 мл воды, добавляют 10 %-ный раствор муравьиной кислоты до рН 3, доводят массу смеси до 33,3 г прибавлением нескольких капель воды (чтобы обеспечить содержание коллагена в смеси по массе 3% в пересчете на сухое вещество), перемешивают и оставляют на 12 ч. Далее к смеси добавляют 0,1 г (10 % от массы сухого коллагена) глиоксаля и 0,5 г (50 % от массы сухого коллагена) глицерина. Смесь перемешивают, выливают в форму слоем толщиной 1 см и лиофилизируют. Получают пористый матрикс со средней толщиной 2,23 мм и средним диаметром пор 250 мкм.

Пример 2

Навеску сухого морского коллагена AKSOLAGEN marinum массой 1 г диспергируют в 30 мл воды, добавляют 10 %-ный раствор муравьиной кислоты до рН 3, доводят массу смеси до 33,3 г прибавлением нескольких капель воды (чтобы обеспечить содержание коллагена в смеси по массе 3% в пересчете на сухое вещество), перемешивают и оставляют на 10 ч. Далее к смеси добавляют 0,10 г (10 % от массы сухого коллагена) глиоксаля и 0,3 г (30 % от массы сухого коллагена) глицерина. Смесь перемешивают, выливают в форму слоем толщиной 1 см и лиофилизируют. Получают пористый матрикс толщиной 2,08мм и средним диаметром пор 270 мкм.

Пример 3 Определение прочностных характеристик получаемых матриксов

Некоторые прочностные характеристики полученных матриксов были исследованы с использованием универсального испытательного электромеханического стенда РЭМ-0.2-1.

Испытания проводились на матриксах на основе композиций морского коллагена, содержащих 10 % глиоксаля и 50 % глицерина от массы сухого коллагена в сравнении с готовыми матриксами на основе коллагена крупного рогатого скота (КРС). При этом все исследуемые образцы не имели грубых поверхностных дефектов.

Перед проведением испытания был произведен замер толщины всех экземпляров с помощью цифрового электронного микрометра iGaging®

0-1"/0.00005".

Исследуемые образцы закрепляли в тисках разрывной машины. Последние затягивают, стараясь обеспечить симметричное положение образца для равномерного распределения возникающего напряжения по площади его поперечного сечения, а также, чтобы не происходило скольжения образца при испытании, и он не разрушался в месте закрепления.

Испытание на деформацию проводят следующим образом: образец размещается на опорной поверхности машины так, чтобы его центр находился под центром индентора. К испытуемой поверхности прикладывают нагрузку и индентор погружают в образец со скоростью 35 мм/мин до деструкции образца. После проведения испытания толщину образцов замеряют с помощью микрометра. Результаты измерений представлены в табл.1.

Таблица 1

Характеристики физико-механических свойств коллагеновых матриксов Образец
матрикса Средняя толщина до испытания, мм Среднее уменьшение толщины матрикса, % Среднее значение F_max разрыва, Н Морской коллаген, содержащий глиоксаль 2,18 42,8 3,33 Матрикс из коллагена КРС 2,21 21,85 3,94

Заявляемый способ позволяет осуществить получение коллагеновых матриксов на основе сухого морского коллагена, выделенного из глубоководного кальмара, не уступающих по физико-механическим характеристикам матриксам, полученным из коллагена КРС.

Источники информации:

Патент US № 4193813A Method for making collagen sponge.

Патент US № 4522753A Method for preserving porosity in porous materials.

Патент US № 4970298A Biodegradable matrix and methods for producing same.

Патент US № 5116552 A Process for preparation of dried collagen sponge.

Патент US № 5869080A Absorbable implant materials having controlled porosity.

Патент RU № 2039766C1 Способ получения коллагеновой губки.

Патент RU № 2249462 С1 Универсальный гетерогенный коллагеновый матрикс для имплантации и способ его получения.

Патент RU № 2532370 С2 Способ и мембрана для регенерации ткани.

Патент RU № 2683328 С2 Способ изготовления 3D коллагенового матрикса.

Патент US № 4,412,947 Collagen sponge.

Изобретение относится к области химии и медицины, а именно к способу изготовления пористого коллагенового матрикса на основе сухого коллагена, отличающемуся тем, что в качестве сырья используют морской коллаген AKSOLAGEN marinum, который подвергают набуханию в растворе органической кислоты, выбранной из муравьиной и уксусной при рН 3-4 в течение 10-12 ч, с последующим добавлением к полученной дисперсии глиоксаля в количестве 10% масс. от массы сухого коллагена и глицерина в количестве 30-50% масс. от массы сухого коллагена, далее полученную суспензию подвергают замораживанию при температуре -50°С, лиофилизации при температуре от -50 до -60°С и остаточном давлении 5 Па и последующей стерилизации. Технический результат заключается в получении коллагеновых матриксов на основе сухого морского коллагена, выделенного из глубоководного кальмара. 1 ил., 1 табл., 3 пр.

Способ изготовления пористого коллагенового матрикса на основе сухого коллагена, отличающийся тем, что в качестве сырья используют морской коллаген AKSOLAGEN marinum, который подвергают набуханию в растворе органической кислоты, выбранной из муравьиной и уксусной при рН 3-4 в течение 10-12 ч, с последующим добавлением к полученной дисперсии глиоксаля в количестве 10% масс. от массы сухого коллагена и глицерина в количестве 30-50% масс. от массы сухого коллагена, далее полученную суспензию подвергают замораживанию при температуре -50°С, лиофилизации при температуре от -50 до -60°С и остаточном давлении 5 Па и последующей стерилизации.