Способ получения пористого коллагенового матрикса на основе морского коллагена с использованием глутарового альдегида Российский патент 2024 года по МПК C07K14/78 C08K5/07 A61L27/24 A61L27/56 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к способам получения биомедицинских материалов, а именно, к способам получения биодеградируемых матриксов, способных выступать субстратом и каркасом для регенерации поврежденных тканей, в том числе, за счет культивирования тканеспецифических клеток.

Описание уровня техники

Такие материалы должны быть биосовместимыми, не обладали иммуногенными, токсическими и аллергогенными свойствами, имели пористую структуру, обеспечивающую адгезию и пролиферацию клеток. Наиболее широкое применение в медицине для этих целей нашел коллаген, выступающий основным структурным белком соединительной ткани и обладающий слабыми антигенными и кровоостанавливающими свойствами.

В основном рассматриваемые способы предполагают использование коллагена, получаемого из шкур крупного рогатого скота, свиней, птицы, рептилий (патенты US № 4193813, US № 4970298, US № 4522753, US №5116552, US №5869080, RU № 2039766 С1).

Наиболее близким способом изготовления пористого коллагенового матрикса является способ, описанный в заявке на изобретение № 2023110131/04(021564) от 20.04.2023 г. согласно которому сухой морской коллаген AKSOLAGEN marinum подвергают набуханию в растворе органической кислоты, выбранной из муравьиной и уксусной при рН 3-4 в течение 10-12 ч, с последующим добавлением к полученной дисперсии глиоксаля в количестве 10 % масс. от массы сухого коллагена и глицерина в количестве 30-50 % масс. от массы сухого коллагена, далее полученную суспензию подвергают замораживанию при температуре -50 °С, лиофилизации при температуре от -50 до -60 °С и остаточном давлении 5 Па и последующей стерилизации. Однако матрикс, полученный таким образом, по ряду прочностных характеристик (уменьшение толщины матрикса, разрывная нагрузка) уступает матриксу, полученному из коллагена КРС.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 – фотография структуры коллагенового матрикса, выполненная при помощи сканирующего электронного микроскопа «QUANTA FEG 650».

Раскрытие изобретения

Технической задачей является создание способа получения пористого коллагенового матрикса на основе морского коллагена с использованием в качестве кросс-линкера глутарового альдегида.

Исходным веществом для изготовления химически сшитого коллагенового матрикса является коллаген AKSOLAGEN marinum, выпускаемый компанией АКСЕС СВИСС РС и получаемый из кожи глубоководного кальмара путем последовательного удаления из используемого сырья глобулярных белков, полисахаридов и липидов путем экстракции разбавленными водными растворами неорганических веществ с последующей сушкой. Используемое вещество является коллагеном I-III типа и представляет собой мелкодисперсный порошок с размером частиц 50-100 мкм.

Способ изготовления заключается в диспергировании коллагенового порошка в воде в присутствии органической кислоты (муравьиной, уксусной, взятой в количестве, необходимом для обеспечения рН 3-4) в качестве регулятора набухания, и выдерживании полученной суспензии в течение 10-12 ч. Содержание коллагена в полученной суспензии составляет 3% (масс.). Для обеспечения химической сшивки к набухшей массе, содержащей коллаген и органическую кислоту, добавляют глутаровый альдегид или глиоксаль в количестве 10% от массы сухого коллагена. Для достижения эластичности готового матрикса в смесь вводят глицерин в количестве 30-50% от массы сухого коллагена и тщательно перемешивают.

Полученную смесь светло-желтого цвета разливают по формам слоем толщиной 10 мм, и подвергают лиофилизации, для чего ее сначала замораживают при -50 °С в течение 6 ч, затем высушивают в вакууме с остаточным давлением не выше 5 Па при температуре от -50 до -60 °С. Полученный пористый коллагеновый матрикс, представляющий собой губчатую гибкую мембрану толщиной около 2 мм, извлекают из формы, нарезают, упаковывают и стерилизуют.

Полученный матрикс имеет пористую структуру, менее рыхлую, по сравнению с аналогичным матриксом на основе глиоксаля (средний размер пор при использовании глиоксаля составляет 250-270 мкм, а при использовании глутарового альдегида – 140 мкм), подтвержденную методом электронной микроскопии при помощи сканирующего электронного микроскопа «QUANTA FEG 650» (Фиг.1).

Способ иллюстрируется следующими примерами.

ПРИМЕР 1

Навеску сухого морского коллагена AKSOLAGEN marinum массой 1г диспергируют в 30 мл воды, добавляют 10 %-ный раствор муравьиной кислоты до рН 3, доводят массу смеси до 33,3 г прибавлением нескольких капель воды (чтобы обеспечить содержание коллагена в смеси по массе 3% в пересчете на сухое вещество), перемешивают и оставляют на 12 ч. Далее к смеси добавляют 0,1 г (10 % от массы сухого коллагена) глутарового альдегида и 0,5 г (50 % от массы сухого коллагена) глицерина. Смесь перемешивают, выливают в форму слоем толщиной 1 см и лиофилизируют. Получают пористый матрикс со средней толщиной 2,23 мм и средним диаметром пор 140 мкм.

ПРИМЕР 2

Определение прочностных характеристик получаемых матриксов

Некоторые прочностные характеристики полученных матриксов были исследованы с использованием универсального испытательного электромеханического стенда РЭМ-0.2-1.

Испытания проводились на матриксах на основе композиций морского коллагена, содержащих 10 % глутарового альдегида или 10 % глиоксаля от массы сухого коллагена в сравнении с готовыми матриксами на основе коллагена крупного рогатого скота. При этом все исследуемые образцы не имели грубых поверхностных дефектов.

Перед проведением испытания был произведен замер толщины всех экземпляров с помощью цифрового электронного микрометра iGaging® 0-1"/0.00005".

Исследуемые образцы закрепляли в тисках разрывной машины. Последние затягивают, стараясь обеспечить симметричное положение образца для равномерного распределения возникающего напряжения по площади его поперечного сечения, а также чтобы не происходило скольжения образца при испытании, и он не разрушался в месте закрепления. Расстояние между зажимами испытательной машины соответствует минимально допустимой длине медицинских изделий.

Испытание на деформацию проводили следующим образом: образец размещали на опорной поверхности машины так, чтобы его центр находился под центром индентора. К испытуемой поверхности прикладывали нагрузку и индентор погружали в образец со скоростью 35 мм/мин до деструкции образца. После проведения испытания толщину образцов замеряли с помощью микрометра.

Таблица

Характеристики физико-механических свойств коллагеновых матриксов Образец
матрикса Средняя толщина до испытания, мм Среднее уменьшение толщины матрикса, % Среднее значение F_max разрыва, Н Морской коллаген, содержащий глутаровый альдегид 2,23 22,23 3,91 Морской коллаген, содержащий глиоксаль 2,18 42,8 3,33 Матрикс из коллагена КРС 2,21 21,85 3,94

Заявляемый способ позволяет осуществить получение коллагеновых матриксов на основе сухого морского коллагена, выделенного из глубоководного кальмара, не уступающих по физико-механическим характеристикам матриксам, полученным из коллагена КРС.

Источники информации

Патент US № 4193813 A, Method for making collagen sponge.

Патент US № 4522753 A, Method for preserving porosity in porous materials.

Патент US № 4970298 A, Biodegradable matrix and methods for producing same.

Патент US № 5116552 A, Process for preparation of dried collagen sponge.

Патент US № 5869080 A Absorbable implant materials having controlled porosity.

Патент RU № 2039766 C1, Способ получения коллагеновой губки.

Патент RU № 2808686 C1, Способ получения коллагенового матрикса.

Изобретение относится к способу получения биомедицинского материала, а именно к способу изготовления коллагенового матрикса на основе сухого морского коллагена. Способ изготовления коллагенового матрикса на основе сухого морского коллагена AKSOLAGEN marinum, включающий набухание сырья в растворе органической кислоты, выбранной из муравьиной и уксусной при рН 3-4 в течение 10-12 ч, с последующим добавлением глутарового альдегида в количестве 10 % от массы сухого коллагена и глицерина в количестве 30-50 % от массы сухого коллагена, замораживание при температуре -50 °С, лиофилизацию при температуре от -50 до -60 °С и последующую стерилизацию. Вышеописанный способ позволяет получить коллагеновый матрикс, не уступающий по физико-механическим характеристикам матриксам, полученным из коллагена КРС. Полученный матрикс имеет пористую структуру, менее рыхлую, со средним размером пор 140 мкм. 1 ил., 1 табл., 2 пр.

Способ изготовления коллагенового матрикса на основе сухого морского коллагена AKSOLAGEN marinum, включающий набухание сырья в растворе органической кислоты, выбранной из муравьиной и уксусной при рН 3-4 в течение 10-12 ч, с последующим добавлением глутарового альдегида в количестве 10 % от массы сухого коллагена и глицерина в количестве 30-50 % от массы сухого коллагена, замораживание при температуре -50 °С, лиофилизацию при температуре от -50 до -60 °С и последующую стерилизацию.